Reaccin en cadena de la polimerasa

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR
obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls
(polymerase chain reaction, es una tcnica de biolog!a molecular desarrollada en "#$%
por &ar' (ullis,
"
cu'o objetivo es obtener un gran n)mero de copias de un fragmento
de *+, particular, partiendo de un m!nimo- en teor!a basta partir de una )nica copia de
ese fragmento original, o molde.
.sta tcnica sirve para amplificar un fragmento de *+,- su utilidad es que tras la
amplificaci/n resulta muc0o m1s f1cil identificar con una mu' alta probabilidad, virus o
bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cad1veres o 0acer
investigaci/n cient!fica sobre el *+, amplificado. .stos usos derivados de la
amplificaci/n 0an 0ec0o que se convierta en una tcnica mu' e2tendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
ndice
" 3undamento e importancia
4 Reactivos
5 Conceptos de la PCR
6 Ciclo de amplificaci/n
o 6." 7nicio
o 6.4 +esnaturali8aci/n
o 6.5 *lineamiento o uni/n del cebador
o 6.6 .2tensi/n o elongaci/n de la cadena
o 6.9 .longaci/n final
o 6.% Conservaci/n
9 :ptimi8aci/n de la PCR
% ;ipos de PCR
o %." PCR anidada
o %.4 PCR de e2tensi/n solapada ((utagnesis
o %.5 PCR in situ
o %.6 PCR m)ltiple
o %.9 PCR con transcriptasa inversa (R;<PCR
o %.% PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR
o %.= >ariaciones de la PCR b1sica
= *plicaciones
o =." 7nvestigaci/n
o =.4 (edicina
o =.5 Paleontolog!a, antropolog!a biol/gica, ' ciencias forenses
o =.6 *gronom!a ' diversidad
$ ?istoria
o $." Guerras de patentes
# >ase tambin
"@ Referencias
"" Aibliograf!a
"4 .nlaces e2ternos
Fundamento e importancia
.sta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los *+, polimerasas para
replicar 0ebras de *+,, para lo cual se emplean ciclos de altas ' bajas temperaturas
alternadas para separar las 0ebras de *+, recin formadas entre s! tras cada fase de
replicaci/n ', a continuaci/n, dejar que las 0ebras de *+, vuelvan a unirse para poder
duplicarlas nuevamente. La reacci/n en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por
&ar' (ullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la dcada de "#$@.
7nicialmente la tcnica era lenta, 'a que las polimerasas se desnaturali8aban al reali8ar
los cambios de temperatura ' era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (#9 BC en las fases de desnaturali8aci/n del *+,
suponen la inmediata desnaturali8aci/n de toda prote!na, se emplean *+, polimerasas
termoestables, e2tra!das de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas,
restrictivas para la ma'or!a de los seres vivos. +ic0os microorganismos, generalmente
arqueas, sonC Thermus aquaticus (polimerasa ;aq, Pyrococcus furiosus (Pfu,
Thermococcus litoralis (>ent ' Thermus thermophilus (;t0. Generalmente se emplean
me8clas de polimerasas mu' procesivas (;aq con otras capaces de 0acer correcci/n de
errores (Pfu, >ent.
;ermocicladorC aparato en el que se efect)a la PCR convencional.
?o', todo el proceso de la PCR est1 automati8ado mediante un aparato llamado
termociclador, que permite calentar ' enfriar los tubos de reacci/n para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacci/n. (uc0os termocicladores
modernos 0acen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una
pared mu' fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se
alcance r1pidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un
sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensaci/n sobre los tubos
de reacci/n. Los termocicladores m1s antiguos carec!an de este sistema ' solucionaban
el problema de la condensaci/n con una capa de aceite en la parte superior de la me8cla
de reacci/n o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica com)n ' normalmente indispensable en
laboratorios de investigaci/n mdica ' biol/gica para una gran variedad de aplicaciones.
.ntre ellas se inclu'en la clonaci/n de *+, para la secuenciaci/n, la filogenia basada
en *+,, el an1lisis funcional de genes, el diagn/stico de trastornos 0ereditarios, la
identificaci/n de 0uellas genticas (usada en tcnicas forenses ' test de paternidad ' la
detecci/n ' diagn/stico de enfermedades infecciosas.
Reactivos
;ubos de PCR que albergan la me8cla en un volumen total de "@@ DL.
Para reali8ar la tcnica se necesitanC
4
Los 6 deso2irribonucle/tidos<trifosfato (d,;P, sustratos para polimeri8ar
nuevo *+,.
+os cebadores o iniciadores (en ingls, primers, oligonucle/tidos que son, cada
uno, complementarios a una de las dos 0ebras del *+,. Eon secuencias cortas,
de entre seis ' cuarenta nucle/tidos, normalmente de diecioc0o a veintid/s, que
permiten que la polimerasa inicie la reacci/n. +eben estar enfrentados ' a no
muc0a distancia. +elimitan la 8ona de *+, a amplificar, es decir, corresponden
a los nucle/tidos que definen los e2tremos de la secuencia que se desea replicar.
7ones divalentes. Ee suele usar magnesio ((g
4F
, agregado com)nmente como
cloruro de magnesio ((gCl
4
, o alg)n otro cati/n divalente. ;ambin se puede
emplear manganeso ((n
4F
, para mutagnesis de *+, mediante PCR, 'a que
altas concentraciones de (n
4F
incrementan la tasa de error durante la s!ntesis de
*+,. *ct)an como cofactores de la polimerasa.
7ones monovalentes, como el potasio.
Gna soluci/n tamp/n o buffer que mantiene el p? adecuado para el
funcionamiento de la *+, polimerasa.
*+, polimerasa o me8cla de distintas polimerasas con temperatura /ptima
alrededor de =@ BC (la m1s com)n es la polimerasa ;aq.
*+, molde, que contiene la regi/n de *+, que se va a amplificar.
;ermociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de
las etapas que conforman un ciclo.
Conceptos de la PCR
Sensibilidad: se refiere a la cantidad m!nima de *+, necesaria para que se
produ8ca la amplificaci/n, es decir, para obtener una banda. Ee relaciona con los
falsos negativos, 'a que puede que una muestra sea positivas pero sea dada
como negativa porque no se 0a amplificado por no tener suficiente cantidad de
*+,.
Especificidad: se refiere a la obtenci/n de un solo producto amplificado. >iene
determinada por los oligos ' la especificidad con la que se unen al *+, molde.
+e esta forma, si los oligos tienen m1s de un sitio al que se pueden unir
aparecer1 m1s de un producto amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificaci/n m12ima que se puede obtener en un
n)mero determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la *+, polimerasa durante la
amplificaci/n. .ste concepto es de especial importancia en la secuenciaci/n,
pero en otros casos no es tan importante. Gna buena fidelidad permite evitar
falsos positivos 'Ho negativos.
Ciclo de amplificacin
.squema general de la PCR.
Grado de amplificaci/n seg)n el n)mero de ciclos empleados. AC gel de agarosa ("C
ladder, 4C producto espec!fico, 5C producto inespec!fico- B concentraci/n de *+,
respecto del tiempo- C logaritmo de la concentraci/n de *+, respecto del tiempo.
.l proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 4@ a 59 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos- cada ciclo suele consistir en 4<5 pasos a diferentes
temperaturas. La PCR com)n se reali8a con ciclos que tienen tres pasos de temperatura.
Los pasos de ciclos a menudo est1n precedidos por un c0oque trmico (llamado I0oldI
a alta temperatura (J #@ BC, ' seguido por otro 0old al final del proceso para la
e2tensi/n de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas ' el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de par1metros. Kstos inclu'en la
en8ima usada para la s!ntesis de *+,, la concentraci/n de iones divalentes ' de los
d,;P en la reacci/n, ' la temperatura de uni/n de los cebadores, as! como la longitud
del *+, que se desea amplificar.
4
*ctualmente, casi todos los termocicladores dan la opci/n de reali8ar la reacci/n de
PCR con la llamada I tapa calienteI. .s decir, que el sistema del termociclador aplicar1
calor a la parte de arriba del vial que contiene la me8cla de PCR. *l comien8o, los
laboratorios que empe8aron a usar los primeros aparatos que se comerciali8aron ' que
no inclu!an este sistema ten!an que poner unas gotas de aceite dentro del vial. .l
objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la
condensaci/n de la muestra, 'a que en el eppendorf se encuentran dos fasesCl!quido '
gas. *l condensarse la muestra, perdemos volumen de la me8cla. Ein embargo,
calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso f!sico,
conservando casi intacto el volumen de la muestra.
Inicio
.ste paso consiste en llevar la reacci/n 0asta una temperatura de #6<#% BC (/ #$ BC si se
est1 usando una polimerasa termoestable e2trema, que se mantiene durante "<#
minutos. .sto s/lo es necesario para *+, polimerasas que requieran activaci/n por
calor.
Desnaturaliacin
.n primer lugar, se desnaturali8a el *+, (se separan las dos cadenas de las cuales est1
constituido. .ste paso puede reali8arse de diferentes modos, siendo el calentamiento
(#6<#9 BC de la muestra la forma m1s 0abitual. La temperatura a la cual se decide
reali8ar la desnaturali8aci/n depende, por ejemplo, de la proporci/n de GFC que tenga
la cadena, como tambin del largo de la misma. :tros mtodos, raramente empleados en
la tcnica de la PCR, ser!an la adici/n de sales o agentes qu!micos capaces de reali8ar la
desnaturali8aci/n.
Alineamiento o unin del cebador
* continuaci/n se producir1 la 0ibridaci/n del cebador, es decir, el cebador se unir1 a su
secuencia complementaria en el *+, molde. Para ello es necesario bajar la temperatura
a 6@<%$ BC durante 4@<6@ segundos (seg)n el caso, permitiendo as! el alineamiento.
Los puentes de 0idr/geno estables entre las cadenas de *+, (uni/n *+,<*+, s/lo se
forman cuando la secuencia del cebador es mu' similar a la secuencia del *+, molde.
La polimerasa une el 0!brido de la cadena molde ' el cebador, ' empie8a a sinteti8ar
*+,. Los cebadores actuar1n como l!mites de la regi/n de la molcula que va a ser
amplificada.
E!tensin o elon"acin de la cadena
*ct)a la *+, polimerasa, tomando el *+, molde para sinteti8ar la cadena
complementaria ' partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la s!ntesis
de nuevo *+,. La polimerasa sinteti8a una nueva 0ebra de *+, complementaria a la
0ebra molde aadiendo los d,;P complementarios en direcci/n 9LM 5L, uniendo el
grupo 9L<fosfato de los d,;P con el grupo 5L<0idro2ilo del final de la 0ebra de *+,
creciente (la cual se e2tiende. La temperatura para este paso depende del *+,
polimerasa que usemos. Para la polimerasa ;aq, la temperatura de m12ima actividad
est1 en =9<$@ BC (com)nmente =4 BC. .l tiempo de e2tensi/n depende tanto de el *+,
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de *+, que se va a amplificar.
?a' una regla com)nmente usadaC en su temperatura /ptima, la polimerasa de *+,
polimeri8ar1 mil bases en un minuto.
Elon"acin final
.tapa )nica que se lleva a cabo a una temperatura de =@<=6 BC durante 9<"9 minutos
tras el )ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier *+, de cadena simple
restante sea totalmente ampliado.
Conservacin
.ste es un paso que se lleva a cabo a 6<"9 BC durante un tiempo indefinido para
conservar la reacci/n a corto pla8o.
La PCR normalmente se reali8a con un volumen de reacci/n de "9<"@@ DL, en pequeos
tubos de @.4<@.9 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR 0a generado el fragmento de *+, previsto, se emplean
tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de *+, generados de acuerdo a
su carga, esto es, longitud, ', en menor medida ' dependiendo de la matri8 empleada, a
su tamaoC t!picamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos
grandes- en acrilamida, para los m1s pequeos- ', de forma m1s r1pida ' aplicable a la
PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.
5
.lHlos tamaoHs de los
productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de *+,,
el cual contiene fragmentos de *+, de tamao conocido, ' que se corre en el gel junto
con los productos de PCR.
#ptimiacin de la PCR
.n la pr1ctica, la PCR puede fallar por varias ra8ones, entre ellasC
La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una m!nima
cantidad de *+, para obtener un gran n)mero de copias. *dem1s, puede ser
mu' propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de
esterilidad, que condu8can a la amplificaci/n de *+, no correspondiente a la
muestra a anali8ar (' por tanto a conclusiones inciertas. Ee 0an de tomar una
serie de precauciones para evitar la contaminacin con *+, e2trao. .jemplos
en los que es especialmente importante evitar la amplificaci/n son la detecci/n
de enfermedades (para no diagnosticar err/neamente a los pacientes o el
diagn/stico de identidad ' parentesco. Posibles precauciones sonC
o ;ener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificaci/nC
recogida, env!o, custodia ' procesado de muestras.
o Limpie8a e20austiva ' esterili8aci/n (lej!a, etanol, lu8 G>, psoralenos...
de la superficie de trabajo entre la reali8aci/n de una PCR ' la siguiente.
o .n laboratorios de diagn/stico gentico, se suelen tener 1reas separadas
de trabajoC un laboratorio para la preparaci/n de la me8cla madre para la
PCR, otro para la adici/n del *+, a amplificar, otro donde se encuentra
la maquinaria para reali8ar la PCR ' otro donde se abre ' anali8a la
muestra 'a amplificada.
o Cabinas de seguridad biol/gica para reducir vapores cargados de
amplicones de enfermedades.
o Protecci/n adecuada de los operarios que manipulen las muestras ' los
instrumentos del laboratorioC guantes, bata, cubre8apatos, gafas de
seguridad, pelo recogido... .n el diagn/stico molecular es conveniente
que se cambien estos elementos al pasar de una 8ona de trabajo a otra.
o Controles positivos ' negativos.
o ;ipado de todo el personal del laboratorio. .n el caso de encontrar una
amplificaci/n no esperada se podr1 comprobar si proviene de uno de los
operarios.
Las tcnicas de dise$o de cebadores son importantes en la mejora de la
obtenci/n de productos de PCR ' en evitar la formaci/n de productos falsos.
*lgunas consideraciones al disear estos cebadores sonC
o Ee recomienda usar primers de m1s de "9 nucle/tidos ("$<5@ nn
,ormalmente, se suelen disear de 4@ nucle/tidos. Los cebadores mu'
cortos 0acen que nuestra PCR no sea mu' espec!fica, ' los que se
e2cedan en longitud 0ar1n que perdamos rendimiento en la reacci/n.
o Los primers no deben diferir en m1s de 5 bases.
o La proporci/n entre bases p)ricas ' pirimid!nicas de los dos oligos sea
"C" (6@<%@N a lo sumo, ' que empiecen ' terminen con " / 4 bases
p)ricas.
o Ee requiere una distribuci/n 0omognea de los cuatro nucle/tidos en la
secuencia, evitando los poli;H*HGHC.
o La ;m (melting temperature de los oligos no puede diferir en m1s de
9 BC.
o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean
complementarias entre s!, o se formar1n d!meros entre ellos.
.2iste una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que
m1s se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades
ine2istentes en otras o las reali8an de forma m1s eficiente, o funcionan en
intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturali8an o pierden
funcionalidad. Las m1s 0abituales son la taq ' la pfu.
Los componentes del tampn de reaccin deber1n ajustarse a las e2igencias de
nuestras en8imas.
.l termociclador, por supuesto, debe ser capa8 de reproducir correctamente los
ciclos de la PCRC para ello, diversas casas comerciales nos ofrecer1n
termocicladores elaborados con materiales que 0agan m1s eficaces el desarrollo
' el transcurso de las etapas, adem1s de diversas facilidades de manejo. +entro
del laboratorio, su manejo, mantenimiento ' ubicaci/n ser1 clave.
*parte de aspectos como la contaminaci/n ' alg)n fallo en la 0ibridaci/n de primers,
puede 0aber otras comple%idades que afecten a la PCR, como sonC
De"radacin del AD&C esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en
condiciones sub/ptimas o cuando se 0ace una autopsia, por ejemplo, ' resulta en
ausencia de amplificaci/n o resultados parciales. Gn caso particular es el Iallele
dropoutI, o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser
0omocig/tico para dic0o alelo.
In'ibicin de la PCRC puede 0aber agentes que interfieran en el correcto
transcurso de la PCR. Requerir1 un procesamiento adicional de la muestra para
eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la me8cla de PCR. ;anto
la sangre como el semen contienen este tipo de in0ibidores, por lo que es
necesario una purificaci/n previa.
(odificacin del AD&C las sustancias como el formol (empleado en
conservaci/n de tejidos o la lu8 ultravioleta modifican el *+,, alterando as! los
resultados de la amplificaci/n.
ArtefactosC pueden darse situaciones como las bandas IstutterI o Is0adoOI, que
consisten en que la polimerasa amplifica una repetici/n de m1s de un
microsatlite o repetici/n en t1ndem.
Alelo fuera de patrnC un alelo amplificado puede no coincidir con el patr/n de
picos de la referencia. .sto es seal de que algo 0a ido mal durante la PCR.
(eclasC es posible que dos muestran se me8clen de alguna forma ' el resultado
sea una combinaci/n del patr/n de picos que cabe esperar tras la amplificaci/n
de cada una de ellas por separado. .sto ' el caso anterior dificulta la
interpretaci/n de los resultados.
)ipos de PCR
PCR anidada
;cnica mu' sensible de PCR en la que el producto de una amplificaci/n es utili8ado
como molde para reali8ar una segunda amplificaci/n con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer
amplic/n se pueden unir los cebadores ' se 0ace de nuevo una amplificaci/n dentro del
amplic/n inicial. .ste tipo de PCR tiene la venta%a de brindar alta sensibilidad '
especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificaci/n de un amplic/n
obtenido previamente, los cebadores s/lo van a 0ibridar en un sitio dentro de la
molcula ' el resultado ser1 una )nica banda. *s!, evitamos posibles 0ibridaciones
inespec!ficas de los cebadores. La desventa%a de esta tcnica es que no nos permite
cuantificar la muestra.
PCR de e!tensin solapada *(uta"+nesis,
Ee introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados de *+,. Ee
requieren 4 cebadores (primmers mutagnicos ' otros 4. Ee amplifica un fragmento 9L '
un fragmento 5L que se solapan portando ambos la mutaci/n. Ee usan los productos en
otra reacci/n para producir el *+, mutado de longitud completa
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reacci/n de PCR en secciones 0istol/gicas o clulas,
donde los productos generados pueden visuali8arse en el sitio de amplificaci/n. .s
reali8ada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. .n la tcnica de PCR in situ se
reali8a una primera amplificaci/n de *+, blanco ' luego detecci/n mediante
0ibridaci/n in situ convencional con sondas de *+,H*R,. +e esta manera pueden
detectarse cantidades peque!simas de genoma. .sta tecnolog!a es de gran alcance en la
capacidad de amplificar espec!ficamente una poblaci/n de secuencias de menor
representaci/n.
PCR m-ltiple
PCR en la cual se amplifica simult1neamente m1s de una secuencia. Para ello, se
combinan dos o m1s pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacci/n en cantidades suficientes, para amplificar simult1neamente
varios segmentos de *+,. .enta%asC informaci/n sobre varios locus en una sola
reacci/n, menor cantidad de molde para el an1lisis, menor cantidad de reactivos, r1pida
construcci/n de bases de datos. Desventa%asC para llevarla a cabo adecuadamente ' sin
errores, se requiere de una cuidadosa optimi8aci/n del proceso.
PCR con transcriptasa inversa *R)/PCR,
.s una variante de la PCR en la que usamos *R, como molde inicial en ve8 de *+,, '
emplea una transcriptasa inversa (como ;t0 para reali8ar la s!ntesis de un *+,
complementario al *R, (*+,c. +e esta forma, el desarrollo inicial de una R;<PCR
ser!aC
".
er
pasoC retrotranscripci/n a partir del *R,.
4P pasoC amplificaci/n a partir de la primera 0ebra de *+,c.
5.
er
pasoC PCR est1ndar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo *0PCR,
*rt!culo principalC PCR en tiempo real
Reacci/n de PCR cu'a principal caracter!stica es que permite cuantificar la cantidad de
*+, o *R, presente en la muestra original, o para identificar con una mu' alta
probabilidad, muestras de *+, espec!ficas a partir de su temperatura de fusi/n
(tambin denominado valor T
m
, del ingls melting temperature.
Ee puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no espec!ficos ' en las
tcnicas basadas en sondas espec!ficas.
.n las tcnicas basadas en fluorocromos el *+,, que ve multiplicada su cantidad con
cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente EQAR Green produciendo
fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite
cuantificar s/lo una secuencia por reacci/n pero tiene la venta%a de utili8ar cebadores
normales para su reali8aci/n. .s muc0o m1s econ/mica que la que usa sondas
espec!ficas.
Las tcnicas basadas en sondas espec!ficas utili8an una sonda unida a dos fluorocromos
que 0ibrida en la 8ona intermedia entre el cebador directo (forward ' el inverso
(reverse- cuando la sonda est1 intacta, presenta una transferencia energtica de
fluorescencia por resonancia (3R.;. +ic0a 3R.; no se produce cuando la sonda est1
daada ' los dos fluorocromos est1n distantes, producto de la actividad 9L<5L
e2onucleasa de la *+, polimerasa. .sto permite monitori8ar el cambio del patr/n de
fluorescencia ' deducir el nivel de amplificaci/n del gen.
La ma'or!a de estos inconvenientes se 0an solucionado con la introducci/n de la PCR
reali8ada en tiempo real (R<PCR, que elimina cualquier proceso post<PCR puesto que
monitori8a la progresi/n de la amplificaci/n en el momento en que ocurre. * diferencia
de la PCR convencional (en punto final, que mide la acumulaci/n del *+, al final de
un n)mero predeterminado de ciclos, con R<PCR esto se 0ace durante el proceso de
amplificaci/n usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la
cantidad de *+, formada. .l proceso se puede automati8ar f1cilmente usando un
sistema que realice la amplificaci/n (termociclador ' que a su ve8 sea capa8 de leer
fluorescencia. .2iste una amplia oferta de aparatos en el mercado. La ma'or!a pueden
trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente ' son IabiertosI, es decir,
permiten programar las condiciones de amplificaci/n ' lectura de forma que su uso no
queda limitado a unos reactivos determinados.
.ariaciones de la PCR b1sica
PCR espec2fica de aleloC esta tcnica de diagn/stico o clonaci/n es usada para
identificar o utili8ar los polimorfismos de una sola base (E,Ps.
PCR 3assembl43C consiste en la s!ntesis artificial de largas secuencias de *+,,
reali8ando para ello la PCR en un fondo de oligonucle/tidos largos con
secuencias solapantes cortas.
PCR asim+tricaC usada para amplificar preferentemente una cadena del *+,
original con respecto a la otra.
PCR de coloniaC mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli
pueden ser r1pidamente e2aminadas para construcciones viables de vectores de
*+,.
Amplificacin dependiente de 'elicasaC esta tcnica es mu' parecida a la PCR
convencional, pero en ella se emplea la en8ima 0elicasa ' una temperatura
constante en lugar de la polimerasa de *+, ' los ciclos repetidos de
0ibridaci/n<elongaci/n.
PCR 'ot/startC esta tcnica reduce la amplificaci/n inespec!fica durante las
etapas iniciales de la PCRC mientras que la m1quina alcan8a la temperatura de la
primera etapa (unos #9P puede que ocurra la uni/n de los cebadores ' se
produ8ca amplificaci/n, 'a que en el camino para alcan8ar estos #9P se pasa por
la temperatura de anillamiento (que es m1s baja.
Para evitar esto, la PCR 0ot<start se basa en que la reacci/n comience cuando la
m1quina 'a est a #9P, debido a que antes no se encuentran presentes la
polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias
tcnicasC
< *adir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento
< Eeparar por una capa de cera los distintos componentes de la reacci/n. La cera
se funde al alcan8ar los #9P ' es entonces cuando los componentes entran en
contacto
< *nticuerpos anti<polimerasa que estn bloqueando a la polimerasa. *l alcan8ar
los #9P estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturali8an ' la
polimerasa puede actuar
PCR espec2fica de intersecuencia *ISSR,C se trata de un mtodo de PCR para
su uso en 0uella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia
simple para producir una 0uella gentica )nica de longitudes de fragmento
amplificadas.
PCR inversaC es un mtodo usado para poder reali8ar la PCR cuando s/lo es
conocida una secuencia interna. (u' )til en la identificaci/n de secuencias que
flanquean insertos gen/micos.
PCR mediada por ligaci/nC este mtodo usa pequeos linSers de *+, ligados al
*+, de inters ' m)ltiples cebadores 0ibridando estos linSers.
PCR espec2fica de metilacin *(SP,C se usa para detectar metilaciones en islas
CpG de *+, gen/mico.
Amplificacin (-ltiple Dependiente de Sonda *(ultiple! 5i"ation/
dependent Probe Amplification o (5PA,C permite amplificar varias
secuencias objetivo con un )nico par de cebadores, evitando as! las limitaciones
de resoluci/n de la PCR multiple2.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. .n la
tcnica cl1sica de PCR, se cuantifica por apro2imaci/n con diluciones '
amplificaci/n de concentraciones conocidas de la secuencia diana. ;ambin se
puede cuantificar por m+todo competitivoC se trabaja con concentraciones
crecientes conocidas de un fragmento que puede ser amplificado por los mismos
oligos que la muestra de estudio, pero de menor tamao que sta, de forma que
con los resultados obtenidos se puede estimar qu concentraci/n del competidor
es equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificaci/n en
PCR est1 optimi8ada en la tcnica de PCR en tiempo real.
PCR/)AI5: la PCR termal de entrela8ado asimtrico es usada para aislar una
secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se
desconoce la secuencia e2acta de los e2tremos de la secuencia a amplificar, de
modo que se asume que puede e2istir alguna base desapareada en el
alineamiento cebador<secuencia. Eu finalidad es reducir el fondo no espec!fico
bajando gradualmente la temperatura de 0ibridaci/n a lo largo del progreso de la
PCR.
PA&/AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificaci/n, ' puede
ser usado en clulas vivas.
Ciclo t+rmico r1pido para PCR:
6
La amplificaci/n del +,* puede llevarse a
cabo r1pidamente, como completar 5@ ciclos en menos de 5@ minutosC ciclo
trmico rpido. ,ormalmente se 0a considerado que las etapas de cada ciclo son
tres reacciones que ocurren en tres periodos separados ' a tres temperaturas
diferentes. .ste paradigma del equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la
temperatura de la muestra no cambia instant1neamente, de 0ec0o, durante una
PCR la muestra est1 la ma'or!a del tiempo en temperaturas de transici/n. .l
ciclo trmico r1pido aprovec0a la ventaja de la instant1nea desnaturali8aci/n e
0ibridaci/n, cu'as temperaturas necesitan alcan8arse, pero no mantenerse.
*dem1s, para productos cortos, la e2tensi/n puede llevarse a cabo durante la
transici/n a la temperatura de e2tensi/n, ' por lo tanto, tampoco es necesario
mantenerla. Gn ciclo r1pido podr!a entonces describirse como #6PC, @ seg- 99PC,
@ seg ' =4PC, @ seg. Como vemos, este modelo no a'uda, porque nos lleva solo a
temperaturas e2tremas ' no nos da informaci/n sobre lo que pasa entre ellas. .n
cambio, en el paradigma cintico para PCR de ciclo r1pido se describe
completamente el 0istorial de temperaturas de la muestra. Ee considera que
desnaturali8aci/n, 0ibridaci/n ' elongaci/n ocurren en un rango de temperaturas
' adem1s pueden solapar temporalmente. ?a' termocicladores que permiten que
un ciclo se complete en 4@<%@ segundos, por lo que 5@ ciclos tardan de "@ a 5@
minutos.
Aplicaciones
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicacionesC 'a en ciencia b1sica, como
0erramienta de detecci/n 'Ho generaci/n de acervos de fragmentos de *+, de inters-
'a en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s! mismo, por ejemplo en
diagn/stico cl!nico.
Investi"acin
La PCR convencional, se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio
debido a su robuste8 ' rapide8. +e este modo, la PCR de punto final permite controlar '
detectar los fragmentos de *+, de inters.
Clonaci/n de un segmento de *+, mediante amplificaci/n con cebadores que
contienen una secuencia apta para la recombinaci/n dirigida con un pl1smido.
Gna aplicaci/n de la PCR de e2trema importancia es la clonaci/n de secuencias de
*+, en vectores, como pueden ser los pl1smidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su e2tremo 9L una corta secuencia que permite la interacci/n posterior con
otra complementaria situada en el vector de clonaci/n a emplear. Por ejemplo, se puede
incluir una diana de restricci/n en dic0os cebadores, de modo que, ' si sta no e2ist!a
previamente en el fragmento ' es )nica en el vector, pueda efectuarse una ligaci/n
mediante la ligasa de ;6 tras la digesti/n con la en8ima de restricci/n apropiada de
ambos elementos. :tro mtodo asimilable a esta v!a es el empleo de la recombinaci/n
dirigida- esto es, se adapta al 9L de los cebadores una secuencia que faculta a una
recombinasa la recombinaci/n dirigida con un vector dado.
9
(edicina
.n medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como 0erramienta de diagnosis
(Coleman ' ;songalis, 4@@%C
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro
infecciosoC para ello, se amplifica una 8ona del genoma bacteriano cu'o
producto de PCR posea unas caracter!sticas de tamao o temperatura de fusi/n
que permitan identificarlo de forma inequ!voca. .n el caso de infecciones virales
que implican la integraci/n del genoma del pat/geno en el *+, del 0ospedador,
como es el de la infecci/n por >7?, la PCR cuantitativa posibilita la
determinaci/n de la carga viral e2istente ' por tanto, del estadio de la
enfermedad.
%
La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los
servicios de donantes de sangre, para test de rutina. * travs de esta tcnica se
pueden detectar infecciones en el donante (como >7? o ?epatitis A mientras
a)n est1n en el periodo de incubaci/n. +ada la sensibilidad de los test de PCR se
pueden tomar muestras colectivas o IpoolsI (por ejemplo, #% pruebas
individuales. Ei una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir
de ella muestras progresivamente menores 0asta que se encuentra el causante.
.l diagn/stico de enfermedades 0ereditarias presentes en el genoma es un
proceso largo ' complicado que puede acortarse significativamente gracias a la
PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus
correspondientes cebadores ' posteriormente secuenciar para detectar la
e2istencia de mutaciones.
Paleontolo"2a6 antropolo"2a biol"ica6 4 ciencias forenses
Los campos de la paleontolog!a, antropolog!a biol/gica ' la medicina ' antropolog!a
forense se 0an visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas
constru'en con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a
restos o 0uellas de seres vivos. Gno de los materiales biol/gicos que m1s informaci/n
puede proporcionar es el *+,.
La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante
largos per!odos si las condiciones son propicias.
9
.n ocasiones las muestras intactas con
las que se puede contar son e2traordinariamente pequeas o est1n deterioradas. La PCR
soluciona ambos problemas ' proporciona cantidades )tiles para posteriores pasos de
an1lisis. .n primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de
muestras escasas, puesto que como 'a se dijo anteriormente, en teor!a basta una sola
molcula para que el proceso pueda tener lugar. ;ambin debido a la naturale8a de la
tcnica ' su prop/sito de amplificaci/n de fragmentos pequeos, esta fragmentaci/n no
impide que este *+, pueda ser empleado como molde para una reacci/n de PCR.
.n paleontolog!a ' *ntropolog!a la PCR permite recuperar las escasas
cantidades de *+, que a)n no se 0an degradado. *lgunos lugares en que el
*+, podr!a preservarse son la brea las ceni8as volc1nicas, el 1mbar, 0ielos
0ist/ricos polares o glaciares ' ambientes 1ridos, sedimentos, as! como en los
cristales de apatita de restos de esqueleto,
=
siendo posible de ese modo
caracteri8ar cad1veres, f/siles u otros restos mediante genotipado por an1lisis de
microsatlites o incluso genomas de ta2ones e2tintos, amplificados de este
modo, como pueden ser los reali8ados mediante el *+, gen/mico del 0ombre
de ,eandert0al.
$
.l prop/sito ser!a utili8ar este *+, amplificado para
posteriormente reali8ar estudios filogenticos o etnogr1ficos o de poblaciones
mediante la comparaci/n de secuencias de *+,, o el estudio de las causas de la
separaci/n evolutiva de dos especies.
.n las ciencias forenses se emplea para establecer la filiaci/n de una persona o
para obtener pruebas a partir de muestras m!nimas dejadas por el autor de un
crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos (Autler, 4@@9.
A"ronom2a 4 diversidad
;al ' como la PCR multiple2 permite producir 0uellas genticas de individuos
concretos, dentro del marco de la gentica forense, e2isten mtodos basados en la PCR
que permiten discernir entre grupos infraespec!ficos de cultivos de inters agron/mico-
por ejemplo, de cultivares.
#
Para ello, se emplean oligonucle/tidos de un tamao lo
suficientemente pequeo como para que ceben de forma relativamente inespec!fica,
aunque siempre de tal forma que produ8can un patr/n de bandas discreto e interpretable.
+e este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar
a los individuos de ma'or semejan8a, que poseen un comportamiento similar, de los que
divergen...
7istoria
.lectroforesis de prote!nas E+E<P*G. resolviendo la polimerasa ;aq.
.n "#=", un art!culo publicado por &leppe et al. en Journal of olecular !iology
describi/ por primera ve8 un mtodo que usaba en8imas para replicar una secuencia
pequea de *+, con cebadores in vitro.
"@
Ein embargo, este temprano ejemplo del
principio b1sico de la PCR no recibi/ muc0a atenci/n, ' la invenci/n de la reacci/n en
cadena de la polimerasa en "#$5 es generalmente atribuida a &ar' (ullis.
""

"4
(ullis
gan/ el Premio ,obel por su trabajo en PCR.
*lgo mu' a tener en cuenta en la PCR es que la *+, polimerasa que se use sea capa8
de soportar las altas temperaturas de J#@ BC necesarias para la separaci/n de las dos
0ebras de *+, de la doble 0lice tras cada ciclo de replicaci/n. Las *+, polimerasas
que se utili8aron originariamente para los e2perimentos in vitro previos a la PCR no
eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los primeros
procedimientos para replicar el *+, eran mu' ineficientes, largos ' requer!an grandes
cantidades de *+, polimerasa.
.l descubrimiento en "#=% de la polimerasa ;aq, una polimerasa de *+, e2tra!da de la
bacteria term/fila Thermus aquaticus que 0abita medios de mu' alta temperatura (9@<
$@ BC, elimin/ los grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. .ste *+,
polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa 0asta despus de la
desnaturali8aci/n del *+,, eliminando la necesidad de aadir a la reacci/n nueva
polimerasa tras cada ciclo. .ste descubrimiento permiti/ automati8ar el proceso, antes
tan tedioso, acopl1ndolo al uso del termociclador.
*l mismo tiempo que desarrollaba la PCR en "#$5, (ullis trabajaba en .mer'ville,
California (.. GG, para una de las primeras empresas biotecnol/gicas, Cetus
Corporation, donde era responsable de sinteti8ar cadenas cortas de *+,. (ullis afirma
que concibi/ la idea para la PCR una noc0e mientras cru8aba la *utopista de la Costa
Pac!fica (.. GG en su coc0e.
""
.staba imaginando una nueva forma de anali8ar
mutaciones en el *+, cuando se percat/ de que, en lugar de eso, 0ab!a inventado un
mtodo para amplificar regiones espec!ficas de *+, mediante ciclos de duplicaci/n
repetidos usando *+, polimerasas. (ullis atribu'e la invenci/n de esta tcnica a los
efectos de la droga psicodlica ' alucin/gena LE+.
"5
.n la revista "cientific #merican, (ullis resumi/ el procedimientoC IComen8ando con
una )nica molcula del material gentico *+,, la PCR puede generar "@@ billones de
molculas iguales en una tarde. La reacci/n es f1cil de 0acer, no requiere m1s que un
tubo de pruebas, unos pocos reactivos simples ' una fuente de calor.I
"6
3ue premiado
con el Premio ,obel de Ru!mica en "##5 por su invenci/n, ' siete aos despus, l '
sus colegas del Cetus llevaron a la pr1ctica su propuesta. Ein embargo, 0an aparecido
controversias ' diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales ' pr1cticas de
otros cient!ficos al trabajo de (ullis, ' sobre si l fue el inventor )nico del principio de
la PCR.
8uerras de patentes
La tcnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde (ullis trabajaba
cuando invent/ la tcnica en "#$5. La en8ima polimerasa ;aq fue tambin cubierta de
patentes. ;uvieron lugar varios pleitos relacionados con la tcnica, inclu'endo un pleito
fracasado generado por +uPont. La compa!a farmacutica ?offmann<La Roc0e
adquiri/ los derec0os de las patentes en "##4 ' actualmente mantiene las que a)n est1n
protegidas.
"
Rendimiento del m+todo de e!traccin
con de!trano salino en la prueba de la
anti"enemia pp9: frente al
citome"alovirus 'umano
Efficienc4 of saline de!tran e!traction met'od in t'e 'uman
c4tome"alovirus pp9: anti"enemia assa4
Tordi Reina
a
, 3rancisca Aallesteros
a
, (abel Galmes
a
, (argarita (ari
a
, (ar!a (unar
a
a
Gnidad de >irolog!a. Eervicio de (icrobiolog!a Cl!nica. ?ospital Gniversitario Eon
+ureta. Palma de (allorca.
Palabras Clave
citome"alovirus6 de!trano salino6 anti"enemia pp9:;
<e4=ords
C4tome"alovirus6 saline De!tran6 pp9: anti"enemia;
Resumen
3undamento. .valuar de forma prospectiva la eficacia del mtodo de e2tracci/n con
de2trano salino en la prueba de la antigenemia pp%9 (*g<pp%9 frente al
citomegalovirus 0umano (C(>.
(aterial ' mtodos. +urante un per!odo de dos meses se 0an anali8ado las muestras de
sangre procedentes de pacientes inmunodeprimidos. La e2tracci/n de los leucocitos
polimorfonucleares (LP(, se reali8a con una soluci/n de de2trano al %N en cloruro
de sodio al @,#N. Ee reali8/ el recuento total de leucocitos obtenidos ' el porcentaje
correspondiente a los LP(,. Eimult1neamente se reali8/ el cultivo de los LP(,
e2traidos por el mtodo de shell vial (CE> en la l!nea (RC<9.
Resultados. Las "66 muestras de sangre anali8adas se 0an dividido en tres grupos seg)n
la positividad en la prueba de la *g<pp%9 'Ho el CE>. Los pacientes con ambas pruebas
positivas presentaron el menor recuento global de leucocitos ' de LP(,, mostrando
significaci/n estad!stica con el grupo de *g<pp%9 negativa. ,o se 0an observado
diferencias en el recuento global de los grupos con *g<pp%9 negativa. .l porcentaje
global de LP(, obtenidos fue del $=N. .l valor medio de las muestras *g<pp%9
positivas fue de 6$H"@@.@@@. LP(,, que ser!a de 9"H"@@.@@@ LP(, si se corrigiera en
funci/n del porcentaje real de LP(, (pJ@,@9.
Conclusiones. .l mtodo de e2tracci/n leucocitario con de2trano salino 0a mostrado un
elevado rendimiento en la ma'or!a de las muestras anali8adas. .l estado inmunol/gico
del paciente ' la presencia de infecci/n 'Ho enfermedad por C(> determinan el grado
de rendimiento de este mtodo. .n general no es necesario ajustar el valor de la *g<
pp%9 en funci/n del porcentaje real de LP(, obtenidos.
Art2culo
Citomegalovirus (C(> constitu'e en la actualidad el principal virus causante de
infecciones v!ricas en los pacientes inmunodeprimidos (transplantados e infectdos por el
virus de inmunodeficiencia 0umana U>7?V. La elevada morbimortalidad asociada a este
tipo de enfermedad, muc0o m1s importante si es una primoinfecci/n, obliga a reali8ar
un seguimiento estricto ' controlado de esta infecci/n en este grupo de pacientes
",4
.
+e las diferentes tcnicas e2istentes en la actualidad, la antigenemia pp%9 (*g<pp%9 o
detecci/n de este ant!geno en el n)cleo de los leucocitos polimorfonucleares (LP(, '
el cultivo shellvial (CE> parecen ser las que presentan una ma'or correlaci/n ' valor
predictivo positivo en el desarrollo posterior de enfermedad por C(>
5,6
.
Para la reali8aci/n de la prueba de la *g<pp%9 es preciso, primeramente, reali8ar el
fraccionamiento de la sangre perifrica ' e2traer la poblaci/n correspondiente a los
LP(,, sobre la que se reali8a posteriormente la detecci/n antignica
9,%
.
+e los diferentes mtodos de e2tracci/n o fraccionamiento sangu!neo anali8ados, parece
que el empleo de una soluci/n al %N de de2trano salino es el que determina un ma'or '
mejor rendimiento en este proceso de e2tracci/n, estando adem1s al alcance de
cualquier laboratorio
9<=
. .l empleo de este mtodo no siempre consigue la e2tracci/n del
"@@N de los LP(,, 'a que depende b1sicamente tanto de la propia tcnica
(e2periencia, eficacia, pulcritud como del estado inmunol/gico del paciente (inefica8
en los neutropnicos o con dficits de inmunidad celular
=,$
.
.l objeto de este estudio prospectivo es conocer el rendimiento real de este mtodo de
e2tracci/n leucocitario en la sangre de pacientes en diferentes situaciones cl!nicas.
(aterial 4 m+todos
+urante un per!odo de dos meses se 0an estudiado de forma prospectiva las muestras de
sangre remitidas para la prueba de la *g<pp%9 ' viremia procedentes de pacientes
infectados por el >7? ' los receptores de trasplante renal ' mdula /sea.
Cada muestra de sangre perifrica recogida en un tubo con .+;* (5<9 ml se me8cl/
con " ml de una soluci/n de2trano salino al %N $%e&tranorm "alino !raun' ' se dej/
sedimentar a 5%BC en la estufa durante 5@<69 minutos. Posteriormente se recogi/ " ml
de la parte superior del tubo con una pipeta estril ' se pas/ a un tubo estril. Ee
aadieron 6 ml de tamp/n fosfato salino (PAE, p? =,4 ' se centrifugaron a ".9@@ rpm
durante "9 minutos. Ee resuspendi/ el sedimento en 6 ml de PAE ' se aadi/ " ml de
cloruro de amonio que se dej/ actuar durante 4 a 5 minutos. ;ras este proceso se
decant/ ' resuspendi/ el sedimento en 4 ml de PAE que se centrifugaron a ".9@@ rpm
durante "9 minutos. 3inalmente el sedimento se resuspendi/ en " ml de PAE.
.l recuento leucocitario se reali8/ en un autoanali8ador E'sme2 &<69@@ $!oehringer
annheim( *lemania, ajust1ndose posteriormente la concentraci/n final para la
adici/n a un porta de 4@@.@@@ LP(,. .l volumen adecuado se centrifug/ en una
citocentrifuga (C'tospin 5- "handon "cientific( 7nglaterra a =@@ rpm durante "@
minutos.
Los portas, tras su fijaci/n con formalde0!do<sacarosa, se tieron con un anticuerpo
monoclonal anti<pp%9 $onofluo)it C*( Pateur %iagnostics' mediante una tcnica de
inmunofluorescencia indirecta. Los portas fueron observados al microscopio de
fluorescencia a 6@@2. Los valores de antigenemia se 0an e2presado en el n)mero de
LP(, positivos (con fluorescenciaH"@@.@@@ LP(, observados.
La misma muestra de sangre utili8ada para la *g<pp%9 fue tambin empleada para el
cultivo v!rico (viremia, mediante el mtodo de CE>, a partir de los LP(, e2traidos
previamente siguiendo la tcnica 'a descrita con anterioridad
5,6
.
Resultados 4 discusin
+urante el per!odo de estudio se 0an anali8ado "66 muestras de sangre. Las muestras se
0an dividido en tres grupos dependiendo de su positividad en la prueba de la *g<pp%9 '
de la viremia (CE> (tabla ".
.n los pacientes con antigenemia ' CE> positivos se 0a obtenido el menor recuento de
LP(, tras la e2tracci/n, observ1ndose diferencia significativa con el grupo de
pacientes con antigenemia negativa (pW@,@9. ,o se 0a observado diferencia en el
rendimiento global del proceso de e2tracci/n entre las muestras que eran antigenemia
negativa fueran o no CE><positivas. .n los tres grupos de muestras se 0a observado un
rango mu' amplio de e2tracci/n leucocitaria total que 0a oscilado entre $@@.@@@ '
%."@@.@@@ de LP(,.
*l anali8ar la composici/n porcentual del proceso de e2tracci/n se observa c/mo 0a
variado dependiendo del tipo de muestra. .l menor porcentaje de LP(, correspond!a a
las muestras con antigenemia ' CE><positivo, siendo adem1s el que 0a mostrado un
rango muc0o m1s amplio (6%N<"@@N. * pesar de ello no se observan diferencias
significativas con los porcentajes obtenidos en las muestras con antigenemia ' CE><
negativo (pJ@,@9 ' con ambas negativas (pX@,@94.
.n las muestras con antigenemia positiva, el valor medio de positividad fue de 6$
LP(,H"@@.@@@ LP(, ' su valor corregido al ajustarlo, si el rendimiento del proceso
de e2tracci/n fuera del "@@N en ve8 del realmente obtenido, 0ubiera sido de 9"
LP(,H"@@.@@@ LP(,, no observ1ndose diferencias significativas (pJ@,@9.
.l empleo de una soluci/n de de2trano al %N en cloruro s/dico al @,#N (de2trano
salino es el mtodo m1s ampliamente utili8ado en el proceso de e2tracci/n leucocitaria
en la prueba de la *g<pp%9
9,=,$
. .s un mtodo sencillo, barato ' al alcance de la ma'or!a
de laboratorios. Ein embargo, como la ma'or!a de los sistemas de e2tracci/n o
separaci/n celular utili8ados en sangre perifrica, no siempre obtiene un rendimiento del
"@@N. Los principales motivos para ello son el propio pol!mero, que no es
e2clusivamente selectivo en el proceso de separaci/n de los LP(, ', especialmente, las
caracter!sticas de la propia sangre del paciente ' la minuciosidad del que reali8a la
metodolog!a
=,#
.
.n este estudio 0emos anali8ado el rendimiento real del de2trano salino en la e2tracci/n
de LP(, de sangre perifrica en tres tipos de pacientes. .n primer lugar un grupo de
pacientes con sintomatolog!a de enfermedad por C(> ' que correspond!an a las
muestras *g ' CE><positivas. .s este grupo en el que se 0a mostrado un menor
rendimiento cuantitativo del mtodo, tanto en el recuento total como en el porcentaje
final de LP(, presentes en la poblaci/n celular e2traida.
.n general este tipo de pacientes presentan por su propia enfermedad por C(> una
inmunosupresi/n transitoria que se aade a la inducida por los f1rmacos
inmunosupresores. ;odo ello determina que el n)mero total de leucocitos presentes en
sangre perifrica sea menor que en las personas sanas
9,$,#
. .sta leucopenia demostrada
tambin se 0a visto asociada a un descenso casi significativo del porcentaje de LP(,
presentes en la poblaci/n e2traida (media del $4,6N.
.n el grupo de pacientes con *g<pp%9 negativa no 0emos observado apenas diferencias
seg)n tuvieran el CE> positivo o no. Los primeros, correspondientes la ma'or!a a
pacientes receptores de trasplante renal, no presentaban ninguna sintomatolog!a cl!nica
compatible con infecci/n o enfermedad por C(> ' se detectaron en las muestras de
control semanal postrasplante. .n ninguno de ellos se reali8/ tratamiento antiv!rico '
simplemente corresponden a viremias de bajo nivel sin, en general, valor predictivo
positivo.
.l grupo de muestras con *g<pp%9 ' CE> negativo tambin correspond!an a pacientes
trasplantados de ri/n bajo control, pero recogidas m1s all1 del cuarto mes del
trasplante. .ste grupo es el que 0a mostrado el rendimiento global (media de 4,"
millones de leucocitos ' el porcentaje m1s alto de LP(, (#4,9N. .ste porcentaje se
asemeja al comunicado por Gerna et al
=
del #9N obtenido en el proceso de e2tracci/n
leucocitaria en pacientes receptores de trasplante renal ' enfermos de sida. *unque la
media global de LP(, obtenido en nuestro estudio en el conjunto de todas las muestras
0a sido del $=N.
*l anali8ar las muestras con *g<pp%9 positiva se observa como el valor medio de la
misma 0a sido de 6$ LP(,<positivosH"@@.@@@ LP(,. .ste valor se 0a obtenido con los
diferentes porcentajes de LP(, obtenidos en cada proceso individuali8ado de
e2tracci/n. Ei a la 0ora de calcular la cantidad de leucocitos que deben utili8arse para la
prueba de la *g<pp%9 tuviramos en cuenta el porcentaje real de LP(, presentes en la
poblaci/n leucocitaria, deber!amos aadir m1s cantidad salvo en los casos en que el
porcentaje de LP(, fuera del "@@N.
Por lo tanto, uno de los inconvenientes del sistema de e2tracci/n con de2trano salino es
que al no obtener un "@@N de LP(, estamos anali8ando menos LP(, de los
deseados. Ein embargo, cuando luego 0emos ajustado los valores de la antigenemia al
porcentaje real de LP(, e2istentes en la poblaci/n leucocitaria, 0emos observado
c/mo el valor medio de la misma pasaba a ser de 9" LP(,<positivoH"@@.@@@ LP(,.
.s decir, no se obtiene apenas un incremento significativo ni en la media ni en los
valores individuali8ados, 'a que porcentajes de incremento del "@N al 4@N sobre
valores de antigenemia bajos apenas modifican el valor final ' el significado cl!nico de
la antigenemia positiva.
.n resumen, el mtodo de e2tracci/n con de2trano salino aplicado a la prueba de la *g<
pp%9 frente al C(> presenta un rendimiento aceptable, que var!a generalmente en
funci/n de la cl!nica del paciente ' de su estado inmunol/gico. .s un mtodo sencillo,
barato ' que no precisa reali8ar ajustes en funci/n del porcentaje final de LP(,, 'a que
no se produce una prdida significativa de los mismos. Ein embargo, debe reali8arse la
metodolog!a con total minuciosidad ' ajust1ndose a los tiempos ' procedimientos de la
misma para poder obtener resultados comparables dentro de un mismo laboratorio.