INSTITUTO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS

Mestrado em Tecnologia de Imunobiolgicos





ASPECTOS FUNDAMENTAIS IMPLANTAO DA TECNOLOGIA
DE PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANIZADOS
COM POTENCIAL APLICAO TERAPUTICA



CARLOS HUMBERTO MARQUES













Rio de Janeiro
2005




INSTITUTO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS
Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular
Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos




CARLOS HUMBERTO MARQUES


ASPECTOS FUNDAMENTAIS IMPLANTAO DA TECNOLOGIA
DE PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANIZADOS
COM POTENCIAL APLICAO TERAPUTICA













Dissertao apresentada ao Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos requisitos
para obteno do ttulo de Mestre em
Tecnologia de Imunobiolgicos



RIO DE JANEIRO
2005

Ficha Catalogrfica na Fonte
CICT/FIOCRUZ
Biblioteca de Manguinhos Setor de Processamento Tcnico de
Monografias/Multimeios










M357 Marques, Carlos Humberto.
Aspectos fundamentais implantao da tecnologia de
produo de anticorpos monoclonais humanizados com
potencial, aplicao teraputica./ Carlos Humberto Marques.
Rio de J aneiro: FIOCRUZ, 2005.
xv, 109 p.: il.

Tese (Mestrado). Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e
Molecular.


1. Anticorpos. 2. Anticorpos Monoclonais . I. Ttulo.

CDD. 571.967























Trabalho realizado no Instituto de Tecnologia
em Imunobiolgicos, Vice-Diretoria de
Desenvolvimento Tecnolgico VDTEC, sob
a orientao da Professora Dra. Maria da
Glria Martins Teixeira
ii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS
Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular
Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos




CARLOS HUMBERTO MARQUES


ASPECTOS FUNDAMENTAIS IMPLANTAO DA TECNOLOGIA
DE PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANIZADOS
COM POTENCIAL APLICAO TERAPUTICA




ORIENTADORA: Prof. Dra. Maria da Glria Martins Teixeira


Aprovada em: / / .


EXAMINADORES:

Prof. Dr. Presidente
Prof. Dr.
Prof. Dr.

Rio de Janeiro, de maio de 2005.
iii





























minha esposa Cynthia e aos meus
filhos Lucas, Sylvia e Laura, por sua
compreenso e apoio na elaborao
deste trabalho, que ocupou sempre
preciosas horas de convivncia
familiar.
iv

AGRADECIMENTOS

Doutora Maria da Glria Martins Teixeira, minha orientadora.
Doutora Rugimar Marcovistz, pelo apoio tcnico, cientfico e profissional e, em
especial, pela boa vontade, ateno dispensada, disposio e grande ajuda nas
sugestes e correes.
Doutora Elezer Monte Blanco Lemes, pelo grande auxlio durante o
desenvolvimento do trabalho e carter profissional.
Doutora Leda dos Reis Castilho, pelas indicaes, colaborao, reviso e ateno
dispensadas.
Doutora Andra Queiroz Maranho, pela ateno e sugestes.
Doutora Sheila Farage, coordenadora do mestrado profissional, primeira turma
do MPTI, pelas horas compartilhadas e aos diversos professores das disciplinas
cursadas, pelo conhecimento e experincia transmitidos.
Ao mestre Ruy Porto Fernandes, pelo esprito de companheirismo e fundamental
colaborao nas difceis horas de estudo.
Gisele Albuquerque Chads, pela ajuda, incentivo e tempo de estudo conjunto.
Aline Stelling Zanatta, pela colaborao e apoio na formatao desse trabalho.
amiga Zara Antunes Prado, pela grande fora, carinho e auxlio nos momentos
mais difceis.
Cludia Maria Dias pela espirituosidade, companheirismo e alegria transmitidos.
equipe do LATAM, pela compreenso e colaborao e a Claudia Elaine, pelo
auxlio e apoio prestados.
mestre Ndia Maria Batoreu, grande amiga e fundadora do Setor de Hibridomas,
concretizando um sonho e ao parceiro J oo Luiz Sampaio Queiroz, pela ajuda na
conduo das atividades laboratoriais.
Aos meus pais e minha irm.
A todos os demais aqui no mencionados, que direta ou indiretamente colaboraram
de alguma forma para a estruturao e sucesso dessa dissertao.

v



NDICE
ABREVIATURAS..................................................................................................... VIII
SMBOLOS................................................................................................................. X
NDICE DE FIGURAS ............................................................................................... XI
NDICE DE TABELAS............................................................................................. XIII
R E S U M O............................................................................................................XIV
ABSTRACT..............................................................................................................XV
I N T R O D U O...................................................................................................1
OBJ ETIVOS ................................................................................................................5
PARTE I - ANTICORPOS...........................................................................................6

1 - ANTICORPOS....................................................................................................7
1.1 Conceito e Origem.........................................................................................7
1.2 Estrutura e Funes......................................................................................9
1.3 Classes e Subclasses .................................................................................13
1.4 Mecanismos de Ao dos Anticorpos ..........................................................18

2 - ANTICORPOS MONOCLONAIS......................................................................22
2.1 Anticorpos Monoclonais Murinos ................................................................22
2.2 Anticorpos Monoclonais Quimricos e Humanizados .................................25
2.3 Outras Estratgias para Gerao de Anticorpos Monoclonais com Fins
Teraputicos ......................................................................................................27
2.3.1 Anticorpos monoclonais obtidos por biblioteca genmica ....................29
2.3.2 Anticorpos monoclonais obtidos em camundongos transgnicos ........33
2.4 Anticorpos Monoclonais para Uso Teraputico...........................................34

3 - SISTEMAS DE PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
HUMANIZADOS ....................................................................................................39
3.1. Sistemas de Expresso de Protenas Heterlogas....................................39
3.1.1 Vantagens e desvantagens dos vrios sistemas para expresso
heterloga de protenas:.................................................................................44
3.1.2 Expresso em bactrias, leveduras e clulas de mamferos................48
3.2 Sistemas de Cultivo...................................................................................... 54
3.2.1 Os processos de cultivo em biorreatores...............................................56
3.3 Sistemas de Purificao..............................................................................62
vi
PARTE II PROPOSTA PARA PRODUO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
HUMANIZADOS .......................................................................................................69

1 - HUMANIZAO DO ANTICORPO ANTI-CD20...............................................70
1.1 O Antgeno CD20........................................................................................70
1.2 O Linfoma No-Hodgkin LNH....................................................................72
1.3 O Anticorpo Monoclonal Rituximab.............................................................75

2 - O LABORATRIO DE TECNOLOGIA DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
LATAM...................................................................................................................77
2.1 Impactos da Implantao da Tecnologia de Humanizao.........................82

3 - PROJ ETO DE PRODUO............................................................................86
3.1 Recursos Fsicos.........................................................................................86
3.1.1 Reestruturao do Laboratrio..............................................................86
3.1.2 Equipamentos Necessrios para Aquisio .........................................92
3.2 Recursos Humanos Parcerias e Colaboraes........................................93
3.2.1 Recursos Humanos ..............................................................................93
3.2.2 Parcerias e Colaboraes ....................................................................95

4 - MERCADO......................................................................................................97
CONCLUSO.........................................................................................................101
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................103

vii



ABREVIATURAS

ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (citotoxicidade mediada por
clulas dependentes de anticorpo)
BALB/c Bagg -Albino C
BCG Bacilo de Calmet-Gurin
BHK Baby Hamster Kidney (rim de hamster neonato)
BPL Boas Prticas de Laboratrio
CD Clusters of Differentiation (conjunto de diferenciao)
CDR Complementary Determining Regions (regies determinantes de
complementaridade)
CEMIB Centro de Bioterismo
C
H
Heavy Chain (cadeia pesada)
CHO Chinese Hamster Ovary (ovrio de hamster chins)
C
L
Light Chain (cadeia leve)
CO
2
- Dixido de Carbono
COPPE Coordenao dos Programas de Ps-graduao de Engenharia
COS Clulas de rim de macaco modificadas com SV-40
DEDET Departamento de Desenvolvimento Tecnolgico
DNA cido Desoxirribonuclico
DEPEM Departamento de Engenharia e Manuteno
DREAD Diviso de Reativos para Diagnstico
E. coli Escherichia coli
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (ensaio de imunoabsorvncia por
ligao enzimtica)
Fab antigen binding fragment (fragmento de ligao com o antgeno)
Fc crystallizable fragment (fragmento cristalizvel)
FDA Food and Drug Administration (agncia regulatria americana)
FINEP Financiadora de Estudos e Projetos do Ministrio da Cincia e Tecnologia
FIOCRUZ Fundao Oswaldo Cruz
FR Framework (arcabouo, estrutura da molcula)
viii




Fv variable fragment (Fragmento varivel)
HACA Human anti-chimeric antibody (anticorpo humano anti-quimrico)
HAHA Human anti-human antibody (anticorpo humano anti-humano)
HAMA Human anti-mouse antibody (anticorpo humano anti-camundongo)
HAT Hipoxantina, Aminopterina e Timidina
HAV Vrus da Hepatite A
HBV Vrus da Hepatite B
HBsAg Antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B
HBsAgRec Antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B recombinante
HCV Vrus da Hepatite C
HIV Human immunodeficiency virus (vrus da imunodeficincia humana)
IFI Imunofluorescncia indireta
Ig Imunoglobulina
IgA Imunoglobulina A
IgD Imunoglobulina D
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
kDa kilo Dalton
LAEAN Laboratrio de Experimentao Animal
LANEU Laboratrio de Neurovirulncia
LATAM Laboratrio de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais
LDGC-B Linfoma difuso de grandes clulas do tipo B
LECC Laboratrio de Engenharia de Cultivos Celulares
LNH Linfoma No-Hodgkin
LPS Lipopolissacardeos
Mabs monoclonal antibodies (anticorpos monoclonais)
MPTI Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos
NK Natural-killer (matadora natural)
NSO Clulas de mieloma de camundongo

ix




PCR Polymerase Chain Reaction (reao da polimerase em cadeia)
pH Potencial de Hidrognio
RH Recursos Humanos
RNA cido ribonuclico
S. aureus Staphilococcus aureus
Sc single chain (cadeia nica)
scFv single chain variable fragment (fragmento varivel de cadeia nica)
SIDA Sndrome da Imunodeficincia Adquirida
SLE Systemic Lupus Erythematosus (lupus eritematoso sistmico)
TNF Tumoral necrosis factor (fator de necrose tumoral)
UCG Universidade Catlica de Gois
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
UNB Universidade de Braslia
UFRJ Universidade Federal do Rio de J aneiro
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
USP Universidade de So Paulo
VDTEC Vice Diretoria de Desenvolvimento Tecnolgico
V
H
Regio varivel da cadeia pesada
V
L
Regio varivel da cadeia leve

SMBOLOS

- Alfa - pg. 13
- Gama - pg. 13
- Delta - pg. 13
- psilon - pg. 13
- Capa - pg. 13
- Lmbda - pg. 13
- Mi - pg. 13
x






NDICE DE FIGURAS
PARTE I

Fig. 1.1 Esquema de produo de anticorpos pg. 8
Fig. 1.2 Estrutura das imunoglobulinas pg. 10
Fig. 1.3 Grau de hipervariabilidade das CDR e estrutura molecular da V
L
- pg. 11
Fig. 1.4 Estrutura molecular das regies variveis V
H
e V
L
pg. 12
Fig. 1.5 Cadeias leves e pesadas pg. 12
Fig. 1.6 Iditipo, paratopo e eptopo pg. 14
Fig. 1.7 Classes de imunoglobulinas pg. 17
Fig. 1.8 Mecanismos de ao dos anticorpos imunidade humoral pg. 19
Fig. 1.9 Opsonizao pg. 19
Fig. 1.10 Citotoxicidade mediada por clulas dependentes de anticorpos pg. 20
Fig. 2.1 Ciclo de produo de anticorpos monoclonais pg. 24
Fig. 2.2 Ciclo de humanizao pg. 26
Fig. 2.3 Comparao entre os mtodos de produo de anticorpos pg. 28
Fig. 2.4 Biblioteca de expresso genmica em fagos pg. 29
Fig. 2.5 Triagem para formao de biblioteca de expresso em fagos pg. 30
Fig. 2.6 Seleo de ligantes de biblioteca de expresso em fagos pg. 32
Fig. 2.7 Chave de eventos e fatos marcantes na indstria pg. 35
Fig. 3.1 Ciclo de humanizao e sistemas de expresso utilizados pg. 39
Fig. 3.2 Relao custo/rendimento em diferentes sistemas de expresso pg. 43
Fig. 3.3 Frasco spinner pg. 53
Fig. 3.4 Diferentes sistemas de cultivo pg. 59
Fig. 3.5 Biorreator de tanque agitado pg. 60
Fig. 3.6 Biorreator BioFlo 110, painel e acessrios pg. 61
Fig. 3.7 Integrao de etapas e aumento de rendimento pela cromatografia de
afinidade pg. 63
Fig. 3.8 Cromatografia de afinidade pg. 64
Fig. 3.9 Filtro dinmico de disco rotatrio pg. 65
xi

NDICE DE FIGURAS
PARTE II

Fig. 1.1 Estrutura e expresso do CD20 em clulas B pg. 70
Fig. 1.2 Diferenciao dos linfcitos B pg. 71
Fig. 1.3 As 10 maiores incidncias de cncer EUA 2001 pg. 72
Fig. 2.1 Planta atual do LATAM pg. 77
Fig. 3.1 rea proposta para o LATAM pg. 87
Fig. 3.2 Planta proposta para o LATAM pg. 88
Fig. 3.3 Setores a serem criados com a reestruturao do LATAM pg. 90
Fig. 4.1 Crescimento do mercado de anticorpos monoclonais em 2002 pg. 98









xii





NDICE DE TABELAS

PARTE I


Tab. 2.1 Anticorpos aprovados pelo FDA pgs. 37 e 38
Tab. 3.1 Principais sistemas e suas vantagens e desvantagens na expresso de
protenas de interesse biotecnolgico pgs. 44/45/46
Tab. 3.2 Comparao entre diferentes sistemas de expresso pg. 47
Tab. 3.3 Biofrmacos aprovados produzidos em CHO pgs. 51/52/53
Tab. 3.4 Comparao entre processos de produo para cultivo em biorreatores de
tanque agitado pg. 57
Tab. 3.5 Comparao: diferentes sistemas de cultivo / rendimento celular pg. 59
Tab. 3.6 Exemplos de anticorpos purificados e seus derivados obtidos por
engenharia gentica. Mtodos de separao por afinidade, baseados em
ligantes convencionais pg. 71

PARTE II

Tab. 1.1 Estimativa de novos casos cncer e relao de mortes por sexo EUA
2004 pg. 73
Tab. 1.2 Principais classes de leucemias e linfomas de clulas B pg. 73
Tab. 1.3 Gastos com o CD20 entre J aneiro 2002 e Agosto de 2003 - pg. 75
xiii





R E S U M O



Os anticorpos monoclonais possuem diversas aplicaes em
transplantes, na composio de conjuntos de reativos para diagnstico, grande
variedade de doenas auto-imunes e, principalmente, na terapia do cncer. A
tecnologia de produo de anticorpos monoclonais recombinantes revolucionou a
gerao de imunoglobulinas, possibilitando a obteno de anticorpos humanizados
dirigidos a uma grande variedade de antgenos especficos. A baixa seletividade das
metodologias atuais para diagnstico e terapia de neoplasias constitui um dos
principais empecilhos para a prtica oncolgica. Nesse particular, a utilizao de
imunoglobulinas submetidas engenharia gentica j uma realidade e significa um
avano estratgico, abrangendo cerca de 25% do mercado biofarmacutico global
de protenas teraputicas. Este trabalho aponta os aspectos fundamentais
concretizao da metodologia de humanizao de anticorpos por transplante das
regies determinantes de complementaridade CDR, com nfase em uma proposta
de produo do anticorpo anti CD20 contra o Linfoma No-Hodgkin. A introduo
do Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos - Bio-Manguinhos nesse promissor e
importante mercado de biofrmacos atravs da implantao da metodologia de
humanizao do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 objeto desta dissertao.
Viabilizar sua produo torna-se extremamente importante, tanto para a identificao
precisa e precoce da enfermidade, quanto para atender um segmento do mercado
brasileiro ainda desprovido de tratamento abrangente e eficaz. A apresentao do
estudo dos anticorpos, sua estrutura e caractersticas, o estudo dos diferentes
sistemas de expresso, cultivo, purificao, bem como a proposta de reestruturao
e redimensionamento do Laboratrio de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais,
parcerias, colaboraes, recursos humanos necessrios e aspectos de mercado,
so aqui considerados.
Palavras-chave: Anticorpo; Humanizao de Anticorpos Monoclonais; Anticorpos
Monoclonais Teraputicos; Antgeno CD20; Biofrmacos.
xiv




ABSTRACT



Monoclonal antibodies (Mabs) have several applications in transplants,
reagents for diagnosis, a great variety of auto-immune diseases and mainly, in
cancer therapy. Mabs production employing recombinant technology made a
revolution in immunoglobulins generation, enabling the production of humanized
antibodies that recognize specific antigens. The low selectivity of the current
techniques for neoplasm diagnosis and therapy is one of the major impediments for
oncology practice. In this regard, the use of genetically engineered immunoglobulins
has become a reality and means a strategic development comprising around 25% of
the global biopharmaceutical market. This work shows the most important aspects in
Mabs humanization through complementary determining regions (CDR) graft
methodology, emphasizing a proposal of anti-CD20 Mab production against non-
Hodgkin lymphoma. Introducing the Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos
Bio-Manguinhos in this important and promising biopharmaceutical market through
the establishment of humanization methodology is the main object of this
dissertation. Making humanized Mabs production feasible is very important not only
for the early and precise identification of illnesses, but also to meet a demand of the
Brazilian market that still lacks comprehensive and efficient treatment. The study of
Mabs, their structure and properties, expression systems, cultivation, purification,
new dimensions and structure of the laboratory, partnerships, cooperation, human
resources and market analysis are considered herein.

Keywords: Antibody; Humanized Monoclonal Antibodies; Therapeutic Monoclonal
Antibodies; CD20 Antigen; Biopharmaceuticals.
xv
I N T R O D U O

A primeira evidncia experimental do uso de anticorpos foi proposta
pelo mdico alemo Emil Adolf von Behring, que demonstrou, juntamente com
Shibasaburo Kitasato, a utilizao de imunoglobulinas para neutralizar a toxina
diftrica, fato que gerou grande revoluo no pensamento cientfico da poca. Por
este feito, recebeu o Prmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1901 (Nobelpreis,
2004).

Paul Ehrlich foi mdico e bacteriologista alemo, agraciado com o
Prmio Nobel de Medicina de 1908 por trabalhos sobre as teorias da imunidade
(Nobelpreis, 2004). Props a teoria da cadeia lateral (side-chain), da formao do
anticorpo (antikrper), muito semelhante ao pensamento atual sobre os receptores
de superfcie. Referia-se a essas novas molculas como balas mgicas (magic
bullets), pela sua capacidade de encontrar o antgeno-alvo e, por meio de interaes
especficas, neutraliz-lo e destru-lo. Demonstrou tambm que poderiam ser de
grande interesse na aplicao teraputica, conforme descrito em seu artigo:

Eu aqui me refiro produo de anticorpos contra as clulas da
organizao dos animais superiores. Esses anticorpos so tambm de uma natureza
complexa. Eles obedecem a j descrita lei da absoro eletiva e sua origem est em
harmonia com a teoria da cadeia lateral. esperado que tais imunizaes, que so
de grande interesse terico, tambm possam se tornar disponveis para aplicao
teraputica (Ehrlich, 1900).

possvel hibridizar clulas produtoras de anticorpos de origens
diversas. Esses hbridos podem ser cultivados in vitro, em grandes quantidades e
fornecer anticorpos especficos, o que poderia ter importncia na medicina e na
indstria (Khler & Milstein, 1975).

No ano de 1975, os mdicos imunologistas Georges J ean Franz
Khler, alemo, e Csar Milstein, argentino - aos quais a descoberta valeu o prmio
Nobel de medicina de 1984, pelo desenvolvimento da tecnologia de hibridomas e
dos princpios de produo de anticorpos monoclonais - provaram que, da fuso de
clulas tumorais capacitadas para sobreviver e se reproduzir em cultura com
1
linfcitos provenientes de animais imunizados, originavam-se os hibridomas
produtores de anticorpos monoclonais (Vliz, 2002).

Produzir anticorpos monoclonais consiste na obteno de
imunoglobulinas secretadas por clulas hbridas, derivadas de um nico clone
especfico denominado hibridoma, a partir de prvia imunizao de camundongos
com o antgeno especfico.

A preparao de hibridomas constituiu um marco na imunoqumica. A
primeira aplicao dessa tecnologia foi a produo de anticorpos monoclonais em
substituio aos anticorpos policlonais obtidos por meios convencionais. Talvez a
mais importante contribuio dos anticorpos monoclonais tenha sido ajudar a
compreender os diversos processos imunes e possibilitar a manipulao in vitro de
anticorpos, permitindo dissecar as respostas do sistema imune contra antgenos
especficos e o entendimento da estratgia que um animal emprega para produzir
anticorpos de alta afinidade.

Uma enorme expectativa foi gerada em torno da possibilidade de uso
dos anticorpos para o tratamento de inmeras doenas. O desenvolvimento de
anticorpos monoclonais com especificidade definida e disponibilidade ilimitada,
reviveu o interesse da comunidade cientfica na sua aplicao como forma de terapia
para o cncer. Contudo, havia um impedimento ao emprego dessa nova descoberta.
Por serem de origem animal, mais precisamente de camundongos, o uso em seres
humanos gerava uma resposta de anticorpos humanos contra aqueles de origem
murina, denominada resposta HAMA (human anti-mouse antibody). O
desenvolvimento de anticorpos pelo hospedeiro, gerando resposta imune contra as
imunoglobulinas administradas, culminava na neutralizao destas ou forte reao
imune. Isso foi um grande desalento para o meio cientfico no que diz respeito sua
utilizao como agente teraputico, pois levava o paciente a sofrer com as fortes
reaes alrgicas, podendo inclusive chegar anafilaxia. Essa a grande e
potencial complicao no tratamento soroterpico, especialmente se mltiplas
aplicaes forem necessrias e administradas por perodos prolongados (Schroff et
al., 1985; Shawler et al., 1985).

2
Com o desenvolvimento das tcnicas de biologia molecular e
engenharia gentica, foram possveis as primeiras tentativas de minimizar este
potencial imunognico atravs da obteno de anticorpos quimricos, por meio da
fuso das regies variveis da cadeia leve (light chain) e da cadeia pesada (heavy
chain) do anticorpo de camundongo, com as cadeias constantes de imunoglobulinas
humanas. Contudo, essas molculas, ainda imunognicas, geravam a resposta
HACA (human anti-chimeric antibody) pelos anticorpos humanos anti-quimricos.
Para contornar este problema, um outro mtodo foi desenvolvido. Este, preconiza o
transplante das regies determinantes de complementaridade - CDRs
(complementary determining regions) murinas, para a regio varivel das cadeias
leves e pesadas do arcabouo da molcula de anticorpo humano, que, alm disso,
mantm as cadeias constantes da imunoglobulina humana, buscando assim diminuir
sua imunogenicidade (Maranho & Brgido, 2001).

Outras formas de obteno de anticorpos para aplicao teraputica
atravs do emprego da engenharia gentica so pela formao de uma biblioteca de
expresso em fagos (Phage-Display) e tambm por uma outra tcnica que utiliza
modelos animais, como, por exemplo, camundongos transgnicos (Kipriyanov,
2004).

O emprego de frmacos base de anticorpos recombinantes est se
estabelecendo de forma consistente e relevante. O mercado mundial para anticorpos
teraputicos de cerca de US$ 5-6 bilhes, como mostra a figura 4.1 na pgina 98.
At o presente, a agncia de administrao de drogas e medicamentos americana
(food and drug administration - FDA) liberou os seguintes anticorpos para fins
teraputicos: Infliximab, Simulect, ReoPro Abciximab, Rituxan e Cetuximab
(quimricos), e Zenapax, Synagis, Trastuzumab, Gemtuzumab, Alemtuzumab,
Bevacizumab e, recentemente, o Natalizumab Tysabri (humanizados). Alm destes,
um grande nmero se encontra em fase de testes clnicos. Nos prximos anos, o
mercado dever ser invadido por essas imunoglobulinas de ltima gerao (Glennie
& J ohnson, 2000; Harris, 2004; FDA, 2004). Comercialmente, vrios j se encontram
disponveis no mercado externo e conseqentemente, com custo muito elevado,
inviabilizando sua utilizao em nosso sistema pblico de sade, impedindo que as
classes menos favorecidas possam ser beneficiadas pelo uso desses
medicamentos.
3

A tecnologia de humanizao de anticorpos monoclonais integra-os a
uma nova classe de medicamentos, os biofrmacos. Estes so direcionados ao
tratamento de doenas de significativa importncia na medicina como cncer, artrite
reumatide, asma, sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA), na preveno de
infeces bacterianas e na rejeio de transplante de rgos. Portanto, o enorme
potencial econmico agregado a essa nova classe de drogas extremamente vasto,
induzindo busca da auto-suficincia tecnolgica para a sua produo.

A implantao da tecnologia de produo de anticorpos humanizados
para fins teraputicos est indicada como sendo uma das prioridades da Unidade de
Bio-Manguinhos, cabendo ao Laboratrio de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais
- LATAM, viabilizar o desenvolvimento desses anticorpos.

Para tanto, esta dissertao foi desenvolvida em duas partes. A
primeira discorre genericamente sobre os anticorpos, sua estrutura, classes,
mecanismos de ao e, mais especificamente, sobre anticorpos monoclonais
murinos humanizados. Nesse momento, feita uma anlise detalhada dos sistemas
de expresso, cultivo e purificao empregados para essa finalidade.

Na segunda parte, o trabalho enfatiza o projeto prprio para a produo
de anticorpos monoclonais humanizados pelo LATAM, destacando no s os
aspectos biotecnolgicos da proposta, como tambm os recursos fsicos e humanos
necessrios para a implantao dessa metodologia. Parcerias, colaboraes e
anlise mercadolgica fazem parte da pesquisa.

Entendendo a amplitude da capacidade terica e prtica do tema
escolhido para o presente trabalho, no ter este a pretenso de esgotar o
conhecimento sobre a potencializao da implantao da tecnologia em questo.

Ressalta-se que esta dissertao se prope a fornecer dados concretos
para introduzir o Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos Bio-Manguinhos,
nesse promissor mercado de anticorpos teraputicos.
4

OBJETIVOS


I - Destacar as necessidades prticas, em relao reestruturao do laboratrio,
espao fsico e equipamentos que viabilizem a implantao do desenvolvimento de
anticorpos monoclonais humanizados;

II Selecionar, atravs da literatura e anlise de mercado, um modelo de anticorpo
para humanizao, cujo investimento se justifique pela aplicao mdica;

III - Identificar as exigncias para a formao de recursos humanos (RH), visando a
capacitao e qualificao da equipe em treinamentos voltados para essa nova
metodologia;

IV - Estudar os diferentes sistemas de cultivo de clulas animais em biorreatores
atravs da literatura, enfatizando suas vantagens e desvantagens.









5





















PARTE I - ANTICORPOS
6

1 - ANTICORPOS

1.1 Conceito e Origem


Os anticorpos so molculas glicoproticas, originrias das clulas B,
que circulam atravs do sangue e da linfa. So responsveis pela notvel
capacidade de detectar, localizar, reconhecer, ligar-se e inativar ou dar incio ao
processo de eliminao de um antgeno. Cada molcula de anticorpo possui uma
estrutura nica que lhe permite ligar-se especificamente ao seu antgeno
correspondente. Todos possuem a mesma estrutura geral e so tambm chamados
de imunoglobulinas (Silverton, 1977).

Antgeno qualquer substncia no reconhecida, estranha ao
organismo. Possui uma regio denominada determinante antignico ou eptopo,
onde ocorre a ligao com o anticorpo. Os antgenos podem ser compostos por
vrios eptopos distintos que possibilitam a ligao com anticorpos especficos para
cada um deles. Os anticorpos so capazes de reconhecer uma grande variedade de
molculas biolgicas antignicas como determinados polissacardeos, hormnios e
protenas.

Os microorganismos contam com vrios componentes antignicos
capazes de provocar uma resposta imune, por exemplo, a parede das clulas
bacterianas, cpsulas, fmbrias, flagelos e as toxinas, podem ser notadas como
antgenos, assim como a cpside, os envoltrios e os componentes internos das
partculas virais. Portanto, ao desenvolver uma vacina, imprescindvel identificar e
empregar o antgeno correto para provocar uma resposta imunolgica especfica e
protetora contra o patgeno correspondente. O processo de formao de anticorpos
em resposta presena do antgeno resulta na produo de molculas de alta
afinidade, com capacidade de distino entre espcies de molculas semelhantes.

Produzir anticorpos basicamente simples (Fig.1.1). Inicialmente,
seleciona-se o antgeno contra o qual se deseja o anticorpo. Estabelece-se a
7
dosagem e a via de inoculao mais adequada, de acordo com o modelo animal
escolhido. Injeta-se o contedo da seringa no animal selecionado. Este
procedimento se repetir por duas ou trs vezes aproximadamente, com intervalos
de 14 dias entre cada inoculao. Cobaias, coelhos, cabras, camundongos, cavalos,
entre outros, so os mais utilizados para a produo de anticorpos, sendo o
camundongo o mais comumente empregado para a produo dos anticorpos
monoclonais. Finalmente, cerca de 30 - 45 dias aps a primeira inoculao, esse
animal sangrado e no seu soro estaro presentes os anticorpos que iro
reconhecer o antgeno previamente aplicado. Os anticorpos produzidos desse modo
constituem uma mistura heterognea de imunoglobulinas especficas para diferentes
eptopos de um mesmo antgeno e para eptopos de diferentes antgenos, sendo
denominados policlonais (Silverton, 1977; Roque, 2004).
















Figura 1.1 - Esquema da produo de anticorpos a partir da inoculao do antgeno em
camundongo. A Soro policlonal. B Anticorpos monoclonais. Fonte: Kuby, 2002.

O processo de se isolar, em uma mistura de clulas esplnicas, um
linfcito secretor do anticorpo especfico a uma determinada regio do antgeno,
permite a obteno do anticorpo monoclonal, isto , aquele originrio e produzido
por um nico clone de linfcitos B. Os hibridomas, clulas hbridas secretoras de
8
anticorpos especficos, provm da fuso de clulas de mieloma com clulas
esplnicas imunes, como ser descrito posteriormente. Este hbrido isolado ser
clonado e ampliado, formando um banco de clulas secretoras de anticorpos com
alta especificidade para o antgeno alvo da imunizao que se precedeu. Tcnicas
diferenciadas, como ensaios imunoenzimticos (enzyme-linked immunosorbent
assay - ELISA) ou citometria de fluxo, podem ser empregadas para selecionar a
clula hbrida secretora de anticorpo (Silverton,1977; Kuby, 2002).


1.2 Estrutura e Funes

Os anticorpos tm sua estrutura em forma de Y, formada por quatro cadeias
polipeptdicas, sendo duas pesadas C
H
, (heavy chain) e duas leves C
L
, (light chain),
ligadas principalmente por pontes dissulfdricas, compostas por domnios distintos.
Em cada cadeia leve e pesada, os 110 aminocidos da poro amino-terminal
constituem um domnio varivel (V
L
e

V
H
). O remanescente de cada cadeia leve
consiste de um domnio constante nico (C
L
) e o restante de cada cadeia pesada
contm trs ou quatro domnios constantes (C
H
) (Fig.1.2).


9

Figura 1.2 Estrutura da molcula de imunoglobulinas. (Fonte: UFMG, 2005), onde:


Fab Fragmento de ligao com o antgeno (Fragment antigen binding);

Fv Regio de domnio varivel das cadeias leves e pesadas;

Fc Crystallizable Fragment) fragmento cristalizvel;

CDR Regio determinante de complementaridade (L leve e H pesada) (Complementarity
Determining Regions);

C
L
Regio constante da cadeia leve;

V
L
Regio varivel da cadeia leve;

V
H
Regio varivel da cadeia pesada;

V
H
V
L
Domnios variveis das cadeias pesada e leve;

C
H
C
L
Domnios constantes das cadeias pesada e leve;

C
H
1; C
H
2; C
H
3 Domnios carboxi-terminais constantes, da cadeia pesada;



10
Na extremidade C-terminal est localizado o fragmento F
C
, denominado
fragmento cristalizvel (crystallizable fragment). Esta regio reconhecida pelas
clulas do sistema imune, ligando-se aos receptores da membrana celular de
macrfagos, entre outras clulas efetoras do sistema imune. Tambm responsvel
pela ativao do complemento pela via clssica, contribuindo no processo de
destruio de microorganismos. Na extremidade N-terminal localizam-se os
fragmentos Fab de ligao com o antgeno (antigen binding fragment), que possuem
dois stios de ligao ao antgeno. Dentro do domnio varivel de cada cadeia leve e
pesada, h uma regio descrita como hipervarivel, em funo da alta variabilidade
de aminocidos observada em relao ao restante do domnio, constituindo 15-20%
deste (Fig.1.3). Estas regies hipervariveis so complementares ao eptopo de um
antgeno, sendo denominadas regies determinantes de complementaridade CDRs
(complementarity determining regions). Cada stio de ligao ao antgeno
constitudo por seis CDRs, sendo trs da regio varivel da cadeia leve e trs da
regio varivel da cadeia pesada, com funo de estabelecer contato fsico com o
antgeno (Silverton, 1977; Abbas, 2000; Kuby, 2002; Kipriyanov, 2004) (Figs.1.4 e
1.5).
Figura 1.3 A Representao da variabilidade em cada posio das distintas regies determinantes
de complementaridade dos segmentos V
H
(CDR1, CDR2, CDR3). No esquema inferior, a regio
varivel do gen IgH rearranjado, interrompida por trs regies do arcabouo (framework)
deaminocidos relativamente conservados. A regio CDR3 a mais hipervarivel e compreende a
seqncia que resulta da unio dos segmentos gnicos V
H
D
H
J
H
, alm dos segmentos N (barras
pretas) inseridas durante a recombinao. B - Estrutura molecular da regio varivel da cadeia leve
V
L
com trs alas das CDRs. Fonte: Adaptao de Kuby, 2002.
11














Figura 1.4 - Estrutura molecular das regies variveis da cadeia pesada V
H
e da cadeia leve
V
L
com as alas das CDR identificadas. Notar a ligao com o peptdeo viral. Fonte: Kuby,
2002.




Figura 1.5 - As cadeias leve (L) e pesada (H) das imunoglobulinas consistem em uma
regio varivel (verde) e uma regio constante (amarelo). As regies hipervariveis (regies
determinantes de complementaridade - CDR) so mostradas em vermelho. NH
+
3
regio amino-
terminal. COO
-
- regio carboxi-terminal. Fonte: UFMG, 2005.
12

1.3 Classes e Subclasses

Como citado anteriormente, cada molcula de anticorpo possui dois
stios de ligao ao antgeno, constitudos por seis alas hipervariveis. Nesses
stios identifica-se o paratopo, que a regio do anticorpo constituda pelos
peptdeos contendo os aminocidos complementares queles constituintes do
eptopo do antgeno. A produo de anticorpos inicia-se com a ligao especfica
entre os eptopos dos antgenos com paratopos dos anticorpos na superfcie das
clulas B, levando produo de anticorpos de mesma especificidade, mas de
classes ou istipos diferentes, os quais so encontrados na poro lquida (plasma)
do sangue e nos fluidos extracelulares. No passado, esses fluidos eram conhecidos
como humores. Denominou-se ento a imunidade mediada pelos anticorpos como
imunidade humoral.

A forma de Y de um anticorpo facilita a sua descrio. Os fragmentos
Fab que formam dois stios idnticos de ligao com o antgeno possui as regies V
H

e V
L
que so altamente variveis de uma molcula para outra, proporcionando
assim, a diversidade necessria para o reconhecimento do antgeno. As cadeias
leves podem ser do tipo (capa) ou (lambda). J as cadeias pesadas definem a
classe e as propriedades funcionais do anticorpo, podendo se apresentar de cinco
formas ou istipos. Cada classe ou istipo comporta um diferente conjunto de
mecanismos efetores para a eliminao do antgeno, uma vez que este
reconhecido (Fig.1.6).

Apesar de apresentarem muita semelhana, diferem entre si,
possuindo caractersticas distintas no tamanho, no contedo de carboidratos e na
carga eltrica. So identificados como IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, designando-se por
istipos s caractersticas tpicas das suas cadeias pesadas definidas pelas letras
gregas , , , e , (gama, alfa, mi, delta e psilon), respectivamente (J aneway &
Travers, 1997; USP, 2004) (Fig.1.7).

13





Figura 1.6 - Estrutura do anticorpo. Detalhe do iditipo constitudo por iditopos, do paratopo das
regies variveis leve e pesada e de sua ligao com o eptopo do antgeno. Observar as ligaes
por pontes dissulfeto S-S, a regio da dobradia, as cadeias leve e pesada e as extremidades amino-
terminal (N) e carboxi-terminal (C). Fonte: USP, 2004.




14


Imunoglobulina G

A IgG a principal imunoglobulina do sangue, respondendo por cerca
de 70 a 75% do total de imunoglobulinas. monomrica e a prpria classe de
anticorpo presente nas respostas imunes secundrias, quando so produzidas em
grande quantidade. So encontradas no sangue e lquido extracelular, onde podem
neutralizar toxinas, vrus e bactrias, opsoniz-los para fagocitose e tambm ativar o
sistema do complemento. a nica que atravessa a barreira placentria e confere
um alto grau de imunidade passiva ao recm-nascido. A IgG apresenta quatro
subclasses distintas: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, que possuem quatro cadeias pesadas
similares, porm no-idnticas, j que apresentam diferenas em suas estruturas,
tais como nmero de pontes dissulfdricas, seqncias de aminocidos e
propriedades biolgicas.

Imunoglobulina A

A IgA representa cerca de 10 a 15% das imunoglobulinas totais. a
imunoglobulina predominante nas secrees: saliva, lgrimas, secrees nasais,
colostro, leite, secrees traqueobrnquicas e gastrintestinais. Sua estrutura pode
variar, dando origem a duas subclasses: IgA1 e IgA2. A maior parte das IgA da
subclasse IgA1, a mais encontrada no soro, e a IgA2, mesmo em menor quantidade,
tem um papel importante, por se tratar da subclasse dominante nas secrees, nas
quais tem a funo de proteger a mucosa de agresses. No atravessa a barreira
transplacentria, mas, por sua grande concentrao no colostro, tudo indica que
contribua para a proteo dos recm-natos contra infeces, principalmente do tubo
gastrintestinal.
15
Imunoglobulina M

Representa 5 a 10% das imunoglobulinas totais. Apresenta-se na
forma de um pentmero e no possui subclasses. reconhecida como o anticorpo
precoce, visto ser a primeira imunoglobulina encontrada na resposta a um estmulo
antignico. Por isso, til no diagnstico diferencial das infeces virais ou
parasitrias agudas. a nica que o neonato sintetiza.

Imunoglobulina D

Representam menos de 1% das imunoglobulinas plasmticas.
Aparecem em grande quantidade na membrana dos linfcitos B circulantes. Sua
funo biolgica ainda no bem conhecida, mas parece desempenhar um papel
importante na diferenciao dos linfcitos antigenicamente estimulados, sendo um
dos principais receptores para antgenos na superfcie das clulas B.

Imunoglobulina E

Entre todas as classes de imunoglobulinas, a IgE encontrada em
menor quantidade. Pode ligar-se superfcie de basfilos e mastcitos atravs de
receptores, o que resulta na liberao de mediadores da resposta de
hipersensibilidade imediata. Tem um papel importante na imunidade ativa contra
parasitos, especialmente os helmintos, e nas doenas alrgicas.










16






































Figura 1.7 As classes de imunoglobulinas IgG, IgD, IgE, IgA e IgM.
Fonte: Kuby, 2002.
17

1.4 Mecanismos de Ao dos Anticorpos

A resposta imune humoral mediada por anticorpos secretados pelos
linfcitos B (Fig.1.8) leva destruio de organismos extracelulares e previne a
disseminao das infeces intracelulares. Dentre as principais maneiras pelas
quais os anticorpos contribuem para a imunidade esto a neutralizao, a
opsonizao, a facilitao da fagocitose, a ativao do sistema complemento e a
citotoxicidade mediada por clulas dependentes de anticorpo (ADCC, antibody-
dependent cell-mediated cytotoxicity), pela via clssica.

Neutralizao

A maneira mais simples e direta para os anticorpos protegerem contra
agentes patognicos ou seus produtos txicos pela ligao com estes, bloqueando
seu acesso s clulas que podem infectar ou destruir. Tal mecanismo conhecido
como neutralizao e protege contra toxinas microbianas e contra patgenos
intracelulares como os vrus, impedindo-os de penetrar nas clulas onde se
replicariam. Os anticorpos recobrem os stios txicos do agente antignico,
neutralizando-o.

Opsonizao

Em relao s bactrias que se multiplicam no meio extracelular,
apenas a ligao pelos anticorpos no suficiente para elimin-las. Neste caso, uma
funo do anticorpo a de permitir que a clula fagocitria, como neutrfilo e
macrfago, ingira e destrua a bactria. Alternativamente, os fagcitos possuem
receptores de membrana que reconhecem a regio Fc dos anticorpos IgG que
recobrem a bactria, resultando na fagocitose do complexo antgeno-anticorpo.
O mecanismo de revestimento de patgenos e de partculas estranhas pelos
anticorpos chamado de opsonizao (Fig.1.9).







18















Figura 1.8 Mecanismos de ao de anticorpos imunidade humoral.
O corpo produz clulas B com pequenas diferenas em seus receptores de superfcie (1). Quando
uma clula B encontra um antgeno para o qual tem forte afinidade (2), ela se torna ativada. Alm da
ativao, ela se prolifera rapidamente, produzindo muitas clulas plasmticas. Cada uma dessas
clulas secreta anticorpos especficos para a molcula estranha, o antgeno (3). Entre as etapas 2 e
3, os anticorpos produzidos pelas clulas B sofrem modificaes evolutivas estruturais, a fim de
tornarem-se mais especficos para o antgeno, aumentando sua afinidade de ligao.
Fonte: USP, 2005.























Figura 1.9 Opsonizao: A reao com os anticorpos no suficiente para conter a replicao de
bactrias que se multiplicam no meio extracelular. O anticorpo estimula a clula fagocitria a ingerir e
destruir o microorganismo. Os fagcitos reconhecem a regio constante dos anticorpos que recobrem
a bactria. Este processo de cobertura de germes patognicos e partculas estranhas pelos
anticorpos denominada opsonizao, que culmina com a fagocitose da clula bacteriana. Fonte:
USP, 2005.
19
Citotoxicidade Mediada por Clulas Dependentes de Anticorpo - ADCC

Diversas clulas, como as NK (Natural Killer), macrfagos, neutrfilos e
eosinfilos, possuem potencial citotxico e expressam receptores de membrana para
a regio Fc da molcula do anticorpo (IgG e IgE). A destruio pelas clulas NK de
clulas alvo recobertas por anticorpos denominada citotoxicidade mediada por
clulas dependentes de anticorpo (ADCC - antibody-dependent cell-mediated
cytotoxicity) e ocorre quando anticorpos ligados superfcie de uma clula interagem
com os receptores Fc nas clulas NK. Inicia-se ento a destruio citotxica das
clulas alvo atravs da liberao de grnulos citoplasmticos da clula NK contendo
perforinas e granzimas (J aneway & Travers, 1997) (Fig.1.10).

Figura 1.10 Citotoxicidade mediada por clulas dependentes de anticorpos: os receptores Fc ativam
as clulas linfides especializadas denominadas matadoras naturais ou natural killer (NK). A
destruio de clulas-alvo recobertas por imunoglobulinas por essas clulas NK chamada de
citotoxicidade mediada por clulas dependente de anticorpo (antibody-dependent cell-mediated
cytotoxicity, ADCC) e deflagrada quando anticorpos ligados superfcie de uma clula interagem
com receptores Fc nas clulas NK. TNF fator de necrose tumoral (tumoral necrosis factor). Fonte:
J aneway & Travers, 1997; USP, 2005.
20

Ativao do complemento

Uma outra funo dos anticorpos IgM e IgG a de ativar, pela via
clssica, um sistema de protenas plasmticas conhecido como complemento. Os
poros formados pelos componentes ativos do complemento podem destruir
diretamente os microorganismos. Alguns dos componentes do complemento so
opsoninas que se ligam ao antgeno alvo e direcionam os fagcitos que possuem
receptores especficos para estas, promovendo a fagocitose.

Leso fsica e leso qumica

As clulas podem morrer de duas formas diferentes. A primeira por
leso fsica ou qumica (quimiotaxia): o complemento induz a quimiotaxia pelos
neutrfilos e macrfagos, causando, assim, a migrao de grande nmero de
fagcitos para rea tecidual adjacente ao agente antignico e tambm por danos
causados membrana (leso fsica), pelo anticorpo e complemento, que levaro
desintegrao celular ou necrose.

A segunda forma conhecida como morte celular programada ou
apoptose, que leva a fragmentao do DNA, ruptura do ncleo e modificaes
na morfologia celular. A clula se autodestri de dentro para fora, contraindo-se e
degradando-se. Essa degradao tambm leva a destruio aos agentes
patognicos que nela se encontrem, como vrus, por exemplo. Desta forma, o
mecanismo de apoptose prefervel necrose como meio de eliminao celular,
pois, nesta ltima, os agentes patognicos intactos so liberados pela clula morta,
podendo dar continuidade infeco de clulas sadias, ou podem parasitar os
macrfagos que os ingeriram (J aneway & Travers, 1997).

21
2 - ANTICORPOS MONOCLONAIS

2.1 Anticorpos Monoclonais Murinos


A descoberta de Khler & Milstein, em 1975, refere-se ao processo de
produo de anticorpos monoclonais com afinidades especficas, que poderiam ser
empregados como frmacos ou direcionados a qualquer parte do organismo
humano, visando atingir um nico tecido ou mesmo um determinado tipo celular.
Isso foi possvel atravs da obteno dos hibridomas, que so clulas viveis,
originrias da fuso entre duas clulas que possuem caractersticas genticas
distintas. Utilizam-se clulas com caractersticas neoplsicas (tumorais),
denominadas clulas mielmicas, que tm a capacidade de reproduo indefinida,
podendo ser cultivadas in vitro, continuamente, por longos perodos. Essas clulas
no so capazes de secretar anticorpos. Uma segunda linhagem celular empregada
nesse processo, corresponde s clulas linfocitrias originrias do bao de um
animal previamente imunizado, denominadas clulas esplnicas ou linfcitos B, que
tm como caracterstica uma baixssima reprodutibilidade in vitro, porm so
essencialmente excelentes secretoras de anticorpos (Khler & Milstein, 1975).

Essas clulas linfocitrias so fusionadas com as clulas mielmicas
empregando-se a tcnica desenvolvida por Khler & Milstein (1975). Assim, so
geradas clulas hbridas, os hibridomas, que reuniro as caractersticas genticas de
ambas, ou seja, sero clulas capazes de se reproduzirem constitutivamente e
tambm secretarem anticorpos contra o antgeno especfico, aplicado previamente
na imunizao. Esses hibridomas so clulas derivadas de um nico clone, que
produzem e secretam imunoglobulinas idnticas, as quais denominamos anticorpos
monoclonais. Estes anticorpos interagem especfica e exclusivamente com aquele
determinante antignico usado como imunizante (Silverton, 1977) (Fig.2.1).

O desenvolvimento da tecnologia de obteno de anticorpos
monoclonais foi extremamente importante para a compreenso de respostas
imunes, diversidade de imunoglobulinas, respostas primria e secundria e
hipermutao somtica, ou seja, a mudana na seqncia da regio varivel do
22
anticorpo produzido por uma clula B, aps estmulo antignico, levando a um
aumento na sua afinidade para o referido antgeno. Constitui o meio mais especfico
para a identificao e determinao de variaes antignicas de tipos e subtipos de
um mesmo agente etiolgico, aplicao esta invivel para os soros policlonais, em
funo da reatividade cruzada causada por antgenos comuns dominantes e
conseqentemente a sua baixa especificidade.

A preparao de hibridomas constituiu um marco na imunoqumica.
um processo laborioso, porm com muitas possibilidades. A primeira aplicao
dessa tecnologia foi a produo de anticorpos monoclonais para substituir, em
grande parte dos ensaios, os anticorpos policlonais obtidos por meios
convencionais. Talvez a sua mais importante contribuio tenha sido ajudar a
compreender alguns processos imunes e possibilitar a manipulao in vitro dos
anticorpos. Com o desenvolvimento da biologia molecular, tornou-se possvel a
sntese do anticorpo monoclonal, que permitiu a dissecao das respostas do
sistema imune contra antgenos especficos. Ajudaram tambm na compreenso da
estratgia que um animal faz uso para produzir anticorpos de alta afinidade. Dessa
forma, pde-se entender e descrever o processo de maturao da resposta imune.
Este processo pode ser resumido do seguinte modo: os anticorpos que se produzem
em seguida a uma estimulao antignica, caracterizando a resposta primria, so
diferentes daqueles que se originam como resultado de uma segunda estimulao, a
resposta secundria e tambm da hiperimunizao, que o resultado de mltiplas
inoculaes. Depois de cada estmulo, h uma melhora da especificidade (carter
complementar) e da afinidade (fora de ligao) do anticorpo com relao ao
antgeno.

Os anticorpos monoclonais possuem diversas aplicaes no
tratamento e diagnstico de diversas doenas e podem ser utilizados como
marcadores celulares, moduladores da rejeio em pacientes transplantados, na
desintoxicao por drogas, na composio de conjuntos de reativos (kits) para
diagnstico como por exemplo, sarampo, dengue 1, 2, 3 e 4, hepatite A, B e C,
Ieptospirose, febre amarela e na terapia de uma grande variedade de doenas
auto-imunes, como artrite, lpus eritematoso, anemia e asma (Hon, 2004).


23

Figura 2.1 Cicl uo de anticorpos monoclonais. Meio HAT: Hipoxantina, Aminopterina o de prod
e Timidina. Fonte: Kuby, 2002.



24

2.2 Anticorpos Monoclonais Quimricos e Humanizados
O principal problema da aplicao de anticorpos monoclonais em seres
humanos a
or meio da fuso dos segmentos do DNA codificante das cadeias
variveis leve
ssim, com o objetivo de minimizar a resposta imune do hospedeiro,
props-se a humanizao de anticorpos. Os protocolos mais modernos de
ara a construo de um anticorpo humanizado, uma poro constante
F
C
fusionad

reao imunognica gerada pelo paciente, em funo da presena de
molculas murinas em seu organismo. Na dcada de 80, foram iniciados trabalhos
visando tornar os anticorpos monoclonais com caractersticas mais humanas e,
dessa forma, menos imunognicos. Com o desenvolvimento das tcnicas de biologia
molecular (tecnolgia do DNA recombinante) e sua integrao com a tecnologia de
hibridomas, foi possvel proceder as primeiras tentativas de reduzir esse potencial
imunognico, causado pelos anticorpos monoclonais heterlogos (Roque, 2004).

P
e pesada de um anticorpo murino, especficos para um determinado
antgeno, com os segmentos do DNA codificante das cadeias constantes humanas,
formaram-se molculas quimricas, denominadas anticorpos quimerizados. Essas
molculas eram ainda imunognicas e geravam uma reao imunolgica com
anticorpos humanos anti-quimricos, identificada como resposta HACA (human anti-
chimeric antibody) (Glennie & J ohnson, 2000; Mirick et al., 2004). Em outras
palavras, a poro murina ainda se encontrava em concentraes suficientes para
gerar reao imunognica no organismo hospedeiro (Maranho & Brgido, 2001).

A
humanizao preconizam o transplante das CDRs murinas (CDR-grafted) para as
cadeias variveis da estrutura da molcula de um anticorpo humano (Roque, 2004).
Como resultado, obtm-se uma molcula que possui afinidade e especificidade
caractersticas da original murina para o antgeno alvo, porm com uma mnima
poro murina em sua composio.

P
a a uma regio de domnio varivel, desenhada de forma tal que sua
seqncia de aminocidos seja a mais prxima possvel da regio homloga do
anticorpo humano. Essa molcula mantm as cadeias constantes da imunoglobulina
humana, podendo receber as cadeias variveis V
H
e V
L
murinas tornando-se um
25
anticorpo quimrico ou recebendo somente as CDRs murinas transplantadas para as
referidas cadeias variveis tornando, dessa forma, a molcula suficientemente
invisvel para o sistema imune do paciente que a receber, diminuindo
sensivelmente sua imunogenicidade ou suprimindo-a completamente. O limite desse
processo se obter uma molcula o mais humana possvel, sem que esta perca a
sua atividade biolgica original (Fig.2.2).



igura 2.2 Ciclo de Humanizao Anticorpos Murinos, Quimricos e Humanizados:
epetitivo como














F
Um anticorpo monoclonal murino (em verde) apresenta limitaes quanto ao seu uso r
frmaco, devido resposta HAMA. As primeiras tentativas de minimizar este potencial imunognico
foram feitas por meio da fuso das cadeias variveis leve e pesada do anticorpo do camundongo (em
verde escuro), com as cadeias constantes humanas (em laranja), formando molculas quimricas.
Essas molculas eram ainda imunognicas ocasionando a resposta HACA. Assim, os protocolos mais
modernos de humanizao preconizam o transplante das CDR murinas (linhas verdes) para cadeias
variveis humanas (em amarelo). Essa molcula teria ainda as cadeias constantes de
imunoglobulinas humanas como na quimera e se apresenta de forma suficientemente invisvel,
passando praticamente despercebida para o sistema imune, gerando baixa ou nenhuma reao.
Fonte: Maranho & Brgido, 2001.



26


2.3 Outras Estratgias para Gerao de Anticorpos Monoclonais
lm dos anticorpos quimricos e dos humanizados, outras
alternativas e
uitos fatores influenciam na imunogenicidade de determinados
anticorpos ter
com Fins Teraputicos


A
xistem para a produo de anticorpos totalmente humanos, bem como
de reagentes derivados de anticorpos humanos. Atravs do isolamento de genes
codificantes de vrias regies humanas, como na biblioteca de anticorpos em fagos
e por meio da tecnologia do DNA recombinante, obtm-se um anticorpo monoclonal
integralmente humano da classe IgG (Vaughan, 1998) (Fig.2.3).

M
aputicos. Alguns so inerentes sua construo, ao passo que outros
so relacionados maneira como esses anticorpos so administrados ou como o
paciente responde. At hoje, no h mtodo adequado in vitro que possa predizer a
imunogenicidade in vivo de anticorpos construdos, e os ensaios clnicos so ainda o
nico meio seguro e eficaz de avaliar se o anticorpo ou no imunognico. As
respostas human anti-humanized antibody HAHA, contra os anticorpos
humanizados administrados aos pacientes, podem apresentar formas diferentes, que
variam de hospedeiro para hospedeiro. Seria desejvel desenvolver um mtodo
sensvel, especfico e rpido para avaliao da HAHA, que permita discriminao
entre os tipos de resposta imune que so prejudiciais ao paciente, de forma a exigir
a interrupo do tratamento com os anticorpos que gerem esse tipo de resposta. O
desenvolvimento desse novo mtodo permitiria o tratamento prolongado com
anticorpos humanizados, oferecendo total segurana aos pacientes (Ritter et al.,
2001; Mirick et al., 2004).











27


Figura 2.3 Comparao entre os mtodos de Produo de Anticorpos Monoclonais. Pelo mtodo
adicional ou atravs da tecnologia do DNA recombinante, o anticorpo monoclonal final uma IgG tr
completa. Pelo mtodo da biblioteca genmica em fagos, o painel dos monoclonais so em formato
scFv ou Fab. Isso facilita engenharias posteriores para alcanar a caracterstica desejada. Em todos
os casos, os anticorpos monoclonais candidatos clnica requerem reclonagem em vetores de
expresso em clulas de mamferos e estabelecimento da produo em cultura celular. Fonte:
Vaughan, 1998.
28
2.3.1 Anticorpos monoclonais obtidos por biblioteca genmica


A biblioteca de expresso em fagos pode imitar a estratgia utilizada
pelo sistema imune humoral para produzir anticorpos ou fragmentos de anticorpos
completamente humanos in vivo e pode evitar a imunizao e a construo de
hibridomas. Um pr-requisito est no isolamento e clonagem da regio varivel dos
genes das cadeias leve e pesada da imunoglobulina para apresent-la
funcionalmente em um fago (Fig.2.4).

A fonte dos genes dos doadores da imunoglobulina pode ser animal ou
humana, imunizada ou no imunizada. Pequenas bibliotecas de fontes de animais
imunizados geralmente promovem anticorpos de grande afinidade para o antgeno
(Roque, 2004).







Figura 2.4 - Biblioteca de expresso genmica em fagos. A - Isolar a populao de
genes que codificam regies variveis de cadeia leve - V
L
- e pesada - V
H
- de anticorpo. B -
Construir protena de fuso da regio V com uma protena de cobertura de bacterifago. C - A
clonagem de uma populao randomizada de regies variveis d origem a uma mistura de
bacterifago uma biblioteca de expresso em fago. D Selecionar o fago com regies V
desejadas mediante a ligao especfica com o antgeno. Adaptao da Fonte: J aneway &
Travers, 1997.

Fagos so estruturas virais constitudas por uma molcula de cido
nuclico, que pode ser DNA ou RNA, envolvida por um capsdeo. Para se replicarem
precisam infectar uma clula, que em geral apresenta stios receptores especficos
para determinados vrus. A interao clula-vrus especfica.

Fagos semelhantes a anticorpos podem ser produzidos por uma nova
tcnica para produo de molculas semelhantes. Os segmentos genticos que
29
codificam domnios variveis que se ligam ao antgeno (domnios V dos anticorpos),
ago
smas fuses de genes so usados para
s resultantes tm capsdeos que expressam
egundo a qual os anticorpos
especficos para um dado antgeno podem ser isolados de uma mistura complexa











As regies V
H
e V
L
so amplificadas por PCR. Combinao de
genes V
H
e V
L
. Formao da biblioteca genmica de anticorpos
a partcula antgeno-
ligante monoclonal anloga a um anticorpo monoclonal. Os genes codificantes do
stio ligante a
so fusionados com os genes responsveis pela protena do capsdeo de um f
ou bacterifago. Aqueles que contm as me
infectar bactrias, e as partculas fgica
a protena de fuso semelhante ao anticorpo, com o domnio varivel exposto por
fora do fago. Uma coleo de fagos recombinantes, cada um deles exibindo um
domnio antgeno-especfico diferente em sua superfcie, conhecida como sendo
uma biblioteca de expresso em fago (Fig.2.5).

Quase que da mesma maneira s
por cromatografia de afinidade, os fagos que expressam domnios antgeno-
especficos para uma substncia em particular podem ser isolados na biblioteca de
expresso em fago, por sua ligao quele antgeno.





Figura 2.5 Triagem de anticorpos para formar biblioteca de
expresso em fagos. As clulas B so isoladas dos doadores.
em fagos. Adaptao da fonte: UFMG 2005.

As partculas fgicas ligantes so recuperadas e usadas na infeco de
novas bactrias. Cada fago isolado produzir desta maneira um
o antgeno, nicos para cada fago, podem ser ento recuperados do
DNA fgico e usados na construo de genes para uma molcula de anticorpo
30
completa, mediante sua unio com os segmentos genticos que codificam as
regies constantes de um anticorpo.

Quando tais genes reconstrudos so introduzidos numa linhagem
celular hospedeira apropriada, como as clulas mielomatosas no secretoras de
anticorpos usadas nos hibridomas, as clulas transfectadas secretam anticorpos
com todas as caractersticas dos anticorpos monoclonais originrios dos hibridomas.
Em uma ltima anlise, esta tcnica pode vir a substituir a rota tradicional de fuso
celular para a produo de anticorpos monoclonais.
o utilizado. Vrias estratgias
tm sido utilizadas para se alcanar esse xito e se baseiam em obter uma
iblioteca inicial de tamanho igual ou superior ao repertrio imune (em torno de 10
7
),
uscando melh variveis
os anticorpos (Brgido & Maranho, 2002) (Fig.2.6).





O desempenho do reagente fgico obtido quanto sua capacidade de
reconhecimento do antgeno depende de dois fatores fundamentais: primeiro, o
tamanho da biblioteca inicial, isto , a capacidade de representar o repertrio do
animal imunizado; segundo, o procedimento de sele
b
b or eficincia de transformao e de amplificao dos genes
d
31




Figura 2.6 - Seleo de ligantes da biblioteca de expresso em fagos:
Seleo de ligantes de uma biblioteca utilizando-se o antgeno adsorvido em placa de
microtitulao. Bibliotecas de formas variantes do gene de interesse so obtidas e clonadas
em fagomdios para incorporao do peptdeo ao capsdeo viral. As partculas virais de fuso
apresentando a biblioteca so produzidas e colocadas em contato com o antgeno fixado a
um suporte. Sucessivas lavagens so rea adas e os fagos remanescentes so eludos da
placa e amplificados por meio de infeco de clulas bacterianas. Fonte: Brgido &
Maranho, 2002.

liz
32
2.3.2 Anticorpos monoclonais obtidos em camundongos
transgnicos

Uma alternativa estratgica para produzir anticorpos construdos
completamente humanos oferecida pela tcnica da transgenia em camundongos.
Camundongos que no possuem genes de imunoglobulinas endgenas podem ser
tornados transgnicos para os loci das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina
humana, utilizando cromossomos artificiais de levedura. Isso possvel substituindo-
se os loci da imunoglobulina murina do genoma do hospedeiro pela respectiva
regio da imunoglobulina humana. A hiperimunizao dos animais transgnicos com
um antgeno tumoral resulta na ativao clonal dos linfcitos B, produzindo assim
anticorpos humanos. Desafiando o antgeno de interesse contra o camundongo
transgnico, pode-se gerar anticorpos de afinidade. A imortalizao das clulas B
expressando esses anticorpos pode ser obtida pela tecnologia padronizada de
hibridizao, resultando na produo de anticorpos totalmente humanos a partir de
clulas de linhagem estabelecida (Krauss, 2003).

codificados pelos
genes
human
monoc
Os camundongos transgnicos tm sido especialmente teis no estudo
do papel dos receptores de clulas T e B no desenvolvimento dos linfcitos
(Vaughan, 1998).







As clulas B desses camundongos tm receptores
de imunoglobulinas humanas, mas no so tolerantes maioria das protenas
as. Assim, possvel induzir nestes camundongos, a produo de anticorpos
lonais humanos, contra determinantes de clulas ou protenas humanas.

33
2.4 Anticorpos Monoclonais para Uso Teraputico

Os anticorpos se ligam s molculas-alvo com grande afinidade e
especificidad

eira aplicao de um anticorpo
monoclonal murino, o Orthoclone OKT3 anti-CD3. Este foi o primeiro anticorpo
reconhecido

os negativos em funo da sua alta toxicidade e imunogenicidade.
or serem de origem murina, o sistema imunolgico reconhecia a molcula como
estranha, iniciando um processo de reao imune no organismo do hospedeiro
ontra a molcula do anticorpo aplicado. A este processo de resposta imunolgica
humoral mediada por anticorpos, dado o nome de resposta HAMA (Glennie &
ohnson, 2000; Mirick et al., 2004). Descobriu-se ento que o anticorpo monoclonal
urino apresentava limitaes quanto ao seu uso repetitivo como frmaco, devido
resposta imune humana ao anticorpo de camundongo. O Orthoclone permaneceu
por cerca de oito anos como sendo o nico anticorpo monoclonal bem sucedido.
Alm do Orthoclone OKT3 anti-CD3, outros anticorpos murinos foram propostos
como imunossupressores, numa forma alternativa contra outros marcadores
e. Embora produzidos naturalmente pelo sistema imune, a necessidade
de anticorpos com especificidade nica produzidos em larga escala tem estimulado
a gerao de novas tecnologias para a sua produo em escala biofarmacutica. A
produo de anticorpos pela tecnologia de hibridomas murinos foi o primeiro passo
no sentido de iniciar-se o desenvolvimento de sistemas de engenharia de anticorpos.

Havia uma grande expectativa quanto ao uso de anticorpos como
poderosa ferramenta em imunoterapias. Sendo identificados h mais de um sculo
como potenciais agentes teraputicos sugerindo possibilidades de tratamento, antes
impensveis, para diversas doenas, os anticorpos monoclonais representavam a
soluo para qualquer enfermidade e a esperana de cura.

Em 1986, o FDA aprovou a prim
e oficialmente aprovado para reverter o quadro de rejeio a
transplantes de rgos, introduzido na clnica mdica (Moro & Rodrigues, 2001). Sua
aprovao iniciou uma grande expectativa para o uso clnico de anticorpos
monoclonais (Fig.2.7).
Porm, apesar do grande potencial, a esperada revoluo teraputica
no se confirmou. Diversos anticorpos monoclonais entraram em ensaios clnicos e
obtiveram resultad
P
c
J
m
34
celulares, a saber, o anti-CD4 e o anti-CD18. Este ltimo foi humanizado
lar da Universidade
de Braslia - UnB. indicado
meningite bacteriana,
(Cosimi et al., 1981) aprovado em 1986; Edrecolomab Panorex, indicado para
cncer de clon aprovado somente na Al
Tiuexetan anti-CD20,
recentemente pelo grupo do Laboratrio de Imunologia Molecu
na terapia de rejeio de transplantes, em casos de
isquemia, reperfuso cardaca e inflamao aguda (Maranho
& Brgido, 2001; Caldas et al., 2003).

Hoje em dia, existe uma srie de anticorpos monoclonais murinos
aprovados pelo FDA, entre eles, Muromonab OKT3 para rejeio a transplantes
emanha em 1995; Zevalin Y-Ibritumomab
aprovado em 2002; e Bexxar I-Tositumomab anti-CD20,
aprovado em 2003 (Harris, 2004; Roque, 2004) (Tab. 2.1).

Figura 2.7 Chave de eventos e fatos marcantes na indstria teraputica de anticorpos monoclonais.
Adaptao de Glennie & J ohnson, 2000.

Passou-se ento a pesquisar mecanismos para tornar esses anticorpos
menos imunognicos, proporcionando maior segurana na sua aplicao.
35
Com o advento da biologia molecular e da engenharia gentica, outras
abordagens e estratgias foram criadas para tentar resolver esse problema. So
construdos anticorpos praticamente invisveis ao sistema imunolgico do
hospedeiro, evitando-se desta forma reaes adversas como alergias e anafilaxia
em tratamentos prolongados. A alta afinidade e especificidade destes, aliados
engenharia molecular, tm sido largamente explorada numa grande variedade de
aplicaes. D
, 1991).

o em


noclonais possa ser impulsionado no combate a
utras doenas causadas por protenas anormais, como o Mal de Alzheimer. Esses
anticorpos s
A manufatura de anticorpos teraputicos envolve vrias etapas,
reguladas por procedimentos bem estabelecidos e leva cerca de 10 anos ou mais
para se chegar a um produto comercialmente aprovado. A aprovao desses
produtos biofarmacuticos muito criteriosa por parte do FDA e outras agncias
regulatrias.

e fato, a maioria dos anticorpos destinados aplicao na teraputica
de doenas tem origem na engenharia gentica. So exemplos os quimricos, onde
as regies constantes do animal so substitudas pelas homlogas de origem
humana e os anticorpos human-like (como humano ou humanizados) CDR-
grafted (CDR transplantada) que so aqueles onde s h uma pequena frao
murina, reduzindo assim sua imunogenicidade (Co & Queen

Em 1980, dois anticorpos foram submetidos a ensaios clnicos e desde
ento esse nmero vem aumentando consideravelmente nos ltimos 25 anos.
Atualmente, cerca de 200 anticorpos monoclonais e seus derivados est
ensaios clnicos, visando o tratamento de diversas doenas. Diversos outros
alcanaram o mercado. O tratamento com anticorpos na rejeio de transplantes,
nas doenas auto-imunes e em diversas formas de cncer, como os melanomas, o
Linfoma No-Hodgkin e o cncer colorretal, tem potencial teraputico evidente e
baixa ou total ausncia de toxicidade (Hon, 2004).
No ano de 2003, descobriu-se que anticorpos monoclonais podem
neutralizar os prions causadores de uma variante da Doena de Creutzfeldt-J acob
em camundongos infectados. Com base nesses resultados, estima-se que o
desenvolvimento de anticorpos mo
o
o potenciais candidatos humanizao (White et al., 2003).

36

Tabela 2.1 - Seleo de alguns anticorpos monoclonais j aprovados pelo
FDA americano (exceto o Panorex, que foi aprovado pela agncia regulatria
da Alemanha) para uso teraputico ou diagnstico in vivo.
INDICAO ANTGENO
ALVO
ANTICORPO CARACTERSTICA FABRICANTE /
PAS
APROVAO

Rejeio a
transplantes

CD3

Orthoclone OKT3
Muromonab

Murino (IgG2a)

Ortho Biotech /
USA

FDA 1986
Complicaes de
angioplastia
coronria
Glicoprotena
receptor GP II
b

GPIII
a

ReoPro Abciximab

Quimrico (Fab)

Centocor B.V.
Holanda

FDA 1994

Cncer colon-retal

17-IA antgeno de
superfcie celular

Panorex
Edrecolomab


Murino (IgG2a)

Centocor B.V. /
Holanda
Glaxo Wellcome /
USA

Aprovado na
Alemanha em
1995
**Agente de
contraste para
imagem cardaca

Miosina
Myoscint Imciromab
Pententate

Murino

Centocor B.V. /
Holanda

FDA 1996
**Agente de
imagem
diagnstica para
detectar o cncer
de prstata
o
especfico de
ProstaScint
Capromab

Murino

Cytogen Corp. /


FDA 1996
PSMA Antgen
membrana da
prstata
Pendetide USA
**Agente de
contraste de
imagem para
deteco de
cncer colorretal


nd


CEA-SCAN
Arcitumomab


Nd


Immunomedics
Inc. / USA


FDA 1996
**Agente de
imagem para
detectar cncer
em clulas
pulmonares


nd

Verluma
Nofetumomab


Murino

Dr. Karl Thomae
/ Alemanha


FDA 1996

Rejeio aguda a
transplantes de
Rim


CD25

Zenapax
Daclizumab


Humanizado (IgGl)

Hoffman-
La Roche Inc. /
USA


FDA 1997
Linfoma No-
Hodgkin LNH

CD20

Rituxan, Rituximab

Quimrico (IgGl)
Genentech Inc. /
USA

FDA 1997

oena de Crohn

TNF-

Remicade,

Quimrico (IgGl)

Centocor Inc. /

FDA 1998 D
Infliximab Holanda
Rejeio aguda a
transplante de rim

CD25
Simulect
Basiliximab

Quimrico (IgGl)
Novartis Pharm. /
USA

FDA 1998
Vrus RSV
Eptopo do vrus
respiratrio
sincicial

Protena F

Synagis
Palivizumab

Humanizado (IgGl)

MedImmune /
USA

FDA 1998

Cncer de Mama

HER2/neu
Herceptin
Trastuzumab

Humanizado (IgGl)
Genentech Inc. /
USA

FDA 1998

Artrite
Reumatide

TNF-

Remicade Infliximab

Quimrico (IgGl)

Centocor Inc. /
Holanda

FDA 1999

Anemia Mieloide

CD33
Mylortag
Gemtuzumab

Humanizado

Wyeth Pharms. /
Aguda / Leucemia Ozogamicin USA

FDA 2000
Clulas B
Leucemia crnica
linfoctica
Millenium and
CD52 Campath
Alemtuzumab
Humanizado Illex Partners /
USA
FDA 2001

LNH

CD20
Zevalin
Y-Ibritumomab
tiuexetan

Murino rdio-marcado
IDEC
Pharmaceuticals
/ USA

FDA 2002

Artrite
Reumatide

Receptor de fator
de necrose
tumoral humana

Humira Adalimumab
Humano (desenvolvido
em biblioteca
genmica de fagos
Phage-Display)

Abbott
Laboratories /
USA


FDA2002
TNF
37
Tabela 2.1 (cont.)
INDICAO ANTGENO
ALVO
ANTICORPO CARACTERSTICA FABRICANTE /
PAS
APROVAO
Psorase severa
de placas

nd

Raptiva Efalizumab

nd

Genentech / USA

FDA 2003
Asma nas
manifestaes
moderada e

Impede ligao da
IgE com o receptor

Xolair
Omalizumab


Humanizado

Genentech Inc. /
US

severa Fc RI
A

FDA 2003
Tratamento de
pacientes com
C
Be ar
Murino rdio-marcado LNH
D20
+
refratrios
ao Rituxan


CD20

xx
I-Tositumomab



Corixa
Corporation /
USA


FDA 2003
Cncer colorretal
em metstase
cabea, pescoo, EGFR eptor Erbitux tuximab Quimrico ImClone S s FDA 2004
carcinoma de
clulas de pulmo
Domnio
extracelular do
ec R
de Fator de
Crescimento
Epidrmico


Ce




ystem
Inc. / USA


Fator de Inibio da
atividade biolgica
do
crescimento

Bevacizumab

Humanizado
Crescimento
Vascular
Endotelial tumor
slido / cncer
colorretal em
metstase
receptor de
fator de
vascular endotelial
VEGFR

Avastin





Genentech Inc. /
USA



FDA 2004
Esclerose Mltipla Sub -4 / 41
integrinas
Tysabri
Natalizumab Humanizado IgG4 FDA 2004
Biogen Idec Inc. /
USA


arcador para
apendicite
M
Technetium 99m Tc
Fanolesomab Murino tecncio-
marcado
Palatin
Technologies / FDA 2004

nd
Neutrospect

USA

** utilizados para diagnstico in vivo divulgado. Adaptao das Glennie &
Harris, 2004; FDA, 2005).




. nd no Fontes: (
J ohnson, 2000;
38

3 - SISTEMAS DE PRO ANTICORPOS MONOCLONAIS
HU ZADOS

3 mas xpre ro

o mo c ima nis
ros, podem ser utilizados para a obteno
m is (Fig.3.1).







Figura 3.1 Ciclo de humanizao de anticorpos e alguns sistemas de expresso utilizados.
Fonte: BRGIDO 2004.

A tecnologia de cultivo de clulas animais vem sendo utilizada h muito
tempo, especialmente na produo de vacinas para uso humano e veterinrio.
Diversos processos utilizando essas clulas como hospedeiras so atualmente
empregados na indstria biofarmacutica para produo de protenas teraputicas,
como por exemplo, fatores de coagulao, anticorpos monoclonais, eritropoetina,
entre outros (Tonso, 2000).

Hospedeiros procariotos (clulas bacterianas) so utilizados devido
sua simplicidade gentica e existncia de vetores de expresso definidos e
potentes. Contribuem para a utilizao de clulas de origem bacteriana, como a
Escherichia coli, a facilidade de cultivo e a alta produtividade que apresentam em
processos de fermentao, viabilizando a obteno de protenas simples e de
pequeno tamanho. A insulina humana e hormnios de crescimento podem ser
DUO DE
MANI
.1. Siste de E sso de P tenas Heter logas

Divers
plantas e glndulas mamrias de mamfe
de anticorpos
s sistemas de
onoclona
expresso co lulas an is, microorga mos,






39
enquadrados entre estas. Porm, esses hospedeiros no so empregados para a
produo de protenas de grande complexidade e tamanho, como os anticorpos
s
carboxilao, amidao, sializao, acetilao,
ulfatao e formao de ligaes de enxofre (Mains et al., 1987).
Com isso, o uso de organismos procariotos como hospedeiros traz
nes

otena recombinante sintetizada.

A glicosilao exerce um papel fundamental na adeso intercelular e
clulas de animais como sistema
ospedeiro. um processo que ocorre em clulas eucariticas, no qual os
deos se adicionam protena durante sua sntese. So processadas no
etculo endoplasmtico e no aparelho de Golgi (Kratje, 2004). A pouca similaridade,
usncia ou deficincia da glicosilao, ou seja, de realizar adequadamente as
dies de acar, em clulas bacterianas podem refletir na inatividade e
ntetizada de interesse, podendo limitar a
lcanti,

o glicosiladas degradam-se muito rapidamente (Kratje,
2004). Por essa razo, na produo de molculas que necessitam da glicosilao
para aprese
monoclonais, por impossibilidade de realizao das modificaes ps-traducionai
como glicosilao, fosforilao,
s

uma srie de limitaes que dificultam o processo de expresso heterloga de ge
de natureza eucariota, por no processarem adequadamente a informao gentica
e no configurarem corretamente a pr
oferece uma enorme vantagem ao uso das
h
oligossacar
r
a
a
suscetibilidade biolgica da protena si
aproximao de outras macromolculas superfcie do produto obtido (Cava
2003).
As cadeias polissacardicas ligadas protena alvo tm vrias funes.
Algumas protenas no podem se enovelar a menos que estejam glicosiladas.
Polissacardeos ligados ao nitrognio amilado da asparagina na protena conferem
estabilidade sobre algumas glicoprotenas secretadas. A ligao pela hidroxila em
resduos de serina e treonina gera as O-glicoprotenas. Vrios experimentos
demonstram que protenas n
ntarem uma funo normal, necessrio o uso de organismos que
realizem, o mais similar e corretamente possvel, as adies de acar.

Anticorpos monoclonais recombinantes so administrados, de uma
forma geral, por via parenteral. A presena de oligossacardeos tende a conferir mais
40
resistncia a uma glicoprotena contra sua digesto por proteases, o que, em
contrapartida, lhe confere maior estabilidade na corrente sangunea.

Adicionalmente, o uso de clulas de mamferos para a produo de
biofrmacos favorecido pelo fato de que grande parte destas clulas libera para o
eio extracelular a protena de interesse, ou seja, o produto desejado, ao contrrio
da maioria d
uela de real
interesse, podendo assim prejudicar sua funo biolgica. As clulas animais, por
outro lado,
do sistema de cultivo e pelo rompimento das bolhas de ar na superfcie do
lquido) (Tonso, 2000; Castilho, 2001; Cavalcanti, 2003).
ito elevado
(Fig.3.2).
m
as bactrias que retm a protena intracelularmente, sob forma de
corpos de incluso. Isto acarreta um alto custo de purificao da molcula em
questo, pois a clula bacteriana ao ser rompida, libera diversas protenas
bacterianas constituintes, dificultando a separao e purificao daq
secretam as protenas para o meio extracelular com reduzidas
concentraes de protenas, podendo ser separadas do produto de interesse, sem
ter seus componentes intracelulares extravasados para o meio (Cavalcanti, 2003).

Por outro lado, as desvantagens do processo de uso de clulas animais
so: (a) baixa velocidade especfica de crescimento; (b) requerimentos nutricionais
complexos; (c) inibio decorrente do acmulo de subprodutos do prprio
metabolismo, como o lactato e a amnia; (d) fragilidade estrutural da membrana
celular (clulas sujeitas ao cisalhamento, por exemplo, pelo atrito com as paredes
internas

A escolha de um sistema de expresso deve ser feita de forma a
obedecer alguns critrios. A aplicao da protena desejada a ser expressa deve ser
sempre considerada. A otimizao do rendimento na obteno do produto expresso
nos diferentes sistemas de fundamental importncia. O sistema deve ser capaz de
expressar a protena recombinante heterloga de modo a se obter o mximo de
rendimento por clula cultivada e paralelamente, estudar e monitorar a influncia dos
parmetros do sistema de produo sobre o nvel de expresso da protena,
melhorando a taxa de rendimento por litro de cultura, a um custo no mu

41
Manter a alta densidade celular uma das variveis a serem
superadas. So aplicados sofisticados modelos matemticos e programas de
computao para executar o clculo e analisar todos os parmetros inerentes
adio de n
-Podem ser produzidas em grandes quantidades.
-So de fcil
-O material produzido pode no ser autntico (depende das modificaes ps-
traducionais)
cumulao do produto recombinante.
-Processos de recuperao do produto.
-Processos de purificao.

utrientes concentrados, na proporo da taxa de consumo, como
estratgia para aumentar a densidade celular nos processos e controle rigoroso dos
metablitos secundrios (Lemes, 1998).

Como foi descrito anteriormente, h diversas aplicaes para o uso de
protenas heterlogas, ditas tambm recombinantes, entre elas, a pesquisa em
estrutura e funo da protena, imunizaes, anticorpos monoclonais teraputicos,
vacinas, hormnios, fatores de coagulao, diagnstico, cosmticos, entre outros.

As protenas recombinantes apresentam vantagens como:

purificao, comparadas com o tecido de origem.
-O risco de transferncia de patgenos e material oncognico reduzido.

Desvantagens:

-Podem ser imunognicas.
-Podem conter contaminantes pirognicos.
.

Aspectos de relevncia na expresso de protenas heterlogas:

-Escolha da clula hospedeira (microbiana, inseto ou mamfero).
-Escolha do vetor de expresso.
-Uso de um promotor forte e regulvel.
-Condies de cultivo e expresso.
-Stio de a
42
Sistemas alt
r Ovary - CHO, Baby Hamster Kidney -
HK)
-Clulas de in
Caractersticas desejveis da clula hospedeira para produo de protenas
heterlogas
rescimento rpido.
vo de caractersticas simples e de
er capaz de receber DNA exgeno.
ulturas.












ntes sistemas de expresso. Fonte: Lemes, 2004.
ernativos para expresso de protenas recombinantes:

-Procariotos (como bactrias Escherichia coli, Bacillus subtilis, Caulobacter).
-Leveduras (como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris).
-Fungos filamentosos (Aspergillus, Trichoderma).
-Clulas de mamferos (Chinese Hamste
B
setos (Baculovrus Autographa california).
-Animais transgnicos (roedores, sunos, caprinos, ovinos, bovinos).
-Plantas transgnicas (milho, soja, tabaco, trigo, banana).

:

-C
-Capacidade de crescimento em um meio de culti
baixo custo.
-No ser nocivo ou patognico.
-S
-Ser estvel em c


Figura 3.2 - Relao custo/rendimento em difere


43
3.1.1 Vantagens e desvantagens dos vrios sistemas para
so de protenas admitem uma
s e desvantagens na
expresso heterloga de protenas:


Os sistemas alternativos empregados para expres
srie de vantagens e desvantagens que esto expostas na tabela 3.1:


Tabela 3.1 - Principais sistemas e suas vantagen
expresso de protenas de interesse biotecnolgico:
Bactrias (Escherichia coli):
Vantagens: Desvantagens:
-fcil crescimento -no fazem modificaes ps-traducionais
-alto rendimento da protena heterloga -precipitado insolvel intracelular (formam
corpos de incluso) expressa
-fisiologia, bioqumica e gentica bem
conhecidas
-apresentam endotoxinas (Lipopolissacardeos
LPS)
-baixo custo -induo de protelise e destruio da protena
expressa
-formao de ligaes sulfeto limitadas
Leveduras (Pichia pastoris):
Vantagens: Desvantagens:
-fcil aumento de escala (scale-up) -secreo ineficiente de protenas complexas
-integrao estvel em mltiplas cpias -poucos vetores disponveis
-glicosilao com alguma similaridade de
mamferos

-no fermentadora
-induo controlada em altas densidades
celulares

-altos nveis de expresso (at 12g/L)
Fungos filamentosos (Aspergillus niger):
Vantagens: Desvantagens:
-facili e cultivo em larga escala -grande quantidade de proteases dade d
-secreo (purificao facilitada) -difcil manipulao
-capazes de realizar algumas modificaes ps-
aducionais
-vetores no disponveis ausncia de
plasmdeos tr
-alta expresso na maioria das vezes -a protena de interesse nem sempre
produzida em altos nveis
44
Tabela 3.1 (cont.)
Clulas de mamferos (Chinese Hamster Ovary CHO):
Vantagens: Desvantagens:
-grande versatilidade na produo de diferentes -baixa velocidade especfica de crescimento
classes de protenas heterlogas
-amplo conhecimento de cultivo com meios -ausncia de parede celular (c
quimicamente definidos
lulas frgeis,
principalmente quando expostas ao do
cisalhamento nos diferentes sistemas de cultivo)
-linhagem bem caracterizada -cultivo muito dispendioso
-crescimento tanto em suspenso quanto de -requerimentos nu
forma aderida
tricionais complexos
-realizam modificaes ps-traducionais de
ilar s clulas humanas
-baixa produo
forma muito sim
-amplo conhecimento fisiolgico.
-segurana em relao susceptibilidade a
patgenos humanos (baixo ndice de replicao
de agentes virais)

-secretam a protena recombinante para o meio
extracelular

Clulas de insetos:
Vantagens: Desvantagens:
- as protenas recombinantes expressas so
na original
-vrus se replicam na cultura das clulas de
similares prote inseto
-altos nveis de expresso -custo elevado
-realizam modificaes ps traducionais -construo do vetor trabalhosa
-facilidade de purificao -rendimento abaixo de 30% da protena
recombinante de interesse
-no so patognicos para vertebrados ou licosilao deficiente de cido silico
vegetais
-g
-tecnologia bastante empregada em vrios
cidas e
-so necessrios inibidores para as proteases
roduzidas pelo Baculovrus e pela clula, em
osta a infeco
sistemas desenvolvidos (bioinseti
vacinas, por exemplo) resp
p
-capacidade para exp
tamanho
ressar protenas de grande
45
Tabela 3.1 (cont.)
Animais transgnicos:
Vantagens: Desvantagens:
-possibilitam a maioria das modificaes ps-
traducionais
-os primeiros animais so carssimos
-fcil scale-up -os ruminantes no fazem todas as modificaes
ps-traducionais
-so biorreatores naturais e baratos
urana (encarecem o
-exigem muitos cuidados, entre os quais, o
principal com a biosseg
produto)
-muito produtivos ( exceo de roedores)
-boa estabilidade gentica (banco de smem e
vulos)

Plantas transgnicas:
Vantagens: Desvantagens:
-custo baixo de crescimento -desconhecimento pela populao
-grande biomassa -baixos nveis de expresso
-cultivo bem estabelecido -estabilidade gentica ruim
-produtos para aplicao oral (vacinas) -questes de biossegurana (polinizao,
campos abertos)
-no realizam modificaes ps-traducionais de
protenas de mamferos
-monoplio da empresa detentora da patente
o (Monsanto) dificulta manipula
Adaptao das Fontes: Lemes, 2004; Silva, 2004.



da protena de interes




Entre todas as vantagens
considerar sempre o sistema que ofere
custo na expresso
e desvantagens apresentadas, h de se
a o melhor rendimento seguido de baixo
se (Tab.3.2).

46
Tabela 3.2 - Comparao entre os sistemas mais utilizados para expresso de
mpo/custo/rendimento dos principais sistemas de
tilizados.
Custo
protenas: relao te
expresso u
Hospedeiro Duplicao/Induo Rendimento Ps-traduo
Escherichia coli 30 min. / 5 h. Muito alto No Baixo
Saccharomyces
cerevisiae

2 h. / 24 h. licosilao Mdio Alto
Todos /
hiperg

Pichia pastoris 2 h. / 48-90 h. Muito alto Todos Baixo
Clulas de inseto/
Baculovrus

48 h. / 48 h. Mu Todos Alto ito alto

Clulas de
Mamferos 24 h. / 24 h. B

ixo

Todos

Alto a
Adaptao da Fonte: Lemes, 2004.


47
3.1.2 Expresso em bactrias, leveduras e clulas de mamferos

Expresso em bactrias Escherichia coli

o ma sistem duo de protenas recombinantes.
Como j citado anteriormente, este sist
c anipu enes, idade de ter altos rendimentos
c ntidades de protena exp ssa em pequenos volumes de cultura, a
rap cesso e um b o. orig nte empre para
exp tenas me os complexas. Embora o sistema de expresso de
seja bastante difundido,
ntre as quais a incapacidade de realizar as modificaes ps-traducionais tpicas
as clulas eucariotas e a freqente formao de corpos de incluso, que so
grandes agregados proticos acumulados intracelularmente, que prejudicam o
processo de purificao do produto. Sua aplicao na produo de protenas
animais gera, habitualmente, a desnaturao ou a perda da configurao
tridimensional e, conseqentemente, da atividade biolgica da protena (Lemes,
1998; Tonso, 2000).


Expresso em leveduras Pichia pastoris

O grande interesse existente no estudo das leveduras deve-se ao fato
de que se trata de organismos eucariotos inferiores e, como tais, possuem
organizao celular similar dos eucariotos superiores. Alm disso, muitas protenas
de leveduras so similares, estrutural e funcionalmente, s suas homlogas em
mamferos.

A levedura Pichia pastoris tem sido apresentada, ao longo das ltimas
duas dcadas, como sistema alternativo de expresso. capaz de crescer em meio
de cultura contendo metanol como nica fonte de carbono. O fato de crescer em alta
densidade celular em meio simples e barato levou sua transformao em um
eficiente sistema de produo de protenas recombinantes. Apresenta duas
caractersticas que a tornam uma atraente hospedeira para a produo de protenas
heterlogas. A primeira o forte promotor derivado do gene da enzima lcool-
is estudado a de pro
ema apresenta caractersticas vantajosas
omo a fcil m lao dos g a possibil se ob
om grandes qua re
idez do pro produtivo aixo cust inalme gada
ressar pro n
protenas heterlogas em E. coli existem srias limitaes,
e
d
48
oxidase (AOX I), usado para transcrever genes heterlogos. A segunda est no fato
or
apidamente atingir
aproximadam
Expresso em clulas de mamferos CHO

A tecnologia de expresso de molculas recombinantes em clulas de
comercial de anticorpos teraputicos. As
clulas CHO
umanos. Essas clulas possuem enzimas que realizam a glicosilao de
forma bastante similar s enzimas de linhagem celulares humanas. A linhagem de
clulas CHO
de no ser considerada uma forte fermentadora. A fermentao realizada p
leveduras gera etanol, que em culturas de alta densidade pode r
veis txicos. So facilmente cultivadas a densidades celulares de n
ente 100 g/L de peso seco, ou at maiores. A maioria dos genes
expressos nesta levedura tem seu produto secretado para o meio extracelular, mas
alguns, como o fator de necrose tumoral humana, foram produzidos no meio
intracelular.

Em se tratando da expresso, sendo este um organismo eucaritico, a
produo de protenas heterlogas nesse sistema consiste em um processo mais
complexo do que aquele empregado em bactrias E. coli. A levedura Picchia
pastoris de grande aceitao como organismo hospedeiro para a produo de
protenas heterlogas de interesse farmacolgico, como por exemplo, a albumina
srica humana e o antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B (Lemes, 2004).
Entretanto, no caso de protenas glicosiladas, a estrutura da molcula recombinante
pode no ser satisfatria.

mamferos o principal meio de produo
(Chinese Hamster Ovary ou Ovrio de Hamster Chins) so o sistema
de expresso predominantemente empregado para a produo de biofrmacos
(Tab.3.3) pelo amplo conhecimento fisiolgico e de cultivo que se tem dessas
clulas, bem como pela segurana que oferece em relao suscetibilidade a
patgenos h
bem caracterizada, relativamente estvel, capaz de produzir
protenas heterlogas com eficincia, e pode crescer tanto em suspenso, como
aderida a suportes (Kratje, 2004).

A clula CHO escolhida por trs razes: em primeiro, essa linhagem
de clulas vem sendo usada extensivamente e com sucesso, com um excelente
prognstico em segurana viral. So consideradas hospedeiras seguras para a
49
expresso de protenas de alto valor teraputico que, em grande parte, sero
administradas por via parenteral em pacientes humanos. Viroses humanas
patognicas como Plio, Rubola, Herpes, Hepatite B, HIV, Sarampo, Influenza e
Adenoviroses no se replicam em clulas CHO. Assim, o risco de contaminao
involuntria e transmisso de um agente viral adventcio extremamente reduzido.
Em segundo, muito bem caracterizada com respeito variedade de aspecto,
incluindo o caritipo, estrutura cromossomal, mapeamento gentico, condies de
cultivo e meios de cultura requeridos. uma linhagem de fcil manipulao e
controle de cultivo. Com isso, empregada na produo de diversos produtos
recombinante
o foram detectadas transmisses virais ou gerao de
ticorpos de relevncia clnica nas protenas expressas por essas clulas em
amentos com utilizao de produtos
derivados de clulas CHO (Harrison et al.,1998). Por todas estas razes e por sua
utilizao po
- colheita do meio com as clulas cultivadas;
- separao d
s. Em terceiro, apresentam a capacidade de glicosilao e outras
modificaes ps-traducionais, sendo bem adaptadas ao cultivo e crescimento em
suspenso em alta densidade, podendo crescer em meio livre e isento de produtos
de origem humana ou animal. Estas so caractersticas prticas importantes na
produo em escala industrial (Kauffman et al.,1986; Hauser & Wagner, 1997).

Para reforar a seleo das clulas CHO para essa finalidade, ressalta-
se, por exemplo, que n
an
nenhum dos mais de 100 milhes de trat
r parte do laboratrio da Universidade Federal do Rio de J aneiro -
UFRJ , com o qual se pretende estabelecer parceria, a linhagem de clulas CHO a
escolhida pelo LATAM para expressar os anticorpos humanizados.
As etapas para a produo de anticorpos monoclonais humanizados
em cultura de clulas, a partir de um sistema com agitao, so:
- inoculao em frascos spinner (Fig.3.3) com clulas do banco de trabalho;
- inoculao do contedo do referido frasco em biorreator;
- expanso da cultura, aumentando a concentrao celular (geralmente o volume
constante. Apenas em batelada alimentada o volume varivel);
- inoculao deste contedo em um biorreator de maior capacidade;
- expanso da cultura celular;
as clulas por microfiltrao ou outra tcnica de separao slido-
lquido;
- recuperao, concentrao e purificao do produto.
50
Tabela 3.3 - Alguns biofrmacos e protenas de uso diagnstico in vivo,
aprovados para uso humano, produzidos em clulas de mamferos:

PRODUTO
PROTENA /
ANTICORPO
MONOCLONAL

INDICAO

CLULAS

APROVAO

EMPRESA /
PAS

Activase

rh-t-PA

Isquemia aguda

CHO

1987
Genentech /
USA

Aranesp

rh- EPO
Tratamento da
anemia

CHO

2001

Amgen / USA

Abones

rh-Interferon-
Esclerose
mltipla

CHO

1996

Biogen / USA

Benefix

rh-Fator IX

Hemofilia B

CHO

1997
Genetics
Institute / USA

Cerezyme

Glucocerebrosidase

Doena de
Gaucher

CHO

1994
Genzyme /
USA, ustria,
Nova Zelndia
Enbrel /
Etanercept
Protena de fuso
(TNFR/hlgG1)
Artrite
Reumatoide

CHO

1998
Wyeth Europa /
USA
Epogen / Procrit rh-EPO Anemia CHO 1989 Amgen / USA
Epogin /
Recormon

rh-EPO

Anemia

CHO

1990
Amgen / USA,
J apo, Europa

Fabrazyme

rh- -galactosidase
Doena de Fabry
deficincia de

CHO

2003

Genzym
-galactosidase
e /
USA
GenHevac B
Pasteur
Aventis Pasteur
HBsAg Hepatite CHO 1989 / Frana

Gonal-F

rh-FSH

Infertilidade
feminina

CHO

1995
Serono /
Sucia,
Finlndia, USA

Granocyte

g-CSF
Anemia /
Neutropenia

CHO

1991
Aventis /
Europa, J apo
HB Gama HBsAg Hepatite CHO 1990 ne / J apo
Helixate
NexGen

rh-Fator VIII

Hemofilia A

BHK

2000
Aventis
Behring / Sua

Herceptin /
Trastuzumab
a

Anticorpo
monoclonal HER2
Cncer de mama
metasttico
(HER2)

CHO
1998
Genentech /
USA

Infliximab /

Anticorpo
Doena de
Crohn / artrite

nd

1998 / 199
Remicade
a, b
9

Centocor /
monoclonal TFN reumatide respectivamente USA
Kogenate rh-Fator VIII Hemofilia A BHK 1993 Bayer / USA

Luveris rh-LH Infertilidade CHO 2000
Ares-Serono /
n.e
Anticorpo
Myoscint
c
monoclonal /
miosina
Agente de
imagem cardaca
nd 1996

Centocor /
Holanda, USA

Neorecormon

rh-EPO

Tratamento da
anemia

CHO

1997
Boehringer
Mannheim /
Alemanha

Nespo

rh-EPO
Tratamento da
anemia

CHO

2001
Dompe Biotec /
Itlia

Novo Seven

rh-Fator VIIA

Hemofilia A e B

BHK

1996
Novo Nordisk
/Sua, Europa,
USA
51
Tabela 3.3 (cont.)

PRODUTO
PROTENA /
ANTICORPO

INDICAO

CLULAS

APROVAO
M

EMPRESA /
PAS ONOCLONAL


Ovid reproduo CHO 2001 S relle


rh-CG
Usado nas
tcnicas de
assistida






erono / Sua


Panorex
a


ticorpo An Cn tal
Glax
monoclonal


cer colorre


n.d


1995
o
Wellcome /
Cent or / oc
USA,
A lemanha

Prosta Scint
c
Anticorpo
monoc onal / l
PSMA

Cncer de
prstata

n.d

1996

Cytogen / USA

P Fi a CHO 1998 ulmozyme

DNAse I

br ic ose cst
Genentech /
Sucia, USA,
Sua

Puregon

rh-FSH
In e fertilidad
femi ina n

n.d

1996
NV Organon /
Dinamarca


Rebif


rh-IFN1a
Protelar
sintomas da
esclerose
mltipla


CHO


2002


A res-Serono /
USA, Sua

Recombinate

r V Fato Hem III

o lia A fi

CHO

1992
Baxter
Healthcare /
USA

Refacto
Fator
ihemofli ant co

Hemofilia A

CHO

2000
Genetics
Institute / USA

P Reo ro
a
Anticorpo
mo /
Platelet IIb/IIIa
Com de
noclonal
plicaes
isquemia
cardaca

.d n

1994

Centocor /
USA

R In etevase /
Reteplase

rh-t-PA

farto a udo do
miocrdio
g

n.d

1996
Boehringer
Mannheim /
Alemanha,
USA
Rituxan
a

MabThera
Anticorpo
monoclonal / CD20
L s
CHO

1997 Roc A
NH de clula
B
Genentech /
he / US

Simulect /
Basiliximab
a
Anticorpo
monoclonal /
IL2R
R
d Mie
camundongo
N
ejeio aguda
e transplante de
fgado

loma de

1998

ovartis / USA



Synagis
humanizado contra
um e
sup rus
r
doe
causa o
crianas
n 1998 Medim une /
Anticorpo
eptopo d
erfcie do v
sincicial
espiratrio
Profilaxia da
na o trato
respiratrio
d
da pel
vrus sincicial
respiratrio em



.d






m
USA

Thyrogen rh-TSH tra e CHO 2000
Deteco e
tamento d
cncer da
tireide

Genzyme /
USA

TNKase /
Tenecteplase miocrdio

rh-t-PA

Infarto agudo do

CHO

2000
Boehringer
Ingelheim /
USA
52
Tabela 3.3 (cont.)

PRODUTO
PROTENA /
ANTICORPO
MONOCLONAL

INDICAO

CLULAS

APROVAO

EMPRESA /
PAS


V
Nofetumomab
A
monoclonal murino
i
clulas
pulm
Dr. rl
Alemanha,
erluma
c
/


nticorpo
Agente de
magem para
deteco de
cncer em
onares


n.d


1996

Ka
Thomae /
USA

Wellferon In 1 Hepatite C Linfoblastoide
humano
1999 W terferon -N
Glaxo
ellcome /
USA

Zenapax /
Daclizumab
hu ra
a c
recepto e IL-2
Preveno da
re a
ao tr de
rim
n.d 1997 Roche / USA
Anticorpo
manizado cont
adeia do
r d
jeio agud
ansplante





Hoffman La
n.d no disponvel; n.e no enco ticorp oclonal tera o; b
por processo de perfuso contnua; c - anticorpo monoclonal para diagnstico in vivo. Ada
das Fontes: Castilho, 200 Cavalcanti, 2003; FDA, 2005.









.3 p
em sus te:
ntrado; a an o mon putic produzido
ptao
1;


Figura 3 - Frasco Spinner ara cultivo de
Corni clulas penso. Fon ng, 2005.
53
3.2 Sistemas de Cultivo

Para as c entes, ou seja, necessitam
ad a sup o n
seu desenvolvimento. Para as que podem crescer em suspenso, sistemas
especficos com diferentes tipos o so empregados (Schmidell & Facciotti,
20
Existem diferentes sistemas de cultivo, cada qual com suas
pa de s sis as estaci s com
os frascos T, sistemas de multidiscos, multibandejas e multiplacas (Fig.3.4). O
s

e medir as concentraes de oxignio dissolvido, pH e subprodutos do metabolismo
elular. O monitoramento visual.

) exigem manipulao constante,
m seu monitoramento basicamente visual como nos cultivos estacionrios, no h
omo medir o pH, as concentraes de oxignio dissolvido e metablitos celulares.
ontudo, j apresentam um rendimento at cinco vezes maior ao obtido no cultivo
stacionrio.

Os biorreatores de fibras ocas proporcionam uma produtividade alta,
com elevadas concentraes de clulas e, por conseguinte, de produto. O
monitoramento no de dados. adequado s
aplicaes em escalas intermedirias de produo.

H biorreatores agitados, de leito fixo ou fluidizado, onde se utilizam
microcarregadores (microcarriers). Nestes, as clulas esto aderidas e imobilizadas
na superfcie das esferas (Augusto & Oliveira, 2001).

lulas que tm caractersticas ader
erir a um erfcie, s ecessrios suportes de adeso para proporcionar o
de agita
01).
rticularida s especficas de operao. O tem onrio preendem
crescimento celular nesses tipos de sistema de cultivo estacionrio, com as clula
aderidas em superfcies planas e apresenta um baixo rendimento. H dificuldade em
s
c
As garrafas giratrias (roller bottles
t
c
C
e
simplificado, sendo difcil a obteno
54
Outros tipos empregados, com produtividades intermedirias, que
merecem citao so:

rascos spinner com agitao, que possibilitam o monitoramento de pH e pO
2
.
.5) um tipo de biorreator que proporciona alto
rendimento e possibilita o monitoramento das condies de cultivo. adequado para
produo em larga es
ciotti, 2001).
oleta contnua, porm isenta
de biomassa) (Lemes, 1998).
- biorreatores de superfcie permevel aos nutrientes e subprodutos do meio de
cultivo, tais como aqueles chamados de wave bioreactor;
- biorreatores com clulas aderidas de agitao magntica;
- f

Os biorreatores do tipo coluna de bolhas (air lift) so um outro tipo de
sistema mais homogneo, com capacidade de at 2000 litros, que permitem
monitoramento e tm alta produtividade.

Tanque agitado (Fig.3
cala e operao em perfuso onde as densidades celulares e
as concentraes do produto final de interesse so altas. O mais utilizado possui ps
para agitao do meio e tem um sistema de aerao atravs de borbulhamento,
proporcionando altas taxas de transferncia de oxignio. As clulas se encontram
em suspenso ou aderidas a microcarregadores (Schmidell & Fac

Os biorreatores do tipo tanque agitado podem ter diferentes modos de
operao, sendo os principais modos os processos em batelada simples, batelada
alimentada, fluxo contnuo normal (onde h coleta contnua contendo biomassa) e o
de perfuso contnua com reciclo celular (no qual a c


55
3.2.1 Os processos

de cultivo em biorreatores


processo contnuo, batel

Ba a

No processo de batelada simples todos os nutrientes necessrios para o
ionados no incio do processo e os produtos so
removidos aps completar o perodo de crescimento.

Nesses processos de cultivo, a adio

baixas velocidades especficas de crescimento de clulas animais e remoo
contnua de clulas neste modo de opera
Este processo caracteriza-se por ser uma combinao dos outros dois
anteriores. Um volume inicial de meio com nutrientes disponibilizado no incio do
processo e, medida que alguns nutrientes essenciais do meio vo sendo
consumidos, uma fonte de alimentao extra, com novos nutrientes concentrados,
vai sendo fornecida em propores correspondentes s taxas de consumo,
aumentando progressivamente o volume de meio no reator. So algumas vantagens
do processo a eliminao da represso catablica, o aumento do tempo de cultivo e
a diminuio da formao de subprodutos indesejveis (ex. lactato e amnia).

Os biorreatores podem ser operados de diferentes modos: batelada simples,
ada alimentada e perfuso.
tel da simples
crescimento celular so adic

Processo Contnuo
de nutrientes contnua e a retirada do
meio contendo clulas tambm feita continuamente, mantendo-se o volume
constante e atingindo-se o estado estacionrio. Depois de estabelecido, o estado
estacionrio pode ser mantido por longos perodos. Os efeitos do processo de
formao dos produtos e crescimento das clulas devido mudana dos parmetros
fsico-qumicos so facilmente detectveis e monitorveis. Contudo, o longo perodo
de cultivo proporcionado por esse sistema favorece a contaminao. Devido s
o, as concentraes celulares e de
produto atingidas so relativamente baixas.

Batelada alimentada

56
Sistema de perfuso contnua com reciclo de clulas
O sistema de perfuso contnua oferece uma srie de vantagens,

, com reteno das clulas no
ndo altas produtividades em cultivos de alta densidade celular
edronho, 2004). Isso vem a ajudar a superar as desvantagens do cultivo de
clulas
de oxignio dissolvido, pH,
oncentrao de nutrientes, produto e sub-produtos. Os subprodutos txicos s
s e o produto de interesse recuperado de forma contnua,
vitando o risco de degradao. Pode-se obter altas concentraes celulares, da

propiciando alto rendimento (Tab.3.4). Permite a contnua adio de nutrientes ao
eio e a remoo dos subprodutos metabolizados m
biorreator, favorece
(M
animais, cuja velocidade especfica de crescimento baixa e so sensveis
aos metablitos acumulados. Entre outras vantagens, apresenta um melhor controle
das condies ambientais de cultivo como tenso
c
clulas so removido
e
ordem de 5x10
7
clulas/mL, com altas vazes de alimentao e alta produtividade
(Tab.3.5). Esses biorreatores tm como caracterstica um menor volume para uma
mesma produo das protenas de interesse (Castilho, 2004).


Tabela 3.4 - Comparativo entre processos de produo para cultivo em
biorreatores de tanque agitado
Modo de
operao
Concentrao
Celular (cels/mL)

Complexidade
Volume do
Biorreator (L)
Produtividade
(mg/L/dia)
Batelada
simples e

10
alimentada
baixa At 10000 10-30
6

Perfuso At 5x10
7
mdia 30-2000 50-100
Fonte: Castilho, 2004

57
De acordo com Tonso (2004), vrios parmetros devem ser monitorados durante um
processo de cultivo celular em alta densidade celular em biorreatores:
Temperat
Composio de gases de entrada e sada
Volume / massa de meio
V
I
Concentrao de
Viabilidade
Di o de tamanho de clula
Densidade ptica
Ca ia
C bstratos e produtos
Fluxos metablicos
Lactato e amnia (sub-produtos txicos)
Aminocidos e osmolalidade
Produto

ura do processo
pH
Nvel de espuma
Freqncia de agitao
Viscosidade
Potncia consumida para agitao
Oxignio dissolvido
Potencial redox
Gs carbnico dissolvido
Presso do reator
Vazes de entrada e sada de gases
Glicose e glutamina
LDH (Lactato desidrogenase)

azes de entrada e sada de lquidos

magem do caldo
biomassa
stribui
pacitnc
oncentrao de su
58
Tabela 3.5 Comparao entre diferentes sistemas de cultivo indicando a
unidade volumtrica e rendimento celular por sistema:
Escala volume (L) Sistema rea para adeso (cm
2
) Clulas por lote por litro

_

Garrafa giratria

1750 (x100)

2x10
10
(2x10
8
)

_ Bandeja mltipla

24000 (x10)

3x10
10
(3x10
9
)

_
Multiplacas
(Cell cube)

85000 (x4)

4x10
10
(9x10
9
)

1 Biorreator de fibra ca

20000

10
10
(10
11
)

20
Microcarreador
microporoso

2.5x10
6

10
12
(5x10
10
)

100 Esferas de vidro


10
6

10
11
(10
9
)

200 Multiplacas

2x10
5

2x10
10
(1x10
8
)

500
Microcarregado
biorreator operand
r em
o em
tatria

2x10
10

10
10
(5x10
10
)
perfuso com filtro de
malha ro

_

4x10
12
(2x10
9
) 2000
Biorreator do tipo coluna
de bolhas

4000 Microcarregador

5x10
6

8x10
12
(2x10
9
)
ue
agitado

_

2x10
13
(2x10
9
)
Biorreator de tanq
10000
Fonte: Castilho, 2004.

bandeja Garrafa giratria



microcarregadores

Sistema multiplacas

Figura 3.4 Diferentes sistemas de cultivo. Fonte: Corning, 2005.
Sistema


59



























Figura 3.5 - Biorreator de tanque agitado com monitoramento e e parmetros.
Adequado para operao em scala y tems Biology, 2005.





controle d
perfuso em e industrial. Fonte: S s
60
O sistema de cultura celular e fermentao BioFlo 110 da firma New Brunswick,
presenta volumes de reator na faixa de produo de 1.3 at 13 litros (Fig.3.6).
el e o seu painel de controle indica os parmetros para o monitoramento
a produo. este sistema que o LATAM pretende adquirir para o processo de
ultivo de clulas em alta densidade. Para oper-lo em perfuso, pode-se usar um
quipament
Castilho, 2001) para reter as clulas o interior do reator.
a
autoclavv
d
c
e o de reteno celular, como por exemplo, o filtro de disco rotatrio
(


BioFlo110








Figura 3.6 Biorreator BioFlo 110 acessrios e painel de controle.
Fonte: New Brunswick, 2005.
Painel de Controle Acessrios
61

3.3 Sistemas de Purificao
q
u
p r recuperada e purificada.
Com freqncia, esses processos so considerados bem estabelecidos e se
baseiam em procedimentos empricos que foram desenvolvidos em bancadas de
laboratrio. A produo industrial em larga escala requer altos nveis de rendimento
a um baixo custo de processo. Dessa forma, o processo de purificao deve ser
aplicado sob forma de uma seqncia otimizada e bem ajustada dos diferentes
mtodos empregados durante as fases de recuperao e purificao da molcula de
interesse (Anspach, 2004).

Aps o processo de perfuso o produto que retirado do biorreator
passa por um processo de purificao, que envolve a separao de clulas e debris
celulares remanescentes, o isolamento e a purificao do biofrmaco de interesse.

A purificao envolve uma seqncia de estgios de recuperao e
purificao do produto de interesse (Fig.3.7) de maneira que se possa obt-lo no
grau de pureza requerido para a sua aplicao final.

Entre as tcnicas que podem ser empregadas pode-se destacar a
centrifugao, microfiltrao, processo atografia, remoo de endotoxinas e
ultrafiltrao (esterilizante e diafiltrao).

A cada estgio deste processo h perda do produto inerente
forma, imprescindvel a necessidade de aumentar o
ndimento das etapas de purificao, minimizando as perdas em cada estgio ou
eduzindo o nmero total de etapas em um processo de produo. Isto pode ser
avs o us seletiva, como a
cromatografia de afinidade, em substituio a uma seqncia de etapas menos
sele termos de produto
recuperado, como demonstra a figura 3.7.

A produo de biofrmacos implica na presena de outras molculas
ue fazem parte do meio de cultivo ou so produzidas pela clula hospedeira
tilizada. Como esses produtos no podem estar presentes e nem ser aceitos no
roduto final desejado, a biomolcula de interesse deve se
s de crom
metodologia aplicada. Dessa
re
r
alcanado, por exemplo, atr d o de uma tcnica altamente
tivas, aumentando o rendimento global do processo em
62



Figura 3.7 Integrao de etapas e aumento de rendimento atravs do uso da cromatografia
de afinidade. Fonte: Castilho, 2004.


63
A cromatografia de afinidade (Fig.3.8) a metodologia mais utilizada
para a purificao de anticorpos. Cons te em se dispor de um ligante com
reconhecimento biolgico especfico pela protena, com alta seletividade. Pode isolar
uma protena presente de forma diluda, em meio a uma mistura complexa, sendo
possvel processar grandes volumes da amostra utilizando-se pouco volume de
eluentes. Apresenta rendimentos bastante elevados, com altos nveis de
recuperao e fatores de purificao e concentrao aumentados (Castilho, 2004).

is


Figura 3.8 Esquema geral da cromatografia de afinidade
Reconhecimento biolgico especfico: alta seletividade; Fonte: Castilho, 2004.

Os diferentes mtodos aplicados pela indstria biofarmacutica e o
processo ajusante (downstream processing) variam no somente de produto para
produto, mas dependem tambm do sistema de expresso utilizado.

Os filtros com membranas podem ser usados para clarificao e
esterilizao de solues aquosas e gases introduzidos nos biorreatores, para a
separao de clulas e durante o processo de recuperao e purificao da protena
desejada. Podem ser membranas derivadas de cermica ou derivadas de materiais
polimricos orgnicos, com vrias porosidades e tamanhos. A filtrao pode ser feita
pelo mtodo tangencial ou por fluxo normal.
64
Um mdulo especial de filtro com membranas, denominado filtro
dinmico de disco rotatrio (Castilho, 2001), quando dotado de membranas de
afinidade, permite a integrao entre o processo de cultivo de clulas de mamferos
em perfuso e a purificao do produto de interesse. A geometria deste filtro reduz a
tenso de cisalhamento sobre as clulas, permitindo a reteno daquelas com alta
viabilidade no biorreator, ao mesmo tempo em que o produto de interesse
adsorvido e purificado quando o meio lquido permeia atravs da membrana. Este
sistema se apresenta como uma grande novidade, adequando-se a sistemas de
cultivo em alta densidade e otimizando a etapa de purificao de protenas
recombinantes, de modo a promover altos rendimentos e produtividade (Fig.3.9).


Figura 3.9 - Filtro dinmico de disco rotatrio. Fonte: Castilho, 2001.


65

As membranas de adsoro por afinidade acima citadas tm capacidade de
adsoro seletiva da protena diretamente do meio de cultura celular. Por isto,
quando so utilizadas membranas de afinidade no filtro de disco rotatrio, possvel
integrar a reteno das clulas (e seu reciclo ao biorreator) com a purificao do
produto de interesse. Algumas caractersticas necessrias para selecionar a
membrana de afinidade a ser utilizada so:

- adsoro direta proveniente do meio de cultura sem adio de solues
salinas ou diluies, para que o retido contendo as clulas possa ser
diretamente reciclado para o biorreator;



stios de ligao que apresentam forte afinidade por imunoglobulinas de diversas
cla te clssico, empregado
xtensivamente na cromatografia de afinidade e aplicaes para deteco de
nticorpos. Existem diferentes fontes de protena A comercialmente disponveis,
tanto de cepas do S. aureus, quanto de cepas de E. coli recombinantes.


- a seletividade do ligante pelo produto deve ser alta, permitindo purificao e
concentrao diretamente do fluido de cultura;

- as condies de eluio devem ser compatveis com a manuteno da
atividade biolgica e da estrutura do produto de interesse;

- como os cultivos em perfuso so idealizados como de longa durao, a
membrana de adsoro deve manter um desempenho estvel durante os
repetidos ciclos de adsoro-eluio;

- a membrana de adsoro deve ser esterilizvel.


Para a purificao de imunoglobulinas, podem ser empregadas
membranas de afinidade contendo protena A como ligante. A protena A uma
protena de Staphylococcus aureus, com peso molecular de 42 kDa e diferentes
sses e subclasses de diferentes espcies. Esta o ligan
e
a
66
Membranas comerciais Ultrabind

, feitas de polissulfona, e Sartobind

, de celulose
anticorpos e seus derivados, por duas
razes estratgicas: a vantagem da especificidade de ligao com o antgeno e
cap i
atrias preconizam um grau de
ureza dos produtos maior que 99%, particularmente no caso de protenas
inje v
empre e se baseia em interaes
ntgeno-anticorpo, as quais so muito fortes e especficas.
escala industrial e
m ajudado a indstria atingir um alto grau de pureza nas protenas teraputicas
que
tabela
Os processos de validao permitem ao fabricante se assegurar que o
m funcione com desempenho
sperado. Quando a metodologia executada da maneira correta, bem
ocumentada e de acordo com o estabelecido nos procedimentos operacionais, o
fabricante pod
regenerada, mostraram-se como sendo os melhores suportes para a imobilizao de
protena A, uma vez que as membranas de afinidade delas resultantes apresentaram
bom desempenho na purificao de imunoglobulinas (Castilho, 2002).

A cromatografia de afinidade com protena A considerado o mtodo
ideal para a recuperao de molculas de
ac dade de apontar os domnios constantes do fragmento Fc (Roque, 2004).

Os requerimentos das agncias regul
p
t eis. Com o objetivo de atingir estes elevados graus de pureza, pode-se
gar a cromatografia de imunoafinidade, qu
a

A cromatografia de afinidade pode ser utilizada em
te
receberam aprovao das agncias regulatrias, como mostram os exemplos na
3.6 (Kalyanpur, 2002).

todo aplicado na manufatura de um produto
e
d
e assegurar s agncias regulatrias, de que a tecnologia empregada
reprodutvel, e gera produtos de qualidade consistente.
67
Tabela 3.6 Exemplos de anticorpos e seus derivados purificados por
diferentes tcnicas baseadas em afinidade, obtidos por engenharia
gentica. Mtodos de separao por cromatografia de afinidade, baseada
em ligantes convencionais.


Fonte de produo

Alvo
Metodologia
de separao

Ligante

Referncias
Hibridoma
(sobrenadante de
cultura)

Anticorpo monoclonal
(IgG humana)

AC

Protena A

Giovannini &
Freitag, 2001
Hibri a dom
(sobrenadante de
cultu
Anticorpo monoclonal AC SMB Protena A Gottschlich &
ra) (IgG camundongo) Kasche, 1997
Hibridoma
(sobrenadante de
cultura)

Anticorpo monoclonal
(IgG camundongo)

AC (EBA)

Protena A

Thommes et al.,
1996
Clulas COS
(sobrenadante de

Anticorpo monoclonal

AC

Proten

cultura) humano (bi-especfico)
a G Zuo et al., 2000
Clulas NSO
(sobrena

dante de
cultura)
Fragmento bi-especfico
(diabody)
AC Protena L Kriangkum et al.,
2000
Pichia pastoris
(sobrenadante de
cultura)

Protena de fuso
Sc

AC

Protena G

Powers et al.,
-Fv-Fc 2001
Pichia pastoris
(sobrena
cultu

dante de
ra)
Glico -ScFv AC Concavalina A Wang et al.,
1998
E. coli
(periplasma)

Fragmento Fab

AC

Tioflico
Fiedler & Skerra,
1999
E. coli
(periplasma)
Fragmentos bi-
especficos
(diabodies)

AC

Antgeno / on
metlico
Holliger P,
Prospero T,
Winter G. 1993;
Holliger &
Winter, 1997
E. coli
(periplasma)
Fragmento bi-especfico
(diabody)

AC (IMAC)

Cu
2+
Cochlovius et al.,
2000
AC - Cromatografia de afinidade; SMB - Leito mvel simulado; IMAC - Cromatografia de
afinidade com metal imobilizado; Fab Fragmento de ligao com o antgeno (Antigen Binding
Fragment); Fv Regio de domnio varivel das cadeias leves e pesadas (Variable fragment);
Sc Cadeia nica (Single-chain); Fc Regio constante da cadeia pesada (formada
unicamente pela cadeia pesada - Crystal Fragment); EBA Adsoro em leito expandido; COS
clulas de rim de macaco modificadas com SV-40; NSO - clulas de mieloma de
camundongo. Adaptao da Fonte: Roque, 2004.



68














II PROPOSTA PA A PRODUO DE


















PARTE R
ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANIZADOS
69
1

- HUMANIZAO DO ANTICORPO ANTI-CD20
.1 O Antgeno CD20
O CD20 uma protena transmembrana com regies hidrofbicas de
omprimento suficiente para transpor a membrana celular por cerca de quatro vezes.
s longas terminaes nas regies carboxi (C) e amino terminais (N) da molcula
sto localizadas dentro do citoplasma, somente com uma pequena poro da
olcula exposta na superfcie da clula. O seu peso varia entre 33 a 37 kDa
ig.1.1).
Expresso nas linhagens de clulas B, o CD20 um antgeno de
uperfcie. Est relacionado com a regulao do crescimento e diferenciao dos
fcitos B, possivelmente por funcionar como um canal regulador de clcio.










Figura 1.1 - Estrutura e expresso do CD 20 durante o desenvolvimento da clula
B. (a) representao esquemtica dos domnios da protena; (b) localizao no
cromossomo; (c) expresso em tecidos linfides onde regies representando os
centros germinais, a zona do manto folicular e as zonas marginais, esto
indicadas por crculos crescentes progressivos; (d) expresso em clulas
linfides; (e) expresso durante o desenvolvimento da clula B. Abreviaturas: B:
clula B; T: clula T; M: macrfago; N: neutrfilo; RBC: red blood cell (clula
vermelha do sangue); P: plaqueta; act B: clula B ativada; PC: clula do plasma;
B blast: clula B rompida. Fonte: Tedder & Engel, 1994.

1

c
A
e
m
(F
s
lin


70
Este foi o primeiro antgeno de superfcie de diferenciao de clulas B
der & Engel, 1994).

e por precursores de clulas B e por estas j maduras,
endo perdido no momento da diferencia
igura 1.2 - Diferenciao dos linfcitos B. Fonte: Lefranc, 2005.
studos recentes sugerem que o CD20 um componente do sinal do
complexo de transduo, envolvido na regulao do crescimento dos linfcitos B
ativados. Sugere-se que o CD20 atua como um canal direto, regulando o fluxo de
on clcio (Ca
2+
)

conduzido atravs da membrana das clulas B, assumindo um
papel regulador de proliferao e diferenciao destas clulas. Sendo assim, um
anticorpo monoc
indiretamente o
adquirindo dessa
resultando na in
(Tedder & Engel
humanas a ser identificado por um anticorpo monoclonal (Ted
Sua expresso ocorr
s o das clulas B normais em clulas
plasmticas secretoras de anticorpos (Fig.1.2).


F

E
lonal que altere essa funo endgena do CD20 alterar tambm
transporte e fluxo de clcio atravs da membrana de clulas B,
forma as caractersticas desejadas para sua aplicao teraputica,
terrupo da progresso das clulas B atravs do ciclo celular.
, 1994).
71
1.2 O Linfoma No-Hodgkin LNH

ncer, a incidncia de LNH est
aumentando rapidamente em todo o mundo.
representando um
Figura 1.3 - As 10 maiores incidncias de cncer EUA 2001

b) Agressivo - graus intermedirio e alto, onde o linfoma difuso de grandes clulas
do tipo B (LDGC-B) a forma mais comum dentre estas, responsvel por 30% de
todos os casos.
O Linfoma No-Hodgkin (LNH) inclui um grupo diverso de doenas
malignas que se originam predominantemente dos linfcitos B. Em contraste s
taxas em declnio de muitos outros tipos de c

O LNH o quinto cncer mais freqente nos Estados Unidos (Fig.1.3)
com aproximadamente 56.000 casos novos registrados em 2001,
aumento anual na incidncia de 3-4% (Greenlee et al., 2001) (Tab.1.1).










Fonte: Greenlee et al., 2001.

Observou-se tendncia similar na Europa, onde uma anlise recente,
realizada em oito pases, mostrou aumento anual de 4,2% no nmero de casos
novos de LNH (Morgan et al.,1997).

Esta forma de cncer pode ser classificada de duas formas (Tab. 1.2):

a) Indolente - que a forma mais comum dentre as consideradas de baixo grau (com
22% dos casos).
72
Tabela 1.1 - Estimativa de novos casos de cncer e relao de mortes por sexo
2004)


(E.U.A. /
Avaliao de Novos Casos Mortes Estimadas
Ambos os
sexos
Homens Mulheres Ambos os
sexos
Homens Mulheres
Linfoma 62.250 33.580 28.070 20.730 11.090 9.440
Doena de Hodgkin 7.580 4.330 3.550 1.320 700 620
Linfoma No-
Hodgkin
54.370 28.280 25.520 19.410 10.390 9.020
Fonte: J emal et al., 2004.

Tabela 1.2 - Principais classes de leucemias e linfomas de clulas B
Caractersticas Curso Grau Classificao


I olente


Baixo


A
Linfcito pequeno,
consistente com LLC
Linfcito pequeno,
plasmacitide
nd

Indolente

Baixo

B
Folicular,
predominantemente
de pequenas clulas
clivadas

Indolente
Folicular, misto de
s
clulas
Baixo C pequenas e grande

A
Folicular,
gressivo Intermedirio D predominantemente
de grandes clulas

Agressivo

Intermedirio

E
Difuso, pequeno e
clivado
Agressivo Intermedirio F Difuso, misto
Difuso, grandes
Agressivo Intermedirio G clulas (LDGC-B)

Agressiv
Imunoblstico,
o Alto H grandes clulas
Agressivo Alto I Linfoblstico
Linfoblstico,
Agressivo Alto J pequeno,
no clivado
LLC: leucemia linfoctica crnica; LDGC-B: linfoma difuso de grandes clulas B.
Fonte: Hoffmann, 2003.
73

ente caracteriza- O LNH folicular indol se pelo envolvimento da medula
ssea em at 60% dos casos. H relatos de transformao histolgica para o LNH
mais agressivo em ro stico,
a mentando para 6 an ps
geralmente menor que 1 ano. As opes de tratamento incluem radioterapia,
quimioterapia com agente nico ou em c
in ticorpo clonai s e -tronco a 03).

o causador de muitas mortes no mundo e a sua incidncia
est crescendo. Embora possam estar associados imunodeficincia, auto-
imunid so
desconhecida

nto, tm o importantes avanos no conhecimento, no
desenvolvimento dos linfcitos saudveis e na patogenia do LNH na ltima dcada.
Esses avanos vieram acompanhados pela melhora nos tratamentos para o LNH.
Antes de 1990, a nica opo de tratamento disponvel era a quimioterapia
citotxica. Contudo, nos ltimos 10 anos, doses elevadas de quimioterapia e
reconstituio autloga das clulas tronco foram estabelecidas como etapas do
tratamento dos linfomas agressivos. Alm disso, os anticorpos monoclonais se
tornaram uma outra opo teraputica (Hennessy et al., 200

20-25% dos pacientes dent de 5 anos aps o diagn
u 0% aps 8 os. A mdia de sobrevida a a transformao
ombinao, terapias biolgicas, tais como
terferon, an s mono s e tran plante d clulas (Hoffm nn, 20
O LNH
ade ou infeces virais, na maioria dos casos as causas desta doena
s.
Entreta ocorrid
4).
74
1.3 O Anti
m alguns casos, os pacientes so submetidos a tratamento contra o
LNH com u
Tabela 1.3 - Gastos com o CD20 entre Janeiro 2002 e Agosto 2003
corpo Monoclonal Rituximab

Em recente pesquisa feita no Instituto Nacional do Cncer INCA do
Rio de J aneiro, constatou-se que, tambm no Brasil, o LNH um dos tipos de
cncer de maior relevncia, com um nmero cada vez maior de pacientes
portadores necessitando de tratamento precoce e nas diversas fases da doena.

E
m anticorpo monoclonal quimrico, o anti-CD20. Este anticorpo
importado e conseqentemente caro. Somente no Rio de J aneiro, so gastos cerca
de US$ 100 mil a cada 18 meses, com a compra deste produto (Tab.1.3).


PRODUTO

APRESENTAO

QUANTIDADE

VALOR UNITRIO

FABRICANTE

ANTI-CD20

100 mg (10mL)

105 frascos

US$ 270,00

ROCHE

ANTI-CD20

500 mg (50mL)

57 frascos

US$ 1340,00

ROCHE
Fonte: INCA, 2003.


O anticorpo monoclonal quimrico Rituximab anti-CD20 produzido e
comercializado somente por um fabricante (Roche), para terapia do LNH. Em razo
disso, o INCA efetua compra direta, isto , feita sem licitao. O produto est em
fase introdutria e ainda no tem a sua compra padronizada. A requisio feita por
paciente (INCA, 2003).

O Rituximab anti-CD20 o anticorpo monoclonal mais avanado j
aprovado para terapia do cncer e se tornou parte do tratamento padro para alguns
tipos de linfomas. Este e muitos outros anticorpos monoclonais continuam a ser
avaliados em estudos clnicos para outras aplicaes em diversos tipos de doenas.
Alm da sua aprovao na terapia do LNH, o Rituximab vem sendo testado para a
determinao da segurana e efetividade da sua aplicao, entre outras, no
tratamento de anemia, lupus eritematoso sistmico - SLE, hemofilia auto-imune,
75
pnfigo foliceo, mieloma de pele, prpura trombocitopnica, herpesvrus, artrite e
05; Morimoto et al., 2005; CTG,
005).
a
citotoxidade (Hennessy et al., 2004).


transplantes (Kawagishi et al., 2005; Looney, 20
2
Os anticorpos monoclonais podem ser usados separadamente ou
combinados, como no caso do anti-CD 20 combinado com o anti-CD 22
epratuzumab (Stein et al., 2004) com dosagens padro ou altas de quimioterapia.
Tambm podem ser conjugados com radionucleotdeos para aumentar



76
2 - O LABORATRIO DE TECNOLOGIA DE ANTICORPOS
MONOCLONAIS LATAM

rsas reas, em especial para a sade
Como parte da ao de reestruturao do DEDET, em 2004 passou
ategoria de laboratrio, sendo registrado como Laboratrio de Tecnologia de
nticorpos Monoclonais LATAM, membro da Vice Diretoria de Desenvolvimento
Tecnolgico VDTEC (antigo DEDET), da Unidade de Bio-Manguinhos.

Atualmente instalado em uma rea de aproximadamente 39 m
2
, situada
no 4 andar do Pavilho Rocha Lima (Fig.2.1), conta com uma equipe composta por
cinco profissionais, que ser especificada mais adiante. O LATAM est capacitado
para produzir anticorpos monoclonais de origem murina contra diversos tipos de
molculas, a partir do antgeno de interesse.


Figura 2.1 - Planta atual do LATAM
A - Sala principal e escritrio.
B - Sala de freezer 20 e 70C
C - Sala de fluxos laminares e incubadoras


O Setor de Hibridomas foi criado em 1983, dando incio ao
Departamento de Desenvolvimento Tecnolgico DEDET do Instituto de Tecnologia
em Imunobiolgicos - Bio-Manguinhos. Desde ento, produz anticorpos monoclonais
contra antgenos de interesse para dive
pblica.

c
A







77
O LATAM possui estrutura e profissionais qualificados para o processo
de diversos
e outras instituies de
pesquisa, buscando o desenvolvimento de novas metodologias e/ou aprimoramento
das j existentes. E

onou do seu banco, hibridomas
secretores de anticorpos anti-HBsAg para o
lonais desenvolvidos so utilizados na elucidao
das estruturas antignicas e no est
as secretores de anticorpos
monoclonais variado e representativo, o LATAM conta com uma colnia prpria de
camundongos BALB/c isognicos, com alto grau de consanginidade e qualidades
atestadas pelo Centro de Bioterismo CEMIB da Seo de Controle de Qualidade
Gentica da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, obtendo dessa forma
segurana, rendimento e qualidade considerveis durante o processo de fuso,
clonagem, produo do fluido asctico e sobrenadante de cultura.
AM, destacam-se algumas com
especificidade definida para:
a. Hepatite A (HAF 203)
b. Hepatite B
c. Febre Am
d. Sarampo (vacinal CAM 70)
de desenvolvimento e produo de anticorpos murinos. Participa
projetos colaborativos entre departamentos da FIOCRUZ
ntre eles destaca-se o projeto intitulado Caracterizao e
Purificao de Anticorpos Monoclonais Contra o Vrus da Hepatite B Anti-HBsAg e
do Antgeno de Superfcie do Vrus da Hepatite B Recombinante HBsAgRec, cuja
responsabilidade pelo fornecimento dos anticorpos do LATAM.
Recentemente, o laboratrio seleci
desenvolvimento do projeto Anticorpo
Monoclonal Humanizado anti-HBsAg. Este projeto mais uma vertente na direo
do domnio da metodologia de humanizao.

Os anticorpos monoc
udo de sua imunogenicidade, bem como no
desenvolvimento, padronizao e otimizao de conjuntos para o diagnstico
laboratorial.

Detentor de um banco de hibridom

Entre as fuses elaboradas pelo LAT

(HBsAg)
arela (vacinal 17DD)
78
e. Dengue (


imento Diviso de Reativos para
Diagnstico - DREAD de Bio-Manguinhos, que a responsvel pela produo dos
conjuntos de
so as seguintes:
- estudo
ticorpos;
- formao, manuteno e criopreservao do banco de hibridomas;
- produ
- preparo de meios de cultura e reagentes;
ongos BALB-c (manuteno, sangria, imunizaes, coleta
;
- preparo de suspenso antignica para imunizao dos animais;
has de informao das hibridizaes;
Tipos 1, 2, 3 e 4)
f. Neisseria meningitidis (protenas, polissacardeo capsular e endotoxina)
g. Mycobacterium bovis (BCG)
h. Leptospira interrogans (Copenhageni e cancula)
i. Imunoglobulinas humanas (IgG, IgM)
j. Hepatite C (HCV)
k. Mycoplasma micoides
A produo de fluido asctico anti-Hepatite B, imunoglobulinas
humanas IgG/IgM, anti-Dengue 1, 2, 3 e 4 e anti-Febre Amarela feita
periodicamente pelo LATAM para o fornec
reagentes para diagnstico.

As atividades gerais do Laboratrio de Tecnologia de Anticorpos
Monoclonais

da viabilizao da implantao da tcnica de humanizao de
anticorpos para fins teraputicos (objeto desta dissertao de mestrado no
MPTI de Bio-Manguinhos);
- produo e desenvolvimento de anticorpos monoclonais aplicados em
estudos das caractersticas de diversos agentes antignicos de interesse em
sade pblica;
- padronizao de testes para anlise e caracterizao dos an
o e armazenamento de fluido asctico e sobrenadante de cultura
celular;
- colnia de camund
de fluido asctico)
- organizao da pasta/arquivo de fic
79
- implantao da reao de imunofluorescncia indireta (IFI), como teste de
de dos
Dengue tipos 1, 2 e 3;
erizao de anticorpos monoclonais
ara aplicao no melhoramento
tamento da hepatite B;
no do anticorpo monoclonal anti-CD20 murino;
o de anticorpo monoclonal anti-HBsAg;
- projeto de avaliao da viabilidade e caracterizao de anticorpos
monoclonais do banco de hibridomas do LATAM;
. le
do o rastreamento de cada etapa do
processo de produo de anticorpos monoclonais;

Participao em diversos projetos em colaborao com laboratrios e centros de

- rolgico e Molecular da infeco pelo vrus da
ersa.
gem e
ostras de
- ento da vacina BCG (sub-cepa Moreau) (Programa de Vacinas
FP-10 de M.
- produo de soro policlonal para protena LACK.
controle interno para avaliao da sensiblidade e especificida
anticorpos monoclonais anti-
- acompanhamento dos ensaios de caract
(anti-HBsAg), utilizando peptdeos sintticos p
dos insumos para diagnstico e tra
- projeto de obte
- projeto de humaniza
vantamento e atualizao do material criopreservado no banco de
clulas;
. levantamento das informaes disponveis sobre o histrico dos
hibridomas (1983 a 2004);
. informatizao de dados, visan

pesquisa, tais como:
projeto de Diagnstico So
Hepatite C (HCV): desenvolvimento de conjuntos para a deteco de
anticorpos anti-HCV por ensaio imunoenzimtico e genotipagem do HCV por
hibridizao rev
- desenvolvimento de insumos (conjugados) para imunofenotipa
quantificao de CD3/CD4/CD8 por citometria de fluxo, em am
indivduos infectados pelo HIV.
melhoram
Bacterianas).
- produo de anticorpos policlonais contra as protenas (6) da regio RD16 de
M. tuberculosis.
- produo de soro policlonal contra as protenas ESAT-6 e C
tuberculosis.
80
- produo de anticorpos monoclonais para as protenas NS1 e NS3
produzidas em P. pastoris para produo de kit diagnstico para dengue.
desenvolvimento de anticorpos monoclonais para - as protenas (leptospira
- ombinantes Hexon,
- pro
de astrovrus.

immunoglobulin like) Lig.A, Lig.B e LpL32 aplicados ao projeto de
desenvolvimento de vacina e diagnstico para leptospirose.
produo de anticorpos monoclonais contra protenas rec
de adenovrus.
- produo de soro policlonal para a protena KMP11.
- produo de anticorpos monoclonais contra protenas recombinantes VP6, de
rotavrus.
duo de anticorpos monoclonais contra protenas recombinantes VP90,
81
2.1 Im

monoc o LATAM e est
ind
crescente interesse da direo em abrir nova frente de mercado atravs de novas
linh
boratrio identificou este momento como sendo oportuno para dar
inc a
a humanizao de anticorpos monoclonais. uma boa oportunidade de conseguir
arte desse mercado identificando, desenvolvendo e produzindo o anticorpo
humanizado anti-CD20.

Com o domnio dessa tecnologia, pode-se reduzir consideravelmente
os gastos no s do INCA, mas tambm de outras instituies nacionais, da rea de
oncologia, desonerando a balana comercial com gastos na importao desses
anticorpos. Possibilitar tambm a abertura que permitir a Bio-Manguinhos dispor
de uma tecnologia de ponta, fomentando o pas a um mercado em crescente
desenvolvimento mundial, podendo se tornar um fornecedor desses produtos ao
Ministrio da Sade, aps sua devida aprovao e liberao pelas agncias
reguladoras.

Como impacto social imediato, haver a reduo das taxas de
mortalidade da populao acometida por essa neoplasia (LNH), com elevao da
sua expectativa e qualidade de vida, por meio de emprego de medicamentos de
comprovada eficcia. A reduo das taxas de internao nos hospitais, decrescendo
os custos internos atribudos a essa prtica, tambm ser possvel.

Paralelamente, a absoro da tecnologia de humanizao estimular o
crescimento cientfico das equipes participantes dos laboratrios diretamente
envolvidos no processo, gerando conhecimento, publicaes e participaes em
congressos e seminrios. A capacitao cientfica e tecnolgica atravs da obteno
de conhecimento bsico e especfico, assim como de novas tecnologias e produtos
pactos da Implantao da Tecnologia de Humanizao
O desenvolvimento da tecnologia de produo de anticorpos
lonais humanizados para fins teraputicos de interesse d
icado como sendo uma das prioridades da Unidade de Bio-Manguinhos. H um
as de produo.

O la
io o desenvolvimento de uma nova metodologia, ainda indita na Unidade, que
p
82
voltados para a humanizao de anticorpos de interesse teraputico, incrementa


omo objetivo geral, cita-se o desenvolvimento de um anticorpo
monoclonal a
s de anlise de antgenos de superfcie de leuccitos.

- Estabelecer

icialmente, caber ao laboratrio desenvolver os anticorpos
monoclonais
(CD20) por meio
a purificao de linfcitos B.
2- Imuniza
esta proposta.
Essa plataforma abrir a possibilidade de se identificar no atual banco
de hibridomas do laboratrio, aqueles com potencial aplicao teraputica de
doenas de reconhecido impacto social, como, por exemplo, a Hepatite B.

Objetivos e Etapas
C
nti-CD20 humanizado.

Como objetivos especficos:

- Estabelecer metodologia
metodologia de purificao de linfcitos B de sangue perifrico.
- Estabelecer metodologia de anlise de anticorpos anti-CD20.

- Obter e caracterizar hibridomas produtores de anticorpo monoclonal anti-CD20
murino.

- Caracterizar anticorpos monoclonais anti-CD20 murinos.

- Desenvolver competncia na rea de manipulao e remodelagem de anticorpos.


In
murinos anti-CD20 a partir de camundongos BALB/c imunizados.

Para a execuo dessa atividade so necessrias as seguintes etapas:

1- Estabelecimento de metodologia para obteno do antgeno alvo
d
o dos animais.
3- Estabelecimento de metodologia para avaliao do ttulo de anticorpos dos
animais imunizados.
4- Hibridizao celular.
5- Triagem dos hibridomas secretores.
83
6- Clonagem das clulas hbridas secretoras.
7- Expanso dos clones para criopreservao e obteno de sobrenadante de
cultura e fludo asctico.
8- Purificao
rmente, o anticorpo monoclonal murino anti-CD20 obtido ser
submetido a
interesse e submet-lo a uma reao de PCR
merase chain reaction), utilizando-se um conjunto de iniciadores especficos
para as di es e pesadas das
unoglobulinas murinas. Os produtos de PCR so clonados e suas seqncias de
das
ios de
terao, contato e ligao com o antgeno para definir as CDRs (MacCallum,
deve conter as trs
o e
em vetores de expresso de fragmentos de anticorpo.

expressos normalmente em uma das quatro formas abaixo: anticorpo inteiro,
contendo os domnios variveis humanizados (apenas as CDRs so de
camundongo
deia
leve - V
L
humanizado e constante humano; e Fd V
H
humanizado e o primeiro
umanizados,
conectados por um peptdeo hidroflico conector e os dois domnios constantes
em levedura Pichia pastoris. O anticorpo inteiro deve
amfero em cultura (Maranho & Brgido, 2001).
e quantificao dos anticorpos monoclonais.
9- Isotipagem.
10- Ensaios de caracterizao.

Posterio
o processo de humanizao, que consiste em obter o cDNA do
hibridoma produtor do anticorpo de
(poly
versos domnios variveis das cadeias lev
im
nucleotdeos determinadas. A partir deste dado, as seqncias de aminocidos
cadeias variveis so deduzidas e faz-se uma anlise topogrfica dos st
in
1996). Com esses dados, monta-se o gene humanizado que
CDRs no contexto de um arcabouo de anticorpo humano. O gene sintetizad
lonado c

No processo da expresso, os domnios variveis humanizados so
) e os domnios constantes humanos; scFv (apenas os domnios
variveis conectados por um peptdeo conector hidroflico e flexvel); Fab (ca
domnio constante humano) ou FvFc (um scFv contendo V
H
e V
L
h
humanos de cadeia pesada C
H
2 e C
H
3). Todas essas construes, exceto a
primeira, podem ser expressas
ser expresso em clulas de m

84
Detalhadamente, as etapas desse processo podem ser definidas da
a cadeia V
H
murina.

acional.

lonagem em vetor de expresso para Pichia pastoris.
Expresso e





Ensaio
Avaliao
humanizado em
biorreatores e purific
tcnicas de cromatografia de afinidade (por exemplo tendo Protena A como
ligante) e cromatografia de troca inica.
As etapas cromatogrficas podero ser realizadas em membranas de
adsoro ou em colunas empacotadas com partculas geliformes porosas.

seguinte maneira:
Obteno da seqncia d
Obteno da seqncia V
L
murina.
Anlise comput
Obteno dos genes V - D - J .
C
produo da protena humanizada.
Ensaio biolgico.
Clonagem dos genes em vetores de expresso em clulas de mamferos da
linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary).
Transfeco de clulas em cultura.
Obteno do transfectoma estvel.
Expresso, produo e purificao de protena.
biolgico.
dos resultados

A prxima fase ser a de expresso do anticorpo
clulas de mamfero da linhagem CHO, produo em alta densidade utilizando
ao do produto. Sero seguidas basicamente as seguintes
etapas:
- amplificao, por reao de PCR, do gene do anticorpo previamente
humanizado;
- ligao do gene amplificado ao vetor de expresso, de modo a construir o
vetor recombinante;
- transfeco das clulas com o vetor recombinante;
- screening dos clones produtores e seleo dos clones estveis;
- montagem de um banco celular com os clones mais promissores;
- produo do anticorpo humanizado atravs do cultivo celular em biorreatores;
- purificao do anticorpo a partir do sobrenadante de cultivo, empregando
85
3 - PROJE
aboratrio
e com base no Plano Diretor de
, dentro do escopo da Comisso das reas Compartilhadas
nolgico DEDET, o Laboratrio de
ais LATAM necessita ser reestruturado (Figs.
ria de Desenvolvimento Tecnolgico VDTEC,
das. Entre elas a proposta do Plano
o de reas compartilhadas que consistiu em:
Ocupao dos espaos fsicos (existentes ou programados),
Sugerir a localizao das reas propostas, bem como pessoal,
ao pro ica, setorizao, equipamentos, insumos necessrios e
rec s sse e estaro listados na
seq n
ant r aria,
poden
TO DE PRODUO

3.1 Recursos Fsicos

3.1.1 Reestruturao do L

Alm do objetivo desta dissertao
Ocupao de 1999
instituda em Bio-Manguinhos em 2004, para o processo de reestruturao do
Departamento de Desenvolvimento Tec
Tecnologia de Anticorpos Monoclon
3.1 e 3.2). Instituda a Vice Direto
vrias propostas de reestruturao foram elabora
Diretor e da comiss

pelas Unidades Organizacionais;
Levantar as necessidades e a viabilidade da criao de novas
reas e manuteno e/ou modificao de reas existentes;
equipamentos e outros.

Para melhor atender o objeto desta proposta, fatores correlacionados
cesso, como rea fs
ur os humanos, sero componentes de grande intere
cia.

As plantas que se seguem ainda no so as definitivas. Consistem em
ep ojetos que merecero avaliao do departamento competente de engenh
do, dessa forma, sofrer modificaes estruturais e redimensionamentos.

86




Figura 3.1 - rea proposta para o LATAM hachurada em azul, situada ao lado do Laboratrio
de Neuro
Fonte: DEPEM/BM.


















virulncia - LANEU.




87


88
Proposta de definio de reas do laboratrio, buscando adequao s
normas de BPL (boas prticas de laboratrio).

De acordo com a figura 3.2, a rea do LATAM poder ser subdividida da seguinte
forma:

- Escritrio / Sala de estudos


- Corredores para circulao (limpo e servio com vestirio)


- Cultivo de clulas
. Uma sala de fluxo laminar I - cultivo de clulas.
. Uma sala de fluxo laminar II - cultivo de clulas.
. Uma sala de fluxo laminar III - cultivo de clulas.
. Uma sala de biorreator.
. Uma sala de equipamentos (concentrao e purificao).
. Uma sala de controle de produtos e processos.
. Uma sala de meios e reagentes (preparo de solues).
. Uma sala para o banco de hibridomas (acondicionamento de botijes de
nitrognio lquido).


- Higienizao (rea de apoio para a colnia)
. Uma sala de higienizao.
. Uma sala de esterilizao e preparo de material.
. Uma sala de estoque de material limpo.


- Banheiros com vestirio (masculino e feminino).


- Manipulao de animais
. Uma sala para manipulao com animais (camundongos BALB/c).
. Uma sala de fluxo laminar IV exclusiva para o trato com animais.


- Sala para manipulao molecular (transplante de CDR e biblioteca genmica).


- Piso tcnico para condicionadores de ar com controle de presso positiva e
outros maquinrios.
89
Trs setores sero criados no LATAM, a fim de definir as atividade
esenvolvidas (Fig. 3.3).
s nele



ATAM.

As fina

a) S
Finalid
produo de anticorpos monoclonais murinos provenientes de clulas secretoras a
tribuies:
aplicao em tcnicas de
diagn
- prod de de Bio-
anguinhos e da Fiocruz;
idomas, fluido asctico e sobrenadante
d







Figura 3.3 Setores a serem criados com a reestruturao do L
lidades e atribuies desses trs setores sero as seguintes:
etor de Hibridomas SEHIB:

ade:
-
partir de antgenos especficos.
A
- desenvolvimento de anticorpos monoclonais com
sticos;
uo de fluido asctico para atender a outros laboratrios da Unida
M
- padronizao de testes para anlise e caracterizao dos anticorpos;
- formao e manuteno de banco de hibr
de cultura celular.
LATAM

Setor de
Humanizao
Setor de
Hibridomas
Setor de
trole Con
90
b) Setor de Humanizao de Anticorpos:

Finalidade:
- desenvolvi
anticorpos exec do tcnicas de bio lecular em reas compartilhadas.
Atribuies:
- anlise computacional;
- extrao e purificao de cidos nuclicos;
- amplificao de DNA;
- seq nciamento
- obteno dos genes V - D - J ;
- clonagem em vetor de expresso para Pichia pastoris;
- expresso
ensaio biolgico;
clulas
de ovrio de hamster chins CHO;
ra;
- expresso, produo e purificao de protena;
os resultados;
ntrole de Produtos e Documentao:
- organizao dos dados obtidos, fichamento e documentao do processo atravs
de protocolos;
- elaborao e atualizao dos procedimentos operacionais padronizados.
mento de competncia na rea de manipulao e remodelagem de
utan logia mo
e de DNA.
e produo da protena humanizada;
-
- clonagem dos genes em vetores de expresso em clulas de mamferos
- transfeco de clulas em cultu
- avaliao d


c) Setor de Co

Finalidade:
- controle das caractersticas do produto e documentao das etapas
Atribuies:
- execuo de tcnicas de anlise de protenas (ELISA, Western-Blot,
imunofluorescncia, eletroforese e high pressure liquid chromatography HPLC,
entre outras);
91
3.1.2 Equipamentos Necessrios para Aquisio
- agitadores orbitais
- agitador magntico
- ncia

Equipamentos para utilizao compartilhada (uso conjunto com outros laboratrios):
dor (PCR)
- eletroporador
- sistema de cromatografia


- potencimetro
- cabines de fluxo laminar
- botijes para nitrognio lquido
- centrfuga
- banho-maria
- biorreator
- computador
- scanner
- gravador de CD-Rom
- estufa de CO
2
- microscpio ptico inv
-
ertido
freezer 20C
- freezer 70C
- geladeiras
- bomba peristltica simples
- espectrofotmetro para microplaca
- estufa 37C
- balana analtica
- agitador de tubos
- micro-centrfuga
microscpio para imunofluoresc
- sistema de eletroforese pra gel de agarose e poliacrilamida
- citmetro de fluxo
- termocicla
- seqenciador
92
3.2 Recursos Humanos Parcerias e Colaboraes

3. Recursos Hu 2.1 manos

oduo da metodologia de humanizao
em Bio-Manguinhos exigir um significativo processo de
redimensionamento das reas comuns ao
ofissionais da rea de imunologia, engenharia
tegrar laboratrio ser imprescindvel.
estar sendo treinado, buscando capacitao e
desenvolvimento de anticorpos.
ao cientfica e tecnolgica atravs da obteno de
entais para a implementao prtica
(em fase final de mestrado);
ao);


A proposta de viabilizar a intr
de anticorpos monoclonais
reestruturao, no s fsica, com o
LATAM, como tambm, no que tange aos recursos humanos.

A contratao de pr
qumica, biologia celular e molecular para in
Paralelamente, o atual grupo
qualificao nessa nova tcnica de

A capacit
conhecimentos bsicos, assim como de novas tecnologias e produtos voltados para
a humanizao de anticorpos, sero fundam
desse estudo.

A composio atual do laboratrio a seguinte:

- 1 tecnologista snior
- 2 tecnologistas pleno (sendo 1 com doutorado e 1 com
especializ
- 1 tcnico (com especializao);
- 1 biotecnologista (terceirizado com mestrado);
93
A composio profissional proposta para o laboratrio dever ser a
eguinte (quadro atual inclusive):

anticorpos monoclonais murinos:
tecnologistas e 4 tcnicos com especial ao.

- Para o processo de cultivo em sistemas de alta densidade:
2 tecnologist

- Para o pr
m sntese, prope-se a contratao para o laboratrio de 4
tecnologistas

s
- Para o processo de produo de
2 iz
- Para o processo de humanizao de anticorpos monoclonais:
1 tecnologista com doutorado, 1 biotecnologista com mestrado e 1 tcnico.

as graduados em engenharia qumica com mestrado e 2 tcnicos.

- Para o processo de controle do produto:
1 tecnologista com especializao.
ocesso de documentao (protocolos, fichamentos, entre outros) e
atualizao dos procedimentos operacionais:
1 tecnologista e 1 tcnico, ambos com especializao.

E
e 7 tcnicos.
94
3.2.2 Parcerias e Colaboraes

outros centros de pesquisa,
o de competncia nessa nova tecnologia, paralelamente
a clnica no Brasil, como por exemplo, o LNH.

ecendo contratos com o envolvimento
ando acordos de colaborao e contratos
pao de:

imento do antgeno CD 20. O objetivo obter um
o teraputico. Para isso necessrio
obter um volume representativo de clulas B CD 20 positivas para imunizar o modelo
animal (camundongos isognicos da cepa BALB/c). nesse sentido, ou seja, na
obteno de amostras clnicas de pacientes portadores de LNH, que buscamos
efetivar esta colaborao. Esta etapa necessria para que o LATAM produza os
anticorpos monoclonais murinos contra este antgeno, a partir do fornecimento
dessas amostras, aplicando metodologia prpria, introduzida e adotada no
laboratrio h 22 anos. Alm do suprimento de amostras clnicas caber ao INCA a
aplicao do anticorpo monoclonal humanizado anti-CD20 nas fases dos ensaios
clnicos, auxlio na elaborao dos protocolos de imunizao e fornecer dados que
permitam a previso de produo do referido anticorpo pela Unidade de Bio-
Manguinhos.

A proposta desta dissertao caracteriza-se por ser uma tarefa
multidisciplinar que, por tal, exige a interao com
atravs de acordos colaborativos e contratos srios e eficientes.

A metodologia para se desenvolver em escala de produo anticorpos
monoclonais humanizados em Bio-Manguinhos, envolve, essencialmente como
critrio primordial, a cria
tentativa de saneamento de problemas pontuais que j esto sendo alvo de
pesquis
Neste particular, esto se estabel
do LATAM. Bio-Manguinhos vem formaliz
entre as partes competentes, com a partici

LATAM / INCA

O INCA (INSTITUTO NACIONAL DO CNCER DO RIO DE J ANEIRO)
poder contribuir para o fornec
anticorpo monoclonal murino anti-CD20 para us
95


Brasil. A essa equipe, coordenada pelo Dr. Marcelo Brgido e pela Dra. Andra
Maranho, caber o processo de desenvol

LATAM / UF
DE J ANEIRO - UFRJ , atravs
do Laboratrio de Engenharia de Cultivos Celulares da COPPE (equipe da Dra.
proceder a expresso, assim como o desenvolvimento do
celular em biorreatores e de recuperao
e purificao dos anticorpos humanizados
LATAM / UnB

A UnB UNIVERSIDADE DE BRASLIA, atravs do seu Instituto de
Imunologia Molecular, um centro de referncia em humanizao de anticorpos no
vimento de anticorpos humanizados a
partir dos anticorpos monoclonais murinos desenvolvidos por Bio-Manguinhos.
Como objetivo, estar sendo visado no s a sua utilizao clnica, como tambm a
formao de competncia necessria para o domnio e implementao dessas
tecnologias pela equipe de Bio-Manguinhos.
RJ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
Leda Castilho) caber
processo de produo com alta densidade
, empregando como sistema de expresso
as clulas de mamfero da linhagem CHO.

No Programa de Biofrmacos VDTEC/Bio-Manguinhos, alguns
projetos esto em desenvolvimento e apresentam nfase na utilizao de reas
compartilhadas da Biologia Molecular, do Laboratrio de Tecnologia Imunolgica -
LATIM, alm do prprio LATAM e das centrais e reas de interface como o
Laboratrio de Experimentao Animal LAEAN e o Setor de Cultivo Celular. Logo,
a estruturao fsica e organizacional dessas extremamente importante para o
bom andamento das atividades.
96
4 - MERCAD

O
A proposta do Laboratrio de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais
de desenvo
o acesso queles humanizados, que
conhecem uma grande variedade de antgenos, por permitir a construo de
o gentica que conferem nova funo ao stio de ligao com o
antgeno.
Como ponto de referncia, temos que o valor dos produtos
biofarmacut
lvimento de anticorpos humanizados anti-CD20 extremamente vivel,
sob o ponto de vista de mercado. O produto existente disponvel quimrico e, com
uso prolongado, gera reao imune no paciente. O LATAM produzindo este
anticorpo humanizado possibilitar sensvel reduo dessa resposta imune,
potencializando a aplicao do produto visando o mercado brasileiro.

A tecnologia de produo de anticorpos monoclonais recombinantes
revolucionou a gerao de anticorpos, abrind
re
protenas de fus

A importncia dessa inovao biofarmacutica no desenvolvimento de
drogas cresce continuamente, oferecendo excelente e promissor mercado
consumidor, capaz de absorver grandes produes, voltadas basicamente para a
rea mdico-farmacutica.

icos no mercado mundial atingiu 41 bilhes de dlares em vendas no
ano de 2003. Especificamente, o segmento que cabe aos anticorpos monoclonais no
mercado global de bioteraputicos est em torno de 5-6 bilhes de dlares, ou seja,
em torno de 12-15% do mercado biofarmacutico (Carius, 2004) (Fig.4.1).
97




orpos monoclonais para uso em
tcnicas de
fato, seu mercado crescer 25% acima das expectativas
atuais que variam entre US$ 100 e US$ 125 bilhes (Carius, 2004).
roduo e
a ao de grupos opositores (Miller, 2003).

O mercado mundial para anticorpos teraputicos encontra-se na casa
dos bilhes de dlares. Nos EUA vrios anticorpos j foram liberados pelo Food and
Drug Administration - FDA, sendo cinco quimricos (Remicade, Simulect, ReoPro,
Rituxan, Erbitux), oito humanizados por transplante de CDR (Zenapax, Synagis,
Herceptin, Mylortag, Campath, Avastin, Tysabri, Xolair), um humano (Humira) e oito
murinos (Orthoclone, Panorex, Zevalin, Bexxar, Neutrospect, Verluma, e os para
diagnstico in vivo Myoscint, ProstaScint). Estes so alguns exemplos daqueles j
aprovados para o uso teraputico (Glennie & J ohnson, 2000). Diversos outros esto

Probabilidade de sucesso no desenvolvimento de anticorpos monoclonais.

Figura 4.1 Crescimento do Mercado de Anticorpos Monoclonais em 2002.
Adaptao da Fonte: Carius, 2004.

Essa transio de aplicao dos antic
medicina diagnstica sofisticadas e purificaes especficas para
teraputica, indicativa do sucesso alcanado. Espera-se que o mercado de
anticorpos teraputicos cresa cerca de duas vezes mais rpido que todo o setor
farmacutico. Aliado a este

Os nicos pontos que podero afetar o crescimento desse setor so,
principalmente, os conflitos de patente e propriedade intelectual, as questes de
aprovao regulatria no resolvidas, produes para satisfazer a demanda da
indstria farmacutica, implicaes da significativa reduo de custos na p
Confirmao
do Objetivo
Seleo do Pr-Clnico Fase I Fase II Fase III Registro
23% 55% composto
lder
95% 29% 53%
98
em fase de testes clnicos, conforme demonstrado na tabela 2.1 da Parte I desta
dissertao.

Nos prximos anos, o mercado dever ser invadido por essas
imunoglobulinas de ltima gerao. A perspectiva de que a tecnologia de
anticorpos recombinantes venha a fornecer insumos para diversas reas da
medicina, desde agentes imunomoduladores at vacinas recombinantes. Alm disso,
a tecnologia de humanizao de anticor
s. Estes, direcionados ao tratamento de
doena gn a im ncia edicina, como o cncer (no diagnstico e
tratam infeces e
es SIDA e
doenas auto imunes do si ulonefrite por IgA, prpura
trombocitopnica idioptica, doena de Graves, anemia hemoltica auto-imune,
glomerulonefrite membranosa, artrite
prspero e promissor mercado, na m
pos monoclonais se agrega a uma nova
classe de medicamentos, os biofrmaco
s de si ificativ port na m
ento de tumores e metstases), focos ocultos de infeco,
condi clnicas diversas tais como spsis, rejeio de transplantes,
- stema nervoso como a glomer
reumatide, asma, lpus eritematoso
sistmico, entre outras (Hon, 2004). Os anticorpos podem ser usados isoladamente,
associados a agentes quimioterpicos ou a agentes radioativos na
radioimunoterapia (Maranho & Brgido, 2001).

Tanto as grandes indstrias farmacuticas quanto os pequenos
laboratrios da rea da biotecnologia esto se envolvendo cada vez mais nesse
edida em que aumenta a demanda para
produtos teraputicos e protenas biofarmacuticas. O aumento de escala dessa
produo requer mtodos eficientes de bioprocessos, como a utilizao de
biorreatores e sistemas de purificao eficientes que proporcionem alto rendimento.

99
O Mercado Global de Teraputica do Cncer

mercado total para a comercializao de anticorpos teraputicos
consiste em u
togenia, tornando a possibilidade do
desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais infindvel. A sua utilizao
tornar cada v

do anticorpo monoclonal importado anti-CD20 (INCA, 2003). A inteno de Bio-
Manguinhos assumir esse segmento de mercado, hoje inteiramente sujeito
importao do produto.

A produo por Bio-Manguinhos dos anticorpos monoclonais
humanizados em larga escala ter, com toda certeza, grande absoro no mercado
nacional.

O
ma oportunidade multibilionria para as grandes indstrias. Somente o
cncer e a artrite, suas maiores aplicaes, tm estimativa de US$ 15 e US$ 25
bilhes para 2010, respectivamente (Roque, 2004).

A busca por um tratamento efetivo do cncer continua a ser uma das
maiores prioridades das empresas farmacuticas. Nenhuma outra rea de pesquisa
comparvel em termos de nmeros de drogas em desenvolvimento. Em 2001,
cerca de 1700 novos medicamentos candidatos para a terapia das diversas formas
do cncer e novas indicaes estavam em desenvolvimento, e o potencial do
mercado enorme, aps o primeiro produto chegar ao comrcio (Miller, 2003).

Portanto, o potencial econmico agregado a essa nova classe de
drogas extremamente vasto. A ampliao do conhecimento dos mecanismos
ntimos das doenas, atravs da biologia molecular, aumenta o nmero de antgenos
correspondentes a pontos cruciais na sua fisiopa
ez mais eficiente o diagnstico e tratamento de inmeras doenas que
acometem a humanidade.

A ttulo de comparao, o governo brasileiro, atravs do INCA, arcou,
de janeiro de 2002 a agosto de 2003, com despesas da ordem de US$ 100 mil, no
tratamento de pacientes portadores do Linfoma No-Hodgkin (LNH), com aquisies
100
CONCLUSO

se traduz em forte indicativo de
que o momento propcio a novos e consistentes investimentos nessa rea. Nos
prximos an
1. O LATAM, que j possui o am
anticorpos monoclonais muri
humanizao, ser possvel reduzir
consideravelmente os gastos, no s das instituies nacionais da rea de
pacto social imediato da produo brasileira de monoclonais
de mortalidade da populao acometida
por neoplasias, especialm
ada eficcia a um custo acessvel.

4. A proposta de viabilizar a introduo da metodologia de
humanizao de anticorpos monoclonais em Bio-Manguinhos exigir um significativo
processo de reestruturao, no s fsica - com o redimensionamento das reas

A utilizao de frmacos base de biomolculas recombinantes vem
se tornando uma realidade. O mercado mundial para anticorpos humanizados com
fins teraputicos est em franca ascendncia, o que
os, prevista uma disseminao dessas imunoglobulinas de ltima
gerao no mercado.

A partir do estudo realizado podem ser extradas as seguintes e mais
importantes concluses:

plo domnio da tcnica de produo de
nos e detendo uma grande diversidade de clones para
antgenos especficos, aps sua reestruturao, introduzir a Unidade de Bio-
Manguinhos em um crescente e promissor mercado de anticorpos teraputicos,
abrindo assim, a possibilidade de atuar em novas frentes de pesquisa,
desenvolvimento e comercializao.

2. Com o domnio da tecnologia de
oncologia, como do prprio pas, desonerando a balana comercial brasileira com a
reduo de gastos com a importao desses anticorpos e possibilitando o acesso a
uma tecnologia de ponta.

3. Como im
humanizados, haver a reduo das taxas
ente do tipo LNH doena de difcil tratamento que
acomete milhares de pessoas - e a elevao da expectativa e qualidade de vida, por
meio de emprego de medicamentos de comprov
101
comuns ao LATAM - como tambm humana, sendo imprescindvel a contratao e a
ualificao de profissionais nas reas de imunologia e biologia celular e molecular e
engenharia.
onhecimento cientfico Unidade.
disponvel no mercado internacional quimrico e, com o
uso prolongado, gera reao imune no paciente. A produo do anticorpo
humanizado no Brasil possibilitar, sem dvida, sensvel ou total reduo da
pos, idealizar, discutir, pesquisar,
Manguinhos a fim de que, no mais curto espao de tempo, assuma uma posio de
e qualificao prtica, tornou possvel aos seus participantes a introduo de novas
idias, metodologias e sua concretizao futura, em prol do crescimento da
instituio.
q

5. O desenvolvimento, em escala de produo, de anticorpos
monoclonais humanizados em Bio-Manguinhos, envolver tambm parcerias e
colaboraes com outras instituies e centros de pesquisa, tanto por meio de
acordos colaborativos quanto por contratos eficientes, qualificando, no s a equipe,
como acrescentando c

Pelo exposto, a proposta idealizada nesta dissertao extremamente
vivel. O anticorpo hoje
resposta imune, e potencializar a aplicao do produto, com a conquista do
mercado nacional de anticorpos teraputicos usados do Linfoma No-Hodgkin
(LNH).

Em matria de humanizao de anticor
organizar, estruturar, empreender e efetivar, so metas a serem percorridas por Bio-
destaque no domnio dessa tcnica.

Nesse particular, fica aqui parabenizada a iniciativa de criao do
presente Mestrado Profissional que, empregando conhecimento acadmico-cientfico


102
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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J aneiro: Livraria e Editora Revinter Ltda; 2000.

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