AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE CEPAS

BIOTRANSFORMADORAS DE TERPENOS


1. INTRODUCCIN
La biotransformacin de terpenos esta reportada desde 1978. Las
biotransformaciones de productos naturales constituyen un rea de gran inters
farmacutico, dado que es posible potenciar su actividad biolgica a travs de
reacciones regio- y enantioselectivas. En especial, las biotransformaciones de
terpenos son muy estudiadas, porque permiten la produccin de compuestos
enantiomricamente puros bajo condiciones de reaccin suaves, que pueden ser
utilizados en la industria farmacutica, alimenticia y cosmtica, entre otras.
Los monoterpenos representan un grupo abundante de sustancias quirales, que
pueden ser transformadas en componentes bioactivos de gran valor agregado, tales
como saborizantes, fragancias y frmacos.
Adems, gracias a la gran biodisponibilidad, fcil obtencin, y a la enanito- y
estereoselectividad de este mtodo, estos terpenoides son valiosos productos de
partida para la obtencin biotecnolgica de diferentes compuestos.
Las reacciones de biotransformacin pueden ser llevadas a cabo por
microorganismos o travs de reacciones enzimticas, utilizando enzimas oxidativas
como mono- o di-oxigenasas o peroxidasas. Las enzimas son molculas altamente
especficas tanto en la reaccin que catalizan, como en la seleccin de las sustancias
reaccionantes, denominadas sustratos.
Adems son de gran inters, ya que determinan la pauta de las transformaciones
qumicas, tambin son raras las reacciones colaterales, que conducen a la formacin
de productos secundarios, por lo que el uso de estos biocatalizadores en las
diferentes industrias ha ido aumentando a lo largo de los ltimos aos.
Solamente en el proceso de transformacin se conocen dos microrganismos
impliocados en la misma: Pseudomona incognita como la biodegradadora de
linalool, geraniol nerol y limoneno y Botrytis cinrea que biotransforma el linalool.


2. OBJETIVOS
- Aislar cepas que transformen terpenos en otros compuestos qumicos de inters
para la industria de perfumera y alimentos, realizando la identificacin de las
cepas adecuadas a nuestro fin.

3. MARCO TEORICO
3.1 TERPENOS
Los terpenos constituyen uno de los grandes grupos de compuestos secundarios
presentes en una amplia proporcin en el reino vegetal. Entre ellos, se
encuentran los metabolitos secundarios, como los componentes de esencias,
blsamos y resinas, y un importante grupo de metabolitos considerados
fisiolgicamente como primarios. Estas sustancias naturales tradicionalmente
conocidas como derivados del 2-metil-butadieno (isopreno), son los principales
constituyentes de los aceites esenciales presentes en muchas familias de
plantas, y se usan como aditivos en comidas, como fragancias en perfumera,
en aromaterapia y en medicina tradicional y alternativa. La clasificacin de los
terpenos, basada en la consideracin, que ellos son derivados del isopreno. El
verdadero precursor de esta familia de sustancias es el cido mevalnico (cido
3,5- dihidroxi-3-metilpentanoico), el cual proviene de la acetil coenzima A.
Las unidades de isopreno se unen formando cadenas acclicas y ciclos (mono-,
di-, tri-, etc) de varios tomos de carbono.

Formacin de un monoterpeno a partir de dos molculas de isopreno

Los terpenos se clasifican segn las unidades de isopreno presentes en su
estructura.

Tabla 1. Clasificacin de terpenos, segn unidades isoprnicas
Prefijo
Nmero de tomos
de carbono
Nmero de unidades de
isopreno,

Mono 10 2
Sesqui 15 3
Di 20 4
Tri 30 6
Tetra 40 8
Poli >40 >8

Los monoterpenos son molculas que contienen 10 tomos de carbono en su
estructura, y se clasifican en acclicos, monocclicos y bicclicos.
El limoneno es un terpeno monocclico que ha sido utilizado en diversos
procesos industriales, qumicos, farmacuticos y alimenticios, como solvente
industrial, materia prima para la fabricacin de otros compuestos qumicos,
componente aromtico, entre otros. Debido al gran uso que tiene este
compuesto, se ha incrementado el nmero de investigaciones relacionadas con
su biotransformacin en sustancias de mayor valor agregado y aplicaciones
especficas.

3.1.1 Limoneno. El limoneno es un monoterpeno monocclico muy
abundante en la naturaleza y con un olor caracterstico a los ctricos y
algunas plantas aromticas. Debido a la presencia de un carbono quiral
en su estructura, existen dos enantimeros con propiedades y usos
especficos.



El S-(-)-limoneno se encuentra principalmente en la Menta spicata o
hierbabuena, la cual es una hierba perenne, proveniente de Europa,
empleada en gastronoma y perfumera, por su aroma intenso y fresco.
El R-(+)-limoneno es el compuesto mayoritario del aceite esencial
obtenido de los frutos ctricos (naranja, limn, mandarina, entre otros).
El limoneno se separa industrialmente por un proceso de desterpenacin
del aceite esencial y se usa como disolvente biodegradable de resinas,
pigmentos, tintas, entre otros, as como componente aromtico y en la
sntesis de nuevos compuestos.
En la Figura, se observan las estructuras qumicas de los dos
enantimeros del limoneno.

Estructuras qumicas de los enantimeros del limoneno

El limoneno presenta enlaces dobles entre los carbonos C1-C2 y C8-C9,
siendo ms probable la oxidacin en las posiciones allicas (C3 y C6) y la
epoxidacin en los dobles enlaces por razones de estabilidad y
reactividad qumica (Ver Figura anterior), sin embargo, puede oxidarse
en otros carbonos menos reactivos. Debido a que la reactividad en los
metilos y los metilenos allicos es muy similar, la selectividad se dificulta
cuando se emplean catalizadores convencionales, por esta razn se
prefiere el uso de biocatalizadores.
Algunas de las propiedades fsicas y qumicas del limoneno se presentan
en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2. Propiedades fsicas y qumicas del limoneno.
PROPI EDAD DESCRI PTOR
Formula Molecular

Peso Molecular 136.24 g/mol
Estado Fsico Liquido
Color / Olor Incoloro / Ctrico
Punto de ebullicin 178C
Densidad 20C 0.84g/cm
3
Presin de vapor a 20C 2.1 Pa
Solubilidad en agua a 20C Insoluble

3.2 BIOTRANSFORMACIONES
Las biotransformaciones son importantes en sntesis orgnica, especialmente,
para la produccin de molculas quirales, caso en el que las reacciones
qumicas son bastante complejas de realizar.
Los procesos de biotransformacin se definen como aquellos en los cuales se
emplean sistemas biolgicos para llevar a cabo transformaciones qumicas de
cualquier tipo. Estos sistemas se denominan biocatalizadores y se caracterizan
por ser enzimas o molculas completas, ya sean microorganismos naturales o
recombinantes
Este proceso desempea un papel clave en el mbito de los productos
alimenticios, industria de drogas quirales, vitaminas, productos qumicos
especiales de valor agregado y de la alimentacin animal.

reas de aplicacin de procesos de biotransformacin

Ampliar un proceso biotecnolgico del laboratorio a una escala comercial es
difcil y necesita de varios pasos. Sin embargo, ms y ms industrias se estn
moviendo hacia el desarrollo de procesos basados en biocatlisis debido a sus
ventajas. Es por esto, que cada da se incrementa ms el inters, tanto
acadmico como industrial hacia los biocatalizadores y las
biotransformaciones, debido a su especificidad, estabilidad, sensibilidad y bajo
costo.
Las biotransformaciones son conversiones catalizadas por enzimas, de
diferentes sustratos. Las enzimas para biocatlisis se usan en un sin nmero de
formas. Pueden ser tipo natural, recombinantes o genticamente modificadas
para incrementar su especificidad o actividad.
Estas biotransformaciones se han realizado tradicionalmente en sistemas
acuosos, debido a que estos medios son generalmente compatibles con las
enzimas. Sin embargo, la solubilidad de los terpenos en agua es muy baja, por
lo que es necesario emplear algunos solventes orgnicos en el medio de
reaccin. Cuando se emplean solventes no-acuosos en vez del medio acuoso
Bio
transfom
acion
Tratamientos
de aguas
Productos
farmaceuticos
vitaminas
Alimentos
Suplementos
Alimenticios
para animales
Productos
Quimicos
natural, las enzimas exhiben nuevas propiedades, incluyendo su habilidad de
catalizar reacciones imposibles de llevar a cabo en agua, y presentando el
aumento de la termoestabilidad y la selectividad, entre otras. La principal
desventaja del funcionamiento de la enzimas en solventes orgnicos es que se
reduce su actividad cataltica comparada con la que presenta en el medio
acuoso; una de las principales causas de esta inactivacin no es el efecto
mismo del solvente orgnico sino la desnaturalizacin de la enzima, por su
previa deshidratacin, usualmente por medio de liofilizacin.

3.2.1 BIOTRANSFORMACIN DEL LIMONENO
Adems de las aplicaciones que tiene el limoneno en diversos procesos
industriales, qumicos, farmacuticos y alimenticios, sus propiedades
organolpticas y costos, ha aumentado el nmero de investigaciones
relacionadas con su biotransformacin en sustancias de mayor valor
agregado. Entre los productos de biotransformacin obtenidos en las
diferentes biotransformaciones realizadas, se encuentra el Alcohol
Perlico, la Isopiperitona y el Carveol.
En los ltimos cinco aos se di un progreso significativo en el estudio
de la biotransformacin del limoneno, especialmente, empleando la
biocatlisis microbiana por cepas de bacterias, hongos, levaduras y
enzimas. A diferencia de los procesos qumicos tradicionales, que
requieren temperaturas y presiones elevadas, las conversiones
microbianas ocurren en condiciones moderadas, y, en algunos casos, los
productos se obtienen de modo selectivo.
Algunos de los microorganismos usados en la biotransformacin del
limoneno se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Microorganismos usados en la biotransformacin del limoneno
Microroganismos Productos de biotransformacin
Diplodia gossypina y Corynospora
cassiicola
Productos de hidroxilacin
Aspergillus cellulosae (+)-Isopiperitona, (+)- alcohol perlico y
(+)-ciscarveol
Bacillus
stearothermophilus
Alcohol perlico
Arxula adeninivorans y Yarrowia
lipolytica
cido perlico

En los ltimos aos se han visto cambios significativos en el campo de la
biotransformacin del limoneno, especialmente, con el uso de
microorganismos como biocatalizadores. Un gran nmero de metabolitos
aislados e identificados de diversos microorganismos y clulas, han
demostrado su capacidad de transformar el limoneno en compuestos
oxidados de mayor inters y aplicabilidad.
En el siguiente esquema, se presentan algunas de las principales rutas de
biotransformacin del limoneno.

Algunas de las principales rutas de biotransformacin del limoneno
Para la identificacin tentativa de los componentes de una muestra
determinada mediante GC se utiliza la comparacin de sus tiempos de
retencin, con los de los patrones analizados bajo las mismas condiciones
operacionales. Sin embargo, los tiempos de retencin dependen de
numerosas variables, tales como: el modo de inyeccin, las variaciones
de temperatura o flujo de los gases, el diseo del equipo, etc. Por esta
razn ha sido necesaria la introduccin de parmetros que sean
reproducibles como lo son los tiempos de retencin relativos y los ndices
de retencin. Estos se calculan a partir de los tiempos de retencin, y por
comparacin con una serie de sustancias a las cuales se le asignan valores
arbitrarios de ndices de retencin. Los ms utilizados son los conocidos
como ndices de Kovts, introducidos en 1958 por E. Kovts, que han
sido definidos respecto a los tiempos de retencin de una serie de n-
alcanos.
Debido a su simplicidad, sensibilidad y efectividad para separar los
componentes de mezclas, la cromatografa de gases es una de las
herramientas ms importantes en qumica. Es ampliamente usada para
anlisis cuantitativo y cualitativo de mezclas, para la purificacin de
compuestos y para la determinacin de constantes termoqumicas, tales
como calores de solucin y vaporizacin, presin de vapor y coeficientes
de actividad. La cromatografa de gases tambin se usa para monitorear
los procesos industriales en forma automtica: se analizan las corrientes
de gas peridicamente y se realizan reacciones en forma manual o
automtica para contrarrestar variaciones no deseadas.

4. PROCEDIMIENTO
Se deber realizar aislamientos a partir de un medio mnimo, utilizando 0.25% de
limoneno como la nica fuente de carbono. El aislamiento se deber realizar en
guayabas y naranjas en mal estado, cerveza deteriorada y aislamientos ambientales.
Se montaran 10 muestras y 10 placas por cada variante, se incubara a 30 y 37 C.
las placas que mostraran crecimiento sern observadas a travs del microscopio,
pasndose a tubos las colonias con caractersticas diferentes, las cuales sern
evaluadas en la produccin de aromas, hacindolas crecer en medio mnimo liquido
con el 0.25% del limoneno a pH 6.9 en cultivo esttico a 30C.
Toda la produccin de aromas deber ser evaluada por paneles sensoriales de
especialistas.
Por otro lado deber hacerse asilamiento a partir de residuales que contengan
presumibles contaminacin fecal en medio acetamida especfico para pseudomonas.
Las cepas debern ser evaluadas para produccin de aromas en el medio acetamida
por los mismo panelistas, inhibiendo el crecimiento microbiano con tratamiento a
60C por 30 minutos y pH 4.5.
Las mejores productoras de aromas se clasificaran por el esquema de King.

5. CONCLUSIONES
El bajo costo y la fcil consecucin del limoneno ha estimulado su uso como
sustrato para la produccin de compuestos con mayor valor agregado, tiles como
aditivos, aromas y sabores en la industria. En la bsqueda de una mayor eficiencia y
productos qumicamente ms puros, las transformaciones se han efectuado, usando
microorganismos y enzimas (biotransformaciones).

6. RECOMENDACIONES
Debido a que los procesos de biotransformacin se consideran muy promisorios
actualmente, es necesario seguir estudiando la biodiversidad natural. Por ejemplo,
identificar, extraer y emplear enzimas recolectadas de plantas, animales o clulas
microbianas, de diferentes zonas de nuestro pas.

Checho pones bibliografa