CULTIVO DE CLULAS Y

CELULAS 3T3
Trabajo Prctico n1: Cultivo celular.


21 DE JULIO DE 2014
GUILLERMO CASTILLO CONSTANZA MARURI
Profesor: Jorge Gonzlez; Kelly Ordenes; Juan San Francisco.
Laboratorio de Parasitologa Molecular
Antofagasta
Universidad de Antofagasta
Fca. Ciencias del Mar y Recursos
Biolgicos.
Marco Terico.
Cultivo Celular.
Se entiende por cultivo celular, el conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de clulas
in vitro, preservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Bajo unas
condiciones adecuadas (medios y superficies de cultivo, presencia de antibiticos, asepsia
ambiental, instrumental adecuado, etc.) se consiguen mantener clones de un solo tipo de clulas
de origen animal y/o vegetal bien definidos a partir de cada cultivo celular. Debido a que se facilita
su manipulacin, se puede alcanzar una mayor viabilidad en las clulas lo que, hace que los
cultivos celulares sean ptimos para trabajos de investigacin bsica, estudios de ingeniera
gentica y/o produccin de compuestos biolgicos como, por ejemplo, vacunas virales (Molecular
Biology of the Cell ed. 2002).
Las tcnicas de cultivo celular son indispensables en la mayora, si no en todas las disciplinas de
ciencias de la vida hasta la fecha, sin embargo se carece de modelos de cultivo celular apropiados,
esto provoca que el desarrollo cientfico se vea obstaculizado (Genersch et al 2013).
El cultivo de tejidos se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como una continuacin
de las tcnicas de la embriologa. Wilhem Roux mantuvo en el ao 1885 clulas de embrin de
pollo en solucin salina durante unos das. El zologo americano R.G. Harrison es considerado el
iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907. Harrison fue el primer autor que emple
tcnicas in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal
embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y
estableci que el axn se formaba por expansin a partir del cuerpo neuronal y no por fusin de
una cadena de clulas. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un
cubreobjetos sobre una cmara sellada.

Clulas 3T3:

Corresponden a clulas de fibroblasto de embrin de ratn albino, fueron descubiertas en 1962 en
la escuela de medicina de la universidad de New York. 3T3 significa clulas transferidas cada tres
das en inculos de 300.000 clulas. El cultivo tiene una apariencia similar a los adoquines.
(Jainchill, J.1969).
Las clulas crecen rpidamente en monocapa en un medio, pero frenan su crecimiento cuando se
encuentran confluentes, aproximadamente a la concentracin de 106 clulas por placa, por esta
razn se dice que las clulas 3T3 son muy proclives a la inhibicin por contacto clula-clula.
(Holley, R. W., & Kiernan, J. A. 1968)
Todaro, Green y Lazar realizaron un experimento en el cual la inhibicin ya no era un problema
(Todaro GJ, Lazar GK, Green H ,1965), utilizando suero bobino.
Estas clulas originalmente eran muy propensas a la inhibicin de la propagacin celular al
contacto con temazepam (benzodiacepina), sin embargo la lnea celular que se cre a partir de
ellas ya no es inhibida por esto. Sigue siendo, de todos modos, sensible al virus del sarcoma y de la
leucemia. (Jainchill, J.1969)
Esta lnea celular es ideal para estudios que necesiten transfeccin usando ADN. Como ejemplo
este tipo de procedimiento se utiliza con el fin de detectar oncogenes (Di Fiore P. 1987).


Figura 1: clulas 3T3 con crecimiento en una baja y alta densidad.
Clulas LLC-MK2:
El cultivo de clulas de rin de mono en monocapa preparadas utilizando el mtodo de la
tripsina, es utilizado extensivamente en muchos laboratorios. Esta popularidad se debe al amplio
espectro de agentes virales que pueden propagarse en estos cultivos, as como tambin la relativa
facilidad con la cual pueden prepararse grandes nmeros de cultivos. Estas clulas cuando han
sido recientemente tripsinizadas se adhieren al recipiente y se vuelven menos sensibles a agentes
txicos, tales como, cambios del medio, fluctuaciones de temperaturas y otros factores o
condiciones adversas. Estas caractersticas la han potenciado el uso de estas clulas de tejidos de
rin (Hull et al 1962).

Figura 2: clulas LLC-MK2 con crecimiento en una baja y alta densidad.

Trichomonas vaginalis.
Son protozoos anaerobios y flagelados que miden alrededor de 10 m de largo y 7 de ancho que
presentan un gran ncleo y un aparato de Golgi, sin embargo no posee mitocondria, peroxisomas.
Su crecimiento es optimizado a los 37 C y un pH de 6,0 a 6,3, sin embargo puede sobrevivir hasta
pH igual a 7, o un pH no menor a 5.
La vagina y sus secreciones proveen de los nutrientes necesarios para que este organismo
prolifere, en conjuncin con la digestin de bacterias para complementar la necesidad de
nutrientes.

Su metabolismo consiste en la fermentacin del piruvato a acetato, malato, H2 y CO2 en un
proceso dependiente de ADP, Pi, Mg+2 y succinato. (Steinbchel, A., & Mller, M. 1986)
Es la causa ms comn de vaginitis y enxocervicitis, T. vaginalis se adhiere a las clulas epiteliales
de las mucosas utilizando adhesinas en su membrana (Heine, p., & Mcgregor, j. a. 1993)
Muchas de las infecciones son asintomticas, casi un 88% no son diagnosticadas y un 29% son mal
diagnosticadas como infecciones por T. vaginalis. (Fouts, A. C., & Kraus, S. J. 1980)
Las infecciones pueden persistir por largos periodos de tiempo o de por vida, en pacientes que no
reciben un tratamiento adecuado o no reciben ningn tipo de tratamiento.
Este protozoo puede aumentar las posibilidades de contraer el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH) (Public Health Agency of Canada, 2010) .se piensa que esto se debe a que T.
vaginalis aumenta la cantidad de clulas infectadas con el virus o que son susceptibles a ser
infectadas, como los linfocitos y los macrfagos. (Laga, M., Nzila, N., & Goeman, J. 1991)
La exposicin de clulas que crecen en monocapa a T. vaginalis, tales como clulas vaginales y
urigenitales (Hela) o rin de mono (Vero), resultan en la disrupcin de la monocapa. Las clulas
teidas con azul Tripn que son extradas luego de ser expuestas al patgeno presentan una
notablemente menor viabilidad. (Alderete, J. F., & Pearlman, E. 1984).

Figura 3: representacin 3D de T. vaginalis



Monocitos THP-1:
THP-1 es una lnea celular de monocitos humanos derivados de pacientes que padecen de
leucemia monocitica aguda. Estas clulas son utilizadas para poner a prueba las lneas celulares de
leucemia en el anlisis inmunocitoqumico de la interaccin protena-protena, y la
inmunohistoqumica. La morfologa de estas clulas es que se presentan de manera redonda,
grandes y en una sola clula y son clulas no adherentes. Esta lnea celular puede proporcionar un
cultivo continuo cuando se cultivan en suspensin en un medio RPMI + 10% deFBS + 2 mM de L-
glutamina, el tiempo medio de duplicacin se alcanza entre las 35 a 50 horas, las condiciones
ptimas para estas clulas es que deben cultivarse a 37C con niveles de CO2 del 5% adems no
deben superar las 9x10^5 clulas/mL (Tsuchiya et al 1980).

Figura 4: clulas THP-1 con crecimiento en una baja y alta densidad.
Metodologa.

Descongelamiento y cultivo de clulas LLCMK2.

Materiales:

Medios temperados 37C.
Tubo con 9ml de medio RPMI.
Frasco T-25.
Bao con agua a 37C.
Pipeteador.
Pipetas estriles.
Centrfuga.
Clulas LLC-MK2.

Procedimiento.

1. Se tom el vial con clulas LLC-MK2 desde su almacenamiento de -70C desde un tanque
de nitrgeno lquido.
2. Se dej el vial en un bao a 37C hasta su descongelamiento.
3. Se transfiri el contenido del vial a un tubo falcn que contena 9 mL de medio RPMI.
4. Se re-suspendi suavemente el contenido del tubo, con el fin de disgregar las clulas, se
transfiri una gota a un porta objeto.
5. Se centrifugo el tubo a 1800 rpm durante 10 min.
6. Mientras la muestra era centrifugada se observ la viabilidad de las clulas, para ello, se
tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto
agregndole 10 uL de azul de Tripn, y posteriormente se re-suspendi, luego se contaron
las clulas vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.
7. Al finalizar la centrifugacin se elimin el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml
de medio para no pasar a llevar el pellet.
8. Se agreg 5 ml de medio RPMI al pellet y se re-suspendi con el fin de disgregar las
clulas, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo el
frasco suavemente adelante y hacia atrs y desde lado a lado.
9. Se observ el frasco al microscopio y se incubaron las clulas en una estufa con las
siguientes condiciones: 37C, 5% CO2.
10. Al da siguiente se observ la densidad colocando el frasco en un microscopio invertido.

Tripsinizacin de clulas LLC-MK2.

Materiales.

Tripsina.
Frascos cultivo.
Pipetas estriles.
Pipeteador.
Tubo falcn de 15ml.

Procedimiento
1. Se observ la confluencia de las clulas observndolas en el microscopio invertido, si la
confluencia de las clulas eran mayores a 70%, podan ser tripsinizadas.
2. Se elimin el medio del frasco T-25.
3. Se agreg suavemente 2 mL de tripsina por el borde del frasco con el fin de lavar las
clulas, se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrs y de lado a
lado.
4. Se elimin la tripsina del frasco.
5. Se agreg 1 ml de tripsina directamente a la superficie donde se encontraban las clulas,
se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrs y de lado a lado.
6. Se observ al microscopio invertido como las clulas se soltaban.
7. Se dio un golpe con la mano al frasco para soltar completamente las clulas y se observ
nuevamente al microscopio.
8. El paso 7 fue repetido hasta lograr que las clulas se soltaran completamente.
9. Se re-suspendieron las clulas del frasco y se traspas todo el contenido a un tubo falcn
de 15 mL.
10. Se contaron las clulas en una cmara de neubauer.
11. Se agreg 10 ml medio RPMI.
12. Se reparti el contenido en partes iguales en 2 frascos T-25 (5mL cada frasco).
13. Se incubaron las clulas en una estufa con las siguientes condiciones: 37C, 5% CO2.

Congelamiento de clulas LLC-MK2.

Materiales.
Tripsina.
Crio tubos.
Pipetas estriles.
Pipeteador.
Tubo falcn de 15ml.
Medio de congelamiento.

Procedimiento.
1. Se observ la confluencia de las clulas observndolas en el microscopio invertido, si la
confluencia de las clulas eran mayores a 70%, podan ser tripsinizadas.
2. Se elimin el medio del frasco T-25.
3. Se agreg suavemente 2 mL de tripsina por el borde del frasco con el fin de lavar las
clulas, se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrs y de lado a
lado.
4. Se elimin la tripsina del frasco.
5. Se agreg 1 ml de tripsina directamente a la superficie donde se encontraban las clulas,
se homogeneizo moviendo el frasco suavemente hacia adelante y atrs y de lado a lado.
6. Se observ al microscopio invertido como las clulas se soltaban.
7. Se dio un golpe con la mano al frasco para soltar completamente las clulas y se observ
nuevamente al microscopio.
8. El paso 7 fue repetido hasta lograr que las clulas se soltaran completamente.
9. Se re-suspendieron las clulas del frasco y se traspas todo el contenido a un tubo falcn
de 15 mL.
10. Se contaron las clulas en una cmara de neubauer.
11. Se agreg 4 ml medio RPMI.
12. Se centrifugo a 1800 rpm durante 10 min.
13. Se elimin el medio sin tomar el sobrenadante y se agreg 1 mL de medio de
congelamiento, se traspas el contenido a un crio-tubo.
14. Se congelaron las muestras a -70C.



Descongelamiento y cultivo de Trichomonas vaginalis.

Materiales.
Medios temperados 37C
Tubo con 9ml de medio Diamond sin suero
Bao con agua a 37C
Pipeteador
Pipetas estriles
Centrfuga

Procedimiento.
1. Se tom el vial con clulas Trichomonas vaginalis desde su almacenamiento.
2. Se dej el vial en un bao a 37C hasta su descongelamiento.
3. Se transfiri el contenido del vial a un tubo falcn que contena 9 mL de medio Diamond
(sin suero).
4. Se re-suspendi suavemente el contenido del tubo, se transfiri una gota a un porta
objeto.
5. Se centrifugo el tubo a 1900 rpm durante 10 min.
6. Mientras la muestra era centrifugada se observ la viabilidad de las clulas, para ello, se
tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto
agregndole 10 uL de azul de Tripn, y posteriormente se re-suspendi, luego se contaron
las clulas vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.
7. Se contaron los 4 cuadrantes de la cmara, para luego sacar el promedio y este fue
multiplicado por 10000.
8. Al finalizar la centrifugacin se elimin el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml
de medio para no pasar a llevar el pellet.
9. Se ajust a 500000 clulas/mL
10. Se agreg 5 ml de medio Diamond suplementado con 10% de suero equino al pellet y se
re-suspendi, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo
el frasco suavemente adelante y hacia atrs y desde lado a lado.
11. Se realiz el recuento en la cmara de neubauer adicionando 10 uL a esta.
12. Se repiti el protocolo cada 18 horas.

Descongelamiento y cultivo de Monocitos (THP-1)

Materiales.

Medios temperados 37C.
Tubo con 9ml de medio RPMI.
Frasco T-25.
Bao con agua a 37C.
Pipeteador.
Pipetas estriles.
Centrfuga.
Clulas THP-1.

Procedimiento.

1. Se tom el vial con clulas THP-1 desde su almacenamiento de -70C desde un tanque de
nitrgeno lquido.
2. Se dej el vial en un bao a 37C hasta su descongelamiento.
3. Se transfiri el contenido del vial a un tubo falcn que contena 9 mL de medio RPMI.
4. Se re-suspendi suavemente el contenido del tubo, con el fin de disgregar las clulas, se
transfiri una gota a un porta objeto.
5. Se centrifugo el tubo a 1800 rpm durante 10 min.
6. Mientras la muestra era centrifugada se observ la viabilidad de las clulas, para ello, se
tomaron 10 uL de la gota trasferida al porta objeto y fue depositada en otro porta objeto
agregndole 10 uL de azul de Tripn, y posteriormente se re-suspendi, luego se contaron
las clulas vivas y muertas para realizar el porcentaje de viabilidad.
7. Al finalizar la centrifugacin se elimin el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5ml
de medio para no pasar a llevar el pellet.
8. Se agreg 5 ml de medio RPMI al pellet y se re-suspendi con el fin de disgregar las
clulas, luego de traspaso el contenido a un frasco T-25 y se homogeneizo moviendo el
frasco suavemente adelante y hacia atrs y desde lado a lado.
9. Se observ el frasco al microscopio y se incubaron las clulas en una estufa con las
siguientes condiciones: 37C, 5% CO2.
10. Al da siguiente se observ la densidad colocando el frasco en un microscopio invertido.


Resultados.
Clulas LLCMK2
Descongelamiento de clulas.
Con el fin de saber si las clulas eran candidatas para cultivarlas se observ la viabilidad tiendo
las clulas con azul Tripn, por lo tanto las clulas viables (vivas), no adquieren coloracin azul.
Obtenindose un 100% de viabilidad.
Cultivo de las clulas:
El cultivo de clulas se observ bajo un microscopio invertido luego del cultivo para corroborar
que no existiera contaminacin con bacterias u otros. El cultivo permaneca transparente por lo
que fue contaminado por bacterias.
Tripsinizacin:
Antes de soltar las clulas del frasco T-25 se observ la confluencia, esta deba ser superior al 70%
pero sin llegar a un 100%. La confluencia observada era correspondiente a un 90%.
Se realiz un conteo en cmara de Neubauer para corroborar que las clulas estuviesen vivas.
Trichomonas vaginalis.
Descongelamiento y cultivo
Se observ la viabilidad de las clulas obteniendo solo un 30%, luego se realiz un conteo en
cmara de Neubauer y se ajust el nmero de clulas a 500000 clulas/ml, el volumen obtenido es
15,5 ml que se reparti en dos tubos.
Se detect levaduras.

Monocitos THP-1
Descongelamiento y cultivo
Se realiz una nueva prueba de viabilidad que resulto en un 0% de viabilidad
Se observaron levaduras nuevamente.
Discusin.
La prueba de azul Tripn es un mtodo de exclusin que permite distinguir clulas vivas de clulas
muertas. Se basa en que las clulas vivas poseen su membrana intacta que impide a los colorantes
entrar a la clula, por consiguiente las clulas vivas no se tien y las muertas se tien de color azul.
(Strober, W. 2001)
Esta prueba fue utilizada para ver la viabilidad celular sin embargo, es probable que la tincin se
encontraba contaminada con levaduras debido a que el cultivo de T.vaginalis y de monocitos no
presentaba indicios de contaminacin como la turbidez. (Johnson, G. (1942).

Una vez conclusa la experiencia con T.vaginalis, se procedi a comenzar con monocitos THP-1, sin
embargo, antes de descongelar las clulas se observ la viabilidad y esta arroj un 0% de
viabilidad, por lo que no se pudo continuar con el procedimiento.
La viabilidad debe ser superior al 70% como mnimo para que el cultivo de las clulas tenga xito.
(Tennant, J. R. 1964).Esto se debe a una mala manipulacin al momento de incubar las clulas, ya
que el cultivo no se encontraba en las condiciones ambientales adecuadas, se dejaron al aire libre.
Referencias.
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Parasitology, 28(5), 369-379.

Anexo.
Medios.
RPMI 1640 R8005 Sigma-Aldrich
Pesar 16,4g para 1 litro y disolver en 800ml de agua Milli Q.
Aadir 2g/L de bicarbonato de sodio.
Una vez que se haya disuelto todo medir pH, dejar entre 7,2-7,4.
Aforar a 900ml.
Aadir 100ml de FBS (quedara al 10%).

Agregar 10ml de ATB 100X.

Tripsina
NaCl 0,14M
KH
2
PO
4
0,002M
KCl 0,01M
Na
2
HPO
4
0,008M
EDTA 0,00078M
Tripsina 0,1%
Disolver en agua Milli Q
Dejar a pH 7,2-7,4
Filtrar
Medio de congelamiento
Al medio RPMI aadir:
10% FBS
10% DMSO
Ejemplo para 10ml de medio de congelamiento: tener 8ml de medio RPMI + 1ml FBS + 1ml DMSO.
Medio Diamond modificado (para 1litro)
Componente Cantidad
Casena peptona 24g
Extracto de levadura 12g
Maltosa 6g
Cistena hidrocloridrica monohidratada 1,33g
cido ascrbico 0,24
Agua destilada c.s.p. 900ml
Ajustar pH 6,3+/-0,2
Autoclavar por 15 minutos a 121C
Agregar suero equino inactivado, para esto usted debe dejar el suero durante 30 minutos en un
bao a 56C.