DETERMINACIN DE COLORANTES Y PIGMENTOS

NATURALES Y ARTIFICIALES
INTRODUCCIN
La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que
absorbe la luz necesaria para la fotosntesis. La clorofila absorbe principalmente luz
violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su
ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las
plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros
pigmentos. La extraccin y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para es
estudio y conocimiento de sus propiedades. Los Pigmentos vegetales, que se
encuentran en los cloroplastos, son molculas qumicas que reflejan o transmiten la
luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la
absorcin selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexin de otras.
Constituyen el sustrato fisicoqumico donde se asienta el proceso fotosinttico.
Hay diversas clases de pigmentos:
Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloracin verde.
Accesorios:
Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloracin amarilla y rojas.
Ficobilinas de coloracin azul y roja presentes en las algas verdeazuladas, que
comprenden el filo de los Cianofitos.
La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de
absorber la luz necesaria para realizar la fotosntesis, proceso que posibilita la sntesis
de sustancias orgnicas a partir de las inorgnicas (CO2, H2O y sales minerales),
mediante la transformacin de la energa luminosa en energa qumica. La clorofila
absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. Generalmente la
abundancia de clorofila en las hojas y su presencia ocasional en otros tejidos
vegetales, como los tallos, tien de verde estas partes de las plantas.
PIGMENTOS VEGETALES
Los colores que presentan los
vegetales son debidos a unos
compuestos qumicos llamados
pigmentos. El color que presenta un
determinado rgano vegetal depende
generalmente del predominio de uno
u otro pigmento o la combinacin de
ellos. Adems, algunos de los
pigmentos que condicionan el color
estn estrechamente ligados a las
actividades fisiolgicas del propio
vegetal.



El color verde en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos
estrechamente emparentados llamados clorofila A y clorofila B. Se encuentran
prcticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Tambin
aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se
extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all la
presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dems pigmentos.
Asociados con las clorofilas, existen tambin en los cloroplastos dos clases de
pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son las xantofilas y carotenos.
CLOROFILAS
En las plantas superiores, la fotosntesis es posible debido a la presencia en el
cloroplasto, concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de pigmentos
que tienen capacidad para captar la luz. Existen dos tipos bsicos de pigmentos
fotosintticos:
Clorofilas. Compuestas por una porfirina que lleva incorporado un tomo de magnesio
en el centro del ncleo tetrapirrlico . El in Mg2* est coordinado con los cuatro
tomos de nitrgeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo
extraordinariamente estable. La "cabeza" que acabamos de describir, est unida a una
"cola", el fitol, que es un alcohol de 20 tomos de carbono. Cabeza y cola se unen a
travs de un enlace ster en el que intervienen el grupo alcohlico del fitol y el grupo
carboxilo de un cido propinico que est unido al anillo IV del ncleo tetrapirrlico.
Existen varios tipos de clorofilas, las ms importantes de las cuales son la "a", y la "b".
La clorofila a tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras que la clorofila b tiene un
grupo -CHO en esa misma posicin.
Carotenoides. Actan como pigmentos
accesorios en el proceso de la
fotosntesis. Existen dos tipos de
pigmentos carotenoides: carotenos y
xantofilas.
Los carotenos son hidrocarburos
isoprenoides que no contienen oxgeno y
estn formados por largas molculas con
un sistema de enlaces conjugados
alternantes, dobles y sencillos, rematados
en cada extremo por un anillo de
ciclohexano insaturado- tienen color
amarillo-anaranjado.


Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia
estriba en la incorporacin de oxgeno en los extremos de la molcula. Segn el grupo
que se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo.
Como se seal anteriormente la energa lumnica pueda ser utilizada por los sistemas
vivos, primero debe ser absorbida y quienes realizan esta funcin son los pigmentos
fotosintticos. Los pigmentos son sustancias que absorben luz; algunos absorben luz
de todas las longitudes de onda y, por lo tanto, parecen negros. Otros, solamente
absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo o reflejando las longitudes de onda
que no absorben. La clorofila, el pigmento que hace que las hojas se vean verdes,
absorbe luz en las longitudes de onda del violeta y del azul y tambin en el rojo. Dado
que refleja la luz verde, parece verde.

CROMATOGRAFA
Las tcnicas cromatogrficas para el anlisis y purificacin de los productos de
reaccin son ampliamente utilizadas en el laboratorio orgnico. La tcnica
cromatogrfica de purificacin consiste en separar mezclas de compuestos mediante
la exposicin de dicha mezcla a un sistema bifsico equilibrado. Todas las tcnicas
cromatogrficas dependen de la distribucin de los componentes de la mezcla entre
dos fases inmiscibles: una fase mvil, llamada tambin activa, que transporta las
sustancias que se separan y que progresa en relacin con la otra, denominada fase
estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede ser
un slido o un lquido. Las combinaciones de estos componentes dan lugar a los
distintos tipos de tcnicas cromatogrficas que aparecen en la siguiente tabla:


Cromatografa de adsorcin.
Dentro de esta tcnica pueden diferenciarse dos tipos de cromatografas de adsorcin
denominadas cromatografa cromatografa de columna y de capa fina (abreviada TLC,
del ingls Thin Layer Chromatography). Para la tcnica de cromatografa de adsorcin
en columna se emplean columnas verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con
una llave que permita la regulacin del flujo de la fase mvil. Las columnas se rellenan
con un adsorbente, como almina o gel de slice (fase estacionaria), mojado con el
disolvente que se vaya a emplear en el proceso cromatogrfico. En la parte superior
de la columna se pone la disolucin de la mezcla a separar y a continuacin un
depsito que contenga el eluyente (fase mvil) que se va a utilizar en la separacin.
Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a bajar por la columna.
En este proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase
estacionaria con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorcin-
desorcin hace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros. El lquido
que sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si los
componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrn obtener
fracciones cromatogrficas constituidas por un solo componente.
En toda cromatografa hablaremos de los siguientes trminos:
matriz de la columa. Sustancia que est empapada de solvente y que se
empaqueta en la columna. Tambin se denomina el lecho de la columna.
Longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la
columna. Es importante en algunos tipos de cromatografa como la de filtracin en
gel y poco importante en otras como la cromatografa de afinidad.
Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatogrfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el
volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta
que empieza a salir la primera protena. En general, y dependiendo del tipo de
cromatografa puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.
'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio inico o de afinidad, el volumen
de solvente ms protenas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.
Correspondera en el caso de la cromatografa de afinidad al volumen de solvente
que contiene las protenas no afines al ligando.

OBJETIVOS
Escoger el material adecuado para extraer clorofilas.
Aplicar experimentalmente la extraccin por solventes.
Empacar y desarrollar una columna de fraccionamiento.
Indicar los diferentes pigmentos fotosintticos en la columna de acuerdo a su
polaridad

MATERIALES
2 vasos de precipitado de 250 ml.
1 vaso de precipitado de 150mL.
1 probeta de 100ml Papel filtro.
1 mechero.
1 columna cromatogrfica (2X20cm).
1 lana de vidrio.
MATERIAL BIOLGICO Hojas de espinaca fresca.




PROCEDIMIENTO





CROMATOGRAFA EN CAPA FINA, ASCENDENTE SIMPLE (TLC)




MTODO: CROMATOGRAFA
Para separar y obtener estos pigmentos emplearemos la cromatografa. Tcnica que
permite la separacin de las sustancias de una mezcla que tiene la afinidad diferente
por el disolvente en que se encuentran.
De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla, el disolvente arrastra
con distinta velocidad a los pigmentos segn la velocidad que tengan, y los separa
permitiendo identificarlos perfectamente segn su color.
MATERIALES
Un ejemplo claro es en la determinacin de pigmentos en hojas de planta
Hoja de espinaca o de cualquier planta cortada en pedazos.
Alcohol de 96( sirve el que utilizamos para desinfectar heridad)
Un mortero
Dos filtros de caf
Un embudo
Un vaso
Un tubo(o similar)
Celo

METODOLOGA
1. Colocar en el mortero las hojas que hallas elegido, aadir un poco de alcohol y
triturarlas hasta que el alcohol adquiera un verde tinte intenso.

2. Filtrar el lquido utilizando el embudo en el que se habr puesto uno de los
filtros de caf.

3. Recortar unas tiras de papel del otro filtro, e introducirlo en el vaso hasta que
toque el fondo, procurar de que se mantengan verticales ayudndonos con el
tubo de plstico.

4. Esperar 30 minutos y aparecern en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que sealan a los distintos pigmentos.

RECOMENDACIONES O SUGERENCIAS
En lugar de colocar en papel en un vaso, es mucho ms cmodo verter la
solucin de pigmentos sobre una placa Petri y colocar el papel doblado en
ngulo sobre ella.
Repetir el experimento con hojas de diferentes colores para observar los
diferentes pigmentos que encontremos en ellas.

EXPLICACIN
Los pigmentos presentan diferentes grados de solubilidad, lo cual permite su
separacin cuando uno de ellos asciende por capilaridad por una tira de papel
poroso (filtro de caf).
Los ms solubles se desplazaran a mayor velocidad ya que acompaaran
fcilmente al disolvente a medida que este va ascendiendo.



EXTRACCIN DE PIGMENTOS EN ZANAHORIA
La calidad de los alimentos posee dos componentes fundamentales: uno relacionado
con los aspectos tecnolgicos y otro relacionado con la seguridad y la aceptacin por
parte del consumidor.
METODOLOGA
1. Se pic y peso 10 gr de zanahoria para extraer los pigmentos.
2. Se calent en 5ml de alcohol al 95% en un vaso de precipitado de 150ml a una
temperatura no mayor a 60C. (debido a que estos pigmentos son pocos
solubles en etanol y el punto de ebullicin es bajo).
3. Se re extrajo con otros 5ml de alcohol a 95% previamente calentado hasta que
el extracto de zanahoria haya quedado prcticamente incoloro y se reunieron
los extractos.
(Se obtuvo una solucin de color amarillo naranja demostrando la presencia de
xantofilas y carotenos)
4. Se calent la solucin amarilla y se diluyo aproximadamente el 85% de alcohol
con 4.5 ml de agua destilada, despus se dej enfriar a temperatura ambiente.

5. Para separar estos pigmentos, se agito la solucin en un embudo de
separacin con 10ml de acetona, permitiendo reposo para hacer visible las dos
fases; (en la fase orgnica se separaron los carotenos por medio de lavados, y
en la acuosa a las xantofilas que despus se desecharon pues no era producto
de inters.

6. Se disolvi el residuo en 2ml de acetona antes de pasar a la columna.

SEPARACIN DE CAROTENOS (, , CAROTENOS).

1. Se disolvieron 10 gr de almina en etanol al 95% hasta cubrirla y se introdujo
en la columna para cromatografa.
2. La muestra fue introducida por una pipeta Pasteur y se permiti reposar para
observar la separacin de carotenos. (al realizar la separacin de carotenos
por el mtodo de cromatografa en la columna; se lograron obtener los 3 tipos
que existen:
carotenos (4.6ml)
caroteno (2.7ml) y
carotenos (6.4ml)
*Se utiliz como eluyente ter de petrleo_ acetona (95:5)