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TRABAJO PRACTICO N2


RECONOCIMIENTO Y PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS

I) Pptidos
Los aminocidos pueden condesarse entre s, unindose a travs del grupo
carboxilo de un aminocido al grupo amino de otro aminocido, lo que se denomina
enlace peptdico.
Los pptidos se forman por uniones de aminocidos a travs de los enlaces
peptdicos, segn el nmero de aminocidos que componen el pptido existen:
dipptidos, tripptidos, tetrapptidos, etc. Si un pptido posee menos de diez aminocidos
se conoce como Oligopptido; los que exceden este tamao se conocen como
polipptidos.
II) Protenas
Las protenas estn constituidas por largas cadenas polipeptdicas, en donde los
aminocidos estn ubicados en una secuencia determinada y esto corresponde a una
estructura primaria de una protena.
La estructura secundaria se refiere a la extensin en que un polipptido o
cadena posee una estructura helicoidal. Una espiral diestra o -hlice se estabiliza
mediante la presencia de enlaces hidrgeno entre los grupos carbonilo e imido de los
enlaces peptdicos.
La estructura terciaria se refiere al modo como la cadena polipeptdica se curva
para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las protenas globulares,
la estabilizacin de esta estructura se atribuye a las diferentes reactividades asociadas a
los grupos R de los residuos aminoacdicos tales como: interacciones electrostticas
enlaces hidrgenos, interacciones hidrofbicas, unin dislfuro.
La estructura cuaternaria pone de manifiesto como se disponen en el espacio las
cadenas, por ejemplo: la enzima fosforilasa contiene dos subunidades idnticas que por
separado son catalticamente inactivas, pero cuando se unen para formar un dmero,
constituyen la enzima activa.





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III) PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS


Las propiedades biolgicas de una protena, as como parte de sus propiedades
fsico-qumicas, dependen de su estructura. Cuando estas estructuras se alteran o se
destruyen, aunque no haya ruptura de las cadenas polipeptdicas, la protena pierde sus
caractersticas funcionales y se alteran sus propiedades fsico-qumicas; este proceso se
denomina desnaturalizacin.
El trmino desnaturalizacin tiene una variedad de significados, segn: la protena
sea o no oligomrica, la prdida de la conformacin sea parcial o completa y la actividad
biolgica se pierda o no. En algunos casos el proceso es irreversible, en otros, se puede
restaurar la conformacin nativa y la actividad biolgica.
Los agentes desnaturalizantes actan esencialmente destruyendo los enlaces
puente hidrgeno y las uniones dislfuro, lo que altera las estructuras secundaria y
terciaria de las protenas. Los agentes desnaturalizantes ms comunes son cidos
fuertes, bases fuertes, calor y agitacin mecnica. El aspecto ms visible en la
desnaturalizacin es el descenso de la solubilidad proteica.
Por tales causas, los manejos de protenas se hacen a temperatura reducida para
evitar la desnaturalizacin trmica, se emplean tampones para mantener el carcter poli -
inico natural de la protena y se evita el trauma fsico como la agitacin o se manti ene al
mnimo. Las investigaciones que tratan del aislamiento, purificacin, y anlisis de las
protenas, son verdaderamente representativas del arte del anlisis bioqumico.

IV) ACCIONES PARA DESNATURALIZAR LAS PROTENAS

1. PRECIPITACIN POR SOLVENTES ORGNICOS

La adicin de solventes orgnicos neutros miscibles con el agua, tales como:
metanol, etanol o acetona, disminuye la solubilidad en agua de la mayor parte de las
protenas globulares de tal manera que precipitan de la solucin. La solubilidad de una
protena a un pH y fuerza inica determinados est en funcin de la constante dielctrica
del medio.




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La constante dialctica () est definida por la relacin:

F = e
1
x e
2

r
2


F : Fuerza de atraccin entre dos iones de carga opuesta
e
1
y e
2
: Cargas de los iones.
r : Distancia entre los iones.

El agua tiene constante dielctrica relativamente alta (=80 a 20 C) por lo cual en
solucin acuosa disminuye la interaccin entre las molculas proteicas (debido a sus
grupos cargados) mientras aumenta la interaccin entre las protenas y el agua, esto
favorece la solubilidad de las protenas.
Los solventes orgnicos tales como el metanol, etanol, acetona, tienen constantes
dielctricos bajas (32, 25 y 19 respectivamente a 20 C) de modo que al agregarlos a una
solucin acuosa de protenas baja la constante dielctrica del medio, lo que favorece la
interaccin de los grupos con carga elctrica de la protenas y por lo tanto de su
precipitacin.
La precipitacin proteica por los solventes no solo se explica en base a la
constante dielctrica, tambin, hay que considerar la deshidratacin de las protenas. Las
molculas del solvente no acuoso forman hidratos compitiendo por el agua con las
molculas proteicas producindose la precipitacin por deshidratacin de las protenas.
Los solventes pueden llegar a distorsionar la estructura de las protenas, posiblemente por
accin a nivel de los enlaces hidrofbicos, determinando la desnaturalizacin de las
protenas. Este fenmeno disminuye a bajas temperaturas ya que el calor por s
mismo es un agente desnaturalizante.

2. PRECIPITACIN DE PROTENAS POR FOMACION DE SALES INSOLUBLE

Las protenas precipitan por la accin de ciertos cidos como el cido
Tricloroactico, cido tnqstico, cido molbdico y otros; tambin las protenas pueden
precipitar por la accin de ciertos iones metales pesados como Hg, Zn, Cd, Cu, y Pb.
Todos estos agentes hacen precipitar las protenas por que forman con ellas sales
insolubles.
El mecanismo de accin de estos agentes es la siguiente: los precipitantes cidos
forman sales insolubles con las formas catinicas (+) de la protena, siendo necesario
efectuar el proceso de un pH ms cido que el punto isoelctrico. A su vez los metales
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pesados forman sales insolubles con las formas aninicas (-) de la protena
necesitndose entonces un pH ms alcalino que el punto isoelctrico.

3. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Dentro de un intervalo de temperatura entre 0C y 40C aumenta la solubilidad de
las protenas con el aumento de temperatura. Por sobre 40C a 50C la mayor parte de
las protenas son cada vez ms inestables y comienzan a desnaturalizarse, por lo comn
con prdida de solubilidad.
La desnaturalizacin puede conducir a la coagulacin de la protena, es decir, a su
agregacin y precipitacin irreversible. La coagulacin es un criterio para reconocer la
desnaturalizacin de una protena. La formacin de un coagulo blanco, insoluble, cuando
se hierve la clara de huevo es un ejemplo comn de desnaturalizacin trmica.
Los fraccionamientos de protenas por lo general se realizan a 0C, ya que la mayor
parte de las protenas son estables a bajas temperaturas.


4. PRECIPITACIN O SEPARACION POR PUNTO ISOELECTRICO

Las molculas proteicas son polivalentes, es decir, llevan varias cargas en forma
simultnea. Aparte de los grupos carboxilo (COO
-
) y amino terminales (NH
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), la molcula
proteica puede tener otras cargas positivas provenientes de aminocidos diaminados.
Otras cargas negativas pueden provenir de aminocidos dicarboxlicos, aminocidos con
grupos SH y aminocidos de carcter fenlico.
Se denomina carga neta de la protena a la diferencia absoluta entre el nmero de
cargas positivas y el nmero de cargas negativas. Una misma molcula proteica puede
presentar cualquiera de los tres estados electroestticos (positivo, neutro, negativo)
dependiendo del pH del medio en el cual se encuentra disuelta.
Si el nmero de cargas positivas es mayor que el nmero de cargas negativas, la
protena estar cargada positivamente y viceversa. Si el nmero de cargas positivas es
igual al de las cargas negativas, entonces la protena ser elctricamente neutra.
El punto isoelctrico, queda definido como aquel valor de pH al que la molcula
proteica no posee carga elctrica neta ya que hay igualdad de cargas positivas y
negativas y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico.
Cada protena y aminocido tiene un punto isoelctrico (pH) caracterstico que
depende del nmero de grupos ionizables y de sus constantes de disociacin.
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La menor solubilidad en el pH igual al punto isoelctrico, se debe a que como la
molcula no tiene carga elctrica neta, no existen repulsiones electroestticas entre
molculas de protenas vecinas, lo cual conduce a la formacin de agregados insolubles.
Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pH, tambin diferentes, con
frecuencia pueden separarse, unas de otra, mediante precipitacin isoelctrica.
La menor solubilidad de una protena en su punto isoelctrico puede ser utilizado
como un mtodo conveniente para determinar este punto.

V) ELECTROFORESIS

Es un trmino que se refiere al movimiento de partculas cargadas (iones) en un
campo elctrico. Es uno de los mtodos ms efectivos de separacin y caracterizacin.
Los requerimientos bsicos son:
a) Que los componentes de la mezcla tengan forma inica o puedan ser convertidos en
iones.
b) Que cada componente tenga una carga neta distinta.
La electroforesis ha sido muy valiosa en el aislamiento y separacin de protenas
esto se debe a que los mtodos electroforticos se pueden realizar en condiciones muy
suaves protegiendo a las protenas de cualquier modificacin estructural severa.
En la actualidad han adquirido gran desarrollo las tcnicas electroforticas de zona
en que las protenas se mueven a travs de un soporte uniforme del tipo de un gel,
almidn, etc.

VI) PROPIEDAD TAMPN DE LAS PROTEINAS

El carcter de cido dbil de las protenas en presencia de sus bases conjugadas
les permite funcionar como soluciones tampones, es decir, que pueden agregarse
cantidades relativamente grandes de cido o de lcalis sin que vare apreciablemente el
pH. Esta propiedad es de gran importancia en los sistemas biolgicos, donde se ha visto
que las protenas constituyen el principal sistema tampn. Por ejemplo, aproximadamente
el 80% del poder amortiguador de la sangre de los mamferos se debe a las protenas.



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VII) REACCIONES PARA EL RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS

Las reacciones de coloracin para el reconocimiento de protenas se basan en
muchos casos en la identificacin de grupos estructurales de algunos de sus
aminocidos.

1. Reaccin de Biuret
La prueba de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) es positiva para
todos los compuestos que tengan dos o ms uniones peptdicas. La coloracin
prpura de una reaccin positiva se debe a un complejo de coordinacin entre
el Cu
+2
y cuatro tomos de nitrgeno proveniente de enlaces peptdicos.

2. Reaccin xantoproteca o reaccin del cido ntrico.
En esta reaccin se obtiene una coloracin amarilla (griego
XANTHOS=amarillo). El ensayo es positivo para las protenas que llevan el
anillo bencnico (aromtico) como la tirosina, triptfano y fenilalanina. El color
amarillo se debe a la formacin de un compuesto aromtico nitrado. Esta
reaccin explica la aparicin de una coloracin amarilla al caer gotas de cido
ntrico sobre la piel.

TRABAJO EXPERIMENTAL

OBJETIVO GENERAL

Reconocer las propiedades de las protenas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Observar la accin de los solventes orgnicos sobre las protenas.
2. Observar la precipitacin de las protenas por formacin de sales.
3. Observar la accin del calor sobre las protenas.







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i) Reacciones de Identificacin
A) La reaccin se desarrolla de acuerdo a la siguiente tabla
Tubo 1 2 3
Agua destilada 2 ml --- ---
Solucin de albmina 2 ml
Solucin de leche 2 ml
Reactivo de Biuret 1 ml 1 ml 1 ml

B) La reaccin se desarrolla de acuerdo a la siguiente tabla
Tubo 1 2 3
Agua destilada 2 ml --- ---
Solucin de albmina 2 ml
Solucin de leche 2 ml
Acido ntrico concentrado 1 ml 1 ml 1 ml

Nota: Tenga precaucin al manipular el cido ntrico concentrado, al caer sobre la piel
puede provocar quemaduras. Evite la inhalacin de sus vapores.
Realice esta reaccin bajo la campana.

ii) Accin de solventes orgnicos

Disponga de 3 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3
Solucin de albmina 2 ml 2 ml 2 ml
Etanol 2 ml
Metanol 2 ml
Acetona 2 ml

Observe y anote sus resultados.
Nota: Emplee las siguientes expresiones para los resultados
No cambia : -
Opalescencia : +
Precipitado : ++


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iii) Precipitacin por formacin de sales
Prepare la siguiente serie de tubos:
Tubo 1 2 3
Solucin de albmina 2 ml 2 ml 2 ml
Solucin tampn pH= 9 1 ml 1 ml 1 ml
Nitrato de plata 2 ml
Nitrato de plomo 2 ml
Cloruro frrico 2 ml

Observe y anote sus resultados.
Nota: Emplee las siguientes expresiones para los resultados
No cambia : -
Opalescencia : +
Precipitado : ++

iv) ACCION DEL CALOR SOBRE LAS PROTEINAS
a) En un tubo coloque 8 ml de solucin de albmina y caliente en bao
termoregulado a 37 C,
b) En un tubo de ensayo, coloque 10 ml de solucin de albmina y caliente en un
mechero con cuidado la parte superior hasta que hierva, compare con la parte
inferior.

v) Capacidad Tampn de las protena
En un tubo de ensayo coloque 3 mL de la solucin de albmina y agregue 2 gotas del
indicador rojo Congo. Luego agregue lentamente 2 mL de una solucin de cido
clorhdrico HCl 0,1 M. Anote el volumen gastado para virar el color.
Repita la operacin para un tubo de ensayo con 3 mL de agua destilada.














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