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Manual de Laboratorio
de
Calidad Fitosanitaria de Semillas de Hortalizas
Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro
Centro de Capacitacin y Desarrollo en Tecnologa de Semillas
Dra. Leila M. Vsquez Silller
Editora
ISBN EN TRMITE
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BACTERIAS
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CURSO TALLER
CALIDAD FITOSANITARIA DE SEMILLAS DE HORTALIZAS

PRUEBAS MICROBIOLGICAS PARA LA DETECCIN DE
BACTERIAS TRANSPORTADAS POR SEMILLAS DE CULTIVOS HORTCOLAS.

Rosa Navarrete Maya
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OBJETIVO GENERAL:

Capacitarse en la aplicacin de tcnicas convencionales para detectar y cuantificar
fitopatgenos transportados por semillas sexuales y asexuales de hortalizas.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

- Familiarizarse con las tcnicas de extraccin de bacterias de semillas de hortalizas.
- Conocer la metodologa para la identificacin de bacterias asociadas a semillas de
hortalizas.
- Conocer las caractersticas morfolgicas que distinguen a las bacterias asociadas a semillas
de hortalizas, en preparaciones temporales y permanentes.

ACTIVIDADES:


ACTIVIDADES:

1.- Observacin de semillas en seco 1 y 2

2.- Extraccin de bacterias de semillas de hortalizas enteras

3.- Resiembras de las colonias individuales que haya obtenido de las muestras de semillas
en medios semiselectivos y/o selectivos, o bien utilice las siembras de bacterias jvenes
disponibles.

4.- Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes de bacterias.

5.- Tincin de bacterias por el mtodo de Gram. Reaccin de Ryu para separacin de
bacterias en Gram + y -.

6.- Observacin de preparaciones temporales y permanentes de bacterias.

7.- Realice esquemas o fotografias de todo lo observado.


I) PRUEBAS SIN INCUBACIN.

I A. OBSERVACIN DE SEMILLAS EN SECO:

1.- Tome una muestra de semillas de hortalizas, colquela en una caja Petri y observe con
ayuda de una lupa o microscopio de diseccin. Las semillas con infeccin por bacterias
generalmente presentan manchas o costras de diferente color, que representan exudados
bacterianos. Puede

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UNIDAD DE INVESTIGACIN EN GRANOS Y SEMILLAS (UNIGRAS), FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES CUAUTITLN (FES-C), UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO (UNAM)
rosa_navarrete@hotmail.com
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cuantificar las semillas manchadas y obtener el porcentaje sospechoso de estar infectado por
bacterias.

PRECAUCIN PARA REALIZAR EL SIGUIENTE EJERCICIO DEBE EVITAR EL
CONTACTO DIRECTO CON LA LUZ UTRAVIOLETA, NI A LA PIEL NI A LOS OJOS, LA
SOBREXPOSICIN GENERA QUEMADURA. UTILICE UN ESPACIO CONFINADO Y
OBSCURO PARA HACER ESTA PRUEBA

2.- Tome una muestra de 40 semillas de frijol de color claro y obsrvelas bajo luz ultravioleta,
si la semillas presentan autofluorescencia, es indicativo de que estn infectadas por
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Puede cuantificar las semillas que fluorescen y
obtener el porcentaje sospechoso.

II) PRUEBAS CON INCUBACIN.

ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR, DESINFECTE LA MESA CON SOLUCIN DE
HIPOCLORITO DE SODIO AL 2 %.

II A. EXTRACCIN DE BACTERIAS DE SEMILLAS DE HORTALIZAS ENTERAS.

1.- Obtenga una muestra de 100 semillas de hortalizas (si son pequeas) o 50 (si son
grandes),

2.- Remoje la muestra de semillas en la solucin seleccionada, utilice 10 ml para cada 1,
000 semillas o 250 ml para 10, 000 semillas pequeas, aplique las instrucciones siguientes:

a) remojo esttico a 4 C durante la noche en solucin de cloruro de sodio al 0.85 % con
Tween 20 al 0.2%
b) remojo esttico a 4 C durante la noche en agua estril
c) remojo con agitacin continua por media hora a temperatura ambiente a 180 rpm en
solucin de cloruro de sodio al 0.85 % con Tween 20 al 0.2%
d) remojo con agitacin continua por media hora a temperatura ambiente a 180 rpm en agua
estril

B) EXTRACCIN DE BACTERIAS DE SEMILLAS DE HORTALIZAS FRACCIONADAS O
MACERADAS

1.- Tome una muestra de un gramo de semilla de frijol, aproximadamente 3 semillas de
tamao similar crtelas en pequeas porciones con navaja estril, macrelas en mortero estril
o licelas.
2.- Incube a 10 C por 30 min en tubos con agua destilada estril. Coloque los tubos en un
vortex por 30 segundos, filtre la solucin en doble gasa.
3.- Haga diluciones en serie, de cada una tome 1 ml y siembre en PDA, 5 cajas por
repeticin.
4.- Incube a 20 C por 3 das y cuente las unidades formadoras de colonias.

C) SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS SELECTIVOS Y SEMISELECTIVOS:

Los medios semi selectivos y selectivos a utilizar sern: Papa dextrosa agar (PDA), agar
nutritivo (AN), YDC, B de King, AN con almidny el de Hugh y Leifson.

a) Tome una alicuota del agua de remojo de 0.1 ml para cada caja de Petri, colquela en el
centro y distribyala con ayuda de un tringulo de vidrio estril (flameado con alcohol y fro).
Rotule la caja con fecha y nmero de muestra.
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b) Con el asa microbiolgica flameada y fra tome agua del remojo. Estre en forma de zig
zag (3 lneas) en uno de los extremos de la caja de Petri con medio
semiselectivo. Flame nuevamente, enfri en el medio y vuelva a estriar en zig - zag inicie en
la ltima lnea estriada, repita dos veces ms. Rotule la caja con fecha y nmero de muestra.

c) Siembre semillas de su muestra directamente sobre la caja Petri con medio selectivo.
Debe desinfectar las semillas en una solucin de hipoclorito de sodio al 2% durante 2 minutos
con agitacin continua y eliminar el exceso de hipoclorito secando las semillas en papel
absorbente estril. Distribuya las semillas en la superficie de la caja Petri separadas de manera
equidistante, si son semillas grandes coloque de 10 a 15 por caja, si son pequeas puede
colocar 50 por caja.

D) IDENTIFICACIN DE BACTERIAS ASOCIADAS A SEMILLAS DE HORTALIZAS.

Esta actividad se basa en la morfologa y fisiologa de las bacterias, como se seala en las
clave para la identificacin de Gneros comunes de bacterias fitopatgenas y en el
Esquema para diferenciar gneros de bacterias comnmente aisladas de vegetales,
las cuales estn al final de este protocolo.


RECOMENDACIONES IMPORTANTES:

1.- ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR, DESINFECTE LA MESA CON SOLUCIN DE
CLORO AL 2 %.

2.- CON LAS PINZAS DE DISECCIN TOME UN PORTAOBJETOS DEL FRASCO CON
ALCOHOL Y FLAMELO. DEJE ENFRIAR, TOME LOS PORTAOBJETOS POR LOS LADOS,
SIN TOCAR LA PARTE PLANA, PARA EVITAR LLENARLOS DE LA GRASA DE SUS
DEDOS. CUANDO TIA COLOQUE LOS PORTAOBJETOS SOBRE UN TRANGULO DE
VIDRIO DENTRO DE UNA CAJA PETRI.

3.- DEBIDO A QUE UTILIZAR DIVERSOS COLORANTES, HGALO CON PRECAUCIN
PARA EVITAR MANCHAR SU ROPA, OBJETOS Y/O SU MANO. ALGUNOS REACTIVOS
PUEDEN CAUSAR IRRITACIN EN LA PIEL. PARA ELIMINAR LOS COLORANTES UTILICE
EL VERTEDERO DE LA MESA O EL RECIPIENTE DESTINADO PARA ELLO.

4.- SIEMPRE QUE VAYA A OBSERVAR EN EL MICROSCOPIO INICIE POR LOCALIZAR UN
CAMPO DESPEJADO CON EL OBJETIVO DE 10X, LUEGO CAMBIE AL DE 40X Y
DESPUS AL DE 100X, EN ESTE LTIMO SE NECESITA AGREGAR ACEITE DE
INMERSIN. SI DESEA BUSCAR OTRO CAMPO USE EL OBJETIVO DE 10X, NUNCA USE
EL DE 40X SI YA AGREG ACEITE DE INMERSIN. SI OCURRE ACCIDENTALMENTE,
SEQUE EL ACEITE DEL OBJETIVO DE 40X INMEDIATAMENTE CON PAPEL SEDA.


I. TCNICA PARA REALIZAR PREPARACIONES TEMPORALES

1.- Trabaje cerca de la flama. Flamee el asa o aguja de diseccin para evitar
contaminaciones y permita que enfre antes de tomar la muestra de bacterias.

2.- En un portaobjetos limpio coloque una gota de agua destilada. Con el asa tome una
pequea muestra de microorganismos del cultivo y colquela en la gota.

3.- Coloque el cubreobjetos evitando que se formen burbujas depostelo inclinado sobre la
gota, y cuando el lquido se haya extendido por el borde, deje caer el cubreobjetos
suavemente.
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4.- Observe la preparacin al microscopio usando diferentes objetivos. Siempre se empieza
por 10X. Recuerde que a 100X es necesario usar aceite de inmersin. Observe la motilidad de
las bacterias.

5.- Puede teir la preparacin, aada una gota de safranina y permita que penetre en la
preparacin por capilaridad.

II. COLORACION DE GRAM.

1.- Elabore un frotis, con un cultivo de 24 horas. Coloque una gota de agua en un extremo
del portaobjetos, agregue una pequea cantidad de bacterias con el asa de siembra o con la
aguja de diseccin, mezcle suavemente. Tome otro portaobjetos limpio y colquelo por su lado
mas angosto en forma diagonal sobre el portaobjetos con la muestra, deslice de modo firme y
rpido el cubreobjetos superior.

2.- Permita que seque la muestra del frotis, o bien squela pasando varias veces por la
flama del mechero. PRECAUCIN NO DEJE EL PORTAOBJETOS SOBRE LA FLAMA
PORQUE SE ESTRELLA Y USTED SE PUEDE QUEMAR.

3.- Cubra la preparacin con cristal violeta 1 min. y decante.

4.- Cubra la preparacin con lugol 1 min y lave con agua corriente.

5.- Decolore con alcohol etlico por 30 segundos agitando para una decoloracin
homognea, lave con agua corriente.

6.- Cubra la coloracin con safranina 1 min. y lave con agua corriente.

7.- SIN FROTAR. Absorba el agua con papel.

8.- Observe al microscopio.

III. TCNICA DE RYU PARA SEPARACIN DE BACTERIAS GRAM + Y GRAM -

1.- En un portaobjetos limpio coloque una gota de solucin de KOH al 2%. Con el asa tome
una pequea muestra de microorganismos del cultivo y colquela en la gota.

2.- Mezcle suavemente y despus de 30 segundos eleve el asa sobre la gota, observe con
cuidado.

3.- Si se forma un filamento se considera Gram -, de lo contrario es Gram +
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MATERIALES Y METODOS.

Porta y cubreobjetos desinfectados en alcohol Gotero con cristal violeta para tincin de Gram
Caja de Petri Gotero con safranina para tincin de Gram
Agujas de diseccin Gotero con tinta china bacteriolgica
Asa de siembra Mechero
Gotero con KOH AL 3% Gotero con agua estril
Pipetas Papel seda
Cultivos de bacterias Gotero con lugol
Preparaciones de bacterias Gotero con alcohol etlico
Semillas de hortalizas Tringulos de vidrio
Papel absorbente


Reactivos:

COLORACION DE GRAM.

Solucin de Cristal violeta con oxalato de amonio:
Solucin A: Solucin B:
Cristal violeta2.0g Oxalato de
amonio..0.8g
Alcohol etlico20ml Agua
destilada.80ml
Mezclar las soluciones A y B

Solucin lugol Colorante de contraste
Yodo1.0g Safranina al 2.5% en alcohol
etlico
KI.2.0g al 95%................10ml
Agua destilada...100ml Agua
destilada.100ml


REACTIVO DE RYU

KOH ..............................................................2g
Agua destilada100ml


MEDIOS DE CULTIVO

1.- PDA (papa-dextrosa-agar)
Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento, crecimiento y reproduccin de varios
hongos y de bacterias como Xanthomonas y Agrobacterium.

Ingredientes :
Papa......................................200gr Dextrosa.............................20gr.
Agar........................................ 15gr. Agua destilada....................aforar a 1000 ml

Procedimiento:

Partir 200 gr. de papa sin cscara y cubrirlo con agua destilada.
Se deja hervir durante 15 min. Concluido ste tiempo se cuela la infusin o caldo de papa a
travs de manta de cielo.
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Se disuelve el agar en 500 ml. de agua destilada, calentando ligeramente, se le agrega la dextrosa
y se disuelve. Se aade la solucin de agar dextrosa al caldo de papa mezclando bien y se afora
con agua destilada a 1000 ml. y se esteriliza.

Tambin se vende deshidratado, se prepara de acuerdo a la etiqueta.

2.- AN ( agar nutritivo o extracto de carne-agar)

Este medio de cultivo nos sirve para cultivar bacterias como Erwinia, Pseudomonas y
Corynebacterium.

Ingredientes:

Extracto de carne
de res..................................................3gr. agua destilada.................aforar a 1000ml.
Peptona...............................................15gr. agar..................................5 gr.

Procedimiento:

Disolver el agar en 500 ml. de agua destilada calentando ligeramente, luego agregar la peptona
y el extracto de carne y disolver, por ltimo aforar con agua destilada a 1000 ml.

Tambin se vende deshidratado, se prepara de acuerdo a la etiqueta.

2' AN mas almidnSe prepara el medio AN y se le agregarn 15 g/L de almidn soluble

3.- BK (B de King).

Este medio de cultivo sirve para aislar diferentes gneros de bacterias.

Ingredientes:

Peptona...20 gr. Agar.15 gr.
Glicerina.10 ml K2HPO4..1.5 gr.
MgSO
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1.5 gr. Agua destiladaaforar a 1000 ml

Procedimiento:
Se disuelve el agar en 500 ml de agua calentando ligeramente y despus se le aade la glicerina.
En otros 300 ml de agua se disuelven los dems componentes agregndole a esta solucin la de
agar- glicerina. Se mezcla bien y se esteriliza. Medio especfico para la identificacin de
Pseudomonas spp.

4.- YDC (Extracto de levadura, dextrosa, carbonato de calcio)

Medio especfico para la identificacin de Xanthomonas spp.

Extracto de levadura.10 g Dextrosa15 g
Carbonato de calcio...15 g Agar...15 g
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Agua destilada.aforar a 1000 ml.

Procedimiento:

Se disuelve el agar en 500 ml de agua calentando ligeramente y despus se le aaden los dems
ingredientes. Se afora a 1000 ml, se mezcla bien y se esteriliza. Las cajas en donde se vaciar el
medio deben meterse al congelador por 30 min. Antes de vaciar el medio, ste debe agitarse
ligeramente. Al solidificarse el medio debe quedar blanco.


5.- Crecimiento anaerbico (Hugh y Leifson)

Para un litro de medio
Peptona ...................... 2 g NaCl............ 5 g
KH2PO4.................. 0.3 g Agar..... 3 g
Bromotimol azul (1% en solucin acuosa). 3 ml.

Procedimiento:

Se disuelven los ingredientes y se ajusta el pH a 7.1. Agregar 5 ml de medio basal a tubos de
ensaye de 13 cm y esterilizan a 121C por 20 min. Prepare solucin acuosa de glucosa al 10% y
esterilice por filtracin. Agregue 0.5 ml de la solucin de glucosa estril en forma asptica a
cada tubo de medio basal. Inocule dos tubos con cada cepa del organismo a probar. Cubra los
tubos con una capa de vaselina estril lquida o parafina de 5 mm. Un cambio de color de azul a
amarillo en ambos tubos se considera positivo para crecimiento anaerbico (fermentacin).

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CLAVE PARA GENEROS COMUNES DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

1a Formacin de micelio areo constituido por tres o mas esporas.
Tincin Gram +, pero no por fijacin alcohol cido ...................................................
Streptomyces
1b Ausencia de micelio. Tincin Gram + o Gram - ...................................................... 2

2a Colonias con coloracin amarilla o naranja en los medios NGA,
YDC o NBY ................................................................................................................... 3
2b Colonias con coloracin diferente a la anterior ........................................................ 4

3a Tincin Gram +. Aerobia obligada ...........................................................................
Clavibacter (Coryneform)
3b Tincin Gram - , Aerobia obligada ...........................................................................
Xanthomonas

4a Formacin de pigmento fluorescente. Gram - ..........................................................
Pseudomonas

Burkholderia
4b Sin formacin de pigmento fluorescente .................................................................. 5

5a Crecimiento anaerobio obligado con formacin de endosporas.
Tincin Gram +. En caso de crecer aerobios su crecimiento es limitado
y se inhibe la formacin de esporas.................................................................................
Clostridium
5b Crecimiento aerobio .................................................................................................. 6

6a Formacin de endosporas. Crecimiento aerobio o anaerobio facultativo.................. Bacillus
6b Sin formacin de endosporas .................................................................................... 7

7a Desarrollo sobre medio D1M ...................................................................................
Agrobacterium
7b No se desarrolla sobre medio D1M ........................................................................... 8

8a Aerobias facultativas ................................................................................................ Erwinia
8b Aerobias obligadas ....................................................... ........................................... Ralstonia



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BIBLIOGRAFIA.

Agarwal, V. K. and J. B. Sinclair. 1987. Principles of seed pathology. CRC Press, Inc. Boca Raton,
FL. 176 p.
Bradbury, J. F. 1984. Guide to plant pathogenic bacteria. CAB International. Wallingford, U. K. p.
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Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355 pp

Lpez F, M. C. 1994. Caminos de la fitobacteriologa. Universidad Autnoma Chapingo. Chapingo,
Edo. de Mxico. 216 p.
Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel Dekker Inc.,
518 pp.
RYU, E., 1938: On the Gram-differentiation of bacteria by the simplest method. / . Japan. Veter.
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Schaad, N. W. 1988. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 2nd. ed. APS
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Schaad, N.W., J. B. Jones, and W. Chun. 2001. laboratory guide of plant pathogenic bacteria. APS
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Sheppard, J. W., D. A. Roth and A. W. Saettler. 1989. Detection of Xanthomonas campestris pv.
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Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant pathogenic fungi. CAB
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Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S. 2004. Plant pathology, Concepts and
Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 413 pp.



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HONGOS
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PROTOCOLOS DE HONGOS EN SEMILLA.


Prueba de lavado de semilla.

Procedimiento:
Peso de la muestra de trabajo (depende del propsito), para hongos colocarla en una bolsa de
plstico y golpearla para quebrar la semilla y retirar las teliosporas.
Llevar las semillas a un frasco Erlenmeyer, agregar la agua necesaria para cubrir las semillas
y 1 o 2 gotas de Tween 20.
Agitar las semillas vigorosamente por un lapso de 5 a 10 minutos. Preferentemente en un
agitador.
Cuele el agua utilizando un pao.
Transfiera cantidades iguales de agua a tubos para centrifuga y centrifugue a 1500-3000 rpm
de 2-10 minutos.
Desechar el agua y mantener los tubos invertidos, con papel absorbente quitar las gotas de
los bordes.
Agregue 1 ml de agua o 1 ml de solucin de Shears al sedimento en cada uno de los tubos,
mezcle el sedimento con la ayuda de una aguja puede ser necesario en algunos casos raspar
el sedimento cuando se pega a las paredes de los tubos.
La solucin de Shears facilita la observacin de las teliosporas as como su envoltura
gelatinosa.
La examinacin se debe hacer primero en una ampliacin ms baja y ms adelante en
ampliaciones ms altas.
Registrar los nombres de los patgeno observados en el Seed Health Report, esto
proporciona las posibilidades del tener informacin cualitativa y cuantitativa del patgeno.
Una vez hecho lo anterior mediante la ayuda de un hematocitometro se hace el conteo de
esporas.
Una vez que el usuario es familiar con la acumulacin del compartimiento de cuenta, los
cuatro pasos siguientes deben ser seguidos.
Colocar el hematocitometro.
Colocar suspensin de esporas.
Contar esporas.
Definir especies involucradas.
Mtodo de identificacin de hongos en semilla (Freezing Blotter)

Tratamiento previo:
Se remojaron las semillas durante tres minutos en una solucin al 10% de hipoclorito de
sodio para evitar la presencia de patgenos.
Posteriormente se enjuagaron con agua destilada.

Procedimiento:
Se colocaron las semillas separadas por espacios uniformes sobre 2 4 capas de papel
secante hmedas en cajas transparentes de plstico.
Se sellaron cajas con parafilm y se incubaron a 20 C durante dos das (12h con luz blanca y
12h con oscuridad).
Se pusieron las cajas en el congelador a una temperatura de 15 a -20 C durante un da.
Por ltimo se dejaron a 20 C durante once das


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Mtodo de medio de Cultivo en Cajas Petri.

Procedimiento:
Uso de medios de cultivo para sembrar semillas.
Preparacin de medios cultivo.
Incubacin de semillas.
Esporulacin de colonias en medios de cultivo.

Medios de cultivo ms utilizados.
JUGO V8-AGAR
a). Esta formula se utiliza para llevar aislamientos de Phytophthora infestans, as como para inducir
la produccin de oosporas de esta especie. (Romero y Gallegly, 1963). Tambin se utiliza para
aislar otras especies de gnero Phytophthora y del gnero Pythium.
Ingredientes:
Jugo de verduras V-8 centrifugado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 ml. (se obtiene de 300 ml.
de jugo V8
CaCO
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 g
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g
Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aforar a 1000 ml.

En esta formula es conveniente substituir el jugo V8 por jugo de tomate en la misma proporcin, en
aquellos casos donde se dificulta el desarrollo de algunas especies del gnero Phytophthora.
b). En la siguiente formula se recomienda para inducir la produccin de esporangios de
Phytophthora parasitica y Phytophthora palmivora. (Hine y Aragaki, 1963).
Ingredientes:
Jugo de verduras V8 centrifugado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml.
(Se obtiene de 150 ml. de jugo V8)
CaCO
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g
Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 900 ml

Procedimiento para la preparacin de las frmulas (a) y (b):
Agregar el CaCO
3
al jugo de verduras V8, agitar hasta disolverlo, dejar reposar esta solucin
durante 10 minutos.
Para clarificar la solucin centrifugar durante 20 minutos a 3000 R P. M. Decantar y juntar el
lquido sin slidos, resultante de la centrifugacin, hasta completar la cantidad requerida.
Con la formula (a), disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente, aadir la solucin de
agar al jugo de verduras V8 centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 ml.
Para la frmula (a), disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente, aadir la solucin de
agar al jugo de verduras V8 centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 ml.
Para la formula (b), utilizar los 900 ml de agua destilada para disolver el agar, mezclando esta
solucin con el jugo de verduras V8 centrifugado.
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JUGO DE TOMATE-AGAR (Redondo, 1974)

Este medio de cultivo es apropiado para efectuar aislamientos de Phytophthora capsici, as como
para lograr un adecuado crecimiento vegetativo. La produccin de esporangios se logra
transfiriendo discos del medio de cultivo con micelio del hongo a cajas de petri con agua destilada,
despus de 24-48 horas a temperatura ambiente, se presenta la esporulacin.
Ingredientes:
Jugo de tomate centrifugado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 ml
(Se obtiene de 90 ml de jugo de tomate)
CaCO
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 g
Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g
Agua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 950 g
Procedimiento
Disolver el CaCO
3
en 90-85 ml de jugo de tomate agitando, dejar reposar esta solucin durante 10
minutos. Para clarificar centrifugar durante 20 minutos a 3000 R. P. M. decantar y juntar el lquido
centrifugado hasta completar la cantidad requerida.
Disolver el agar en 950 ml de agua destilada, aadir la solucin centrifugada a la solucin de agar,
mezclando bien

PREPARACION CON EL MEDIO DESHIDRATADO (Annimo, 1953)
En 1000 ml de agua destilada, agregar 51 g del medio de cultivo deshidratado y disolverlo
calentando ligeramente.
PAPA-DEXTROSA-AGAR (PDA)
Este medio de cultivo se utiliza en el aislamiento, desarrollo y reproduccin de un gran nmero de
especies de hongos. Para bacterias se utiliza ene l aislamiento inicial, principalmente de los gneros
Xanthomonas y Agrobacterium, puesto que las bacterias necesitan medio de cultivo especficos
para el desarrollo y as lograr la identificacin de los diferentes gneros.

Ingredientes:
Papa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 g
Dextrosa. . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g
Agua destilada. . . . . . . . . . . . . Aforar a 1000
ml

Procedimiento:
Se necesitan dos matraces de 1000 ml. Cada uno. Partir 200 g de papa sin cscara vaciar a uno de
los matraces y cubrir los trozos con agua destilada, hervir durante 15 min., concluido este tiempo se
cuela la infusin o caldo de papa, a travs de manta de cielo. Esta solucin se pasa a una probeta de
1000 ml y se vacan los 15 g de dextrosa, mezclar y aforar a 1000 ml, vaciar a cada matraz 500 ml
de la mezcla y aadir en cada matraz 10 g de agar. Esterilizar por 20 min. A 15 lbs de presin.

Proceder al vaciado de cajas en condiciones estriles, si se quiere acidificar el medio agregar a
punto de vaciado 1ml de cido lctico por matraz, agregar antibiticos, aadir 500 mg por matraz
(el antibitico que pueda conseguir para inhibir el crecimiento de bacterias).
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Mtodo de Tincion de Embriones.

Procedimiento:
Para hongos que se encuentran en embriones.
Tincion de embriones con colorantes (Azul de Metilo, Rojo de Rodamina).
Las semillas se someten a Hidrxido de Sodio (NaOH) por 24 hrs.
Se lavan las semillas en agua durante una hora para romper el pericarpio.
Se someten las semillas rotas a la presencia de los colorantes por 24 hrs.
Se observan embriones bajo microoscopio para identificar esporas e hifas.
Bueno para carbones.


Sntomas en plntulas.

Procedimiento:
Siembra de semillas hasta la obtencin de plntulas en medios de cultivo tierra estril.
Incubacin hasta la obtencin de plntulas con sntomas.
Identificacin de patgenos.

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VIRUS
18
19
PROTOCOLO DAS-ELISA

IMPORTANTE: El protocolo que se indica a continuacin NO ES el recomendada
por Agdia. Se trata de una modificacin para este taller.

CARGA DE MUESTRAS
Extraa las muestras utilizando una relacin 1:10; peso (gramos) de semilla, y volumen
(mL) de tampn de extraccin.
Agregue 100ul a cada pocillo. Dos pocillos para cada muestra, dos para lo control
negativo, dos para lo control positive y dos para el tampn.
Incube 40 minutos en un agitador automtico calibrado a 200 rpm a temperatura
ambiente.

CONJUGADO ANTICUERPOS
Diluya el conjugado de anticuerpos con el tampn recomendado como se recomienda
en la etiqueta.
Vace todo el contenido de los pocillos en un fregadero o recipiente apropiado. Llene
todos los pocillos completamente con tampn de lavado y vuelva a vaciarlos. Repita
este paso de lavado por ocho veces. Despus del ltimo lavado, invierta el plato y
golpelo contra una toalla de papel para remover la mayor cantidad posible del tampn
de lavado y las burbujas de aire.
Agregue 100ul a cada pocillo
Incube 30 minutos en un agitador automtico calibrado a 200 rpm a temperatura
ambiente.

SUSTRATO
Diluya 2 comprimidos pNPP en 10 ml de tampn de substrato.
Vace todo el contenido de los pocillos en un fregadero o recipiente apropiado.
Llene todos los pocillos completamente con tampn de lavado cmo se describe
anteriormente.
Agregue 100ul a cada pocillo.
Incube 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz directa.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Identifique visualmente los pocillos que se desarroll el color amarillo indicativo de los
resultados positivos. Compare la intensidad del color Amarillo de cada muestra con el
control negativo y los pocillos de tampn.
20
ImmunoStrips ImmunoStrip
Kit
_______________________________________________________________________
__________________

Contenido STX/005 STX/0025 STX/0250 STX/0024 ISK/005
ISK/0025 ISK/0250 ISK/0024


ImmunoStrip 5 tiras 25 tiras 250 tiras 24 peines 5
tiras 25 tiras 250 tiras 24 peines
Bolsa de muestreo con
solucin de extraccin * --------------------- NO INCLUIDO ----------------------
5 bolsas 25 bolsas 250 bolsas 25 bolsas

Instrucciones 1 1 1 1 1
1 1 1


* Las pruebas de ImmunoStrip requieren de la solucin amortiguadora.


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Toma de muestras:
Las muestras deben ser tomadas del tejido vegetal que muestre
los sntomas de infeccin por virus, luego proceda a triturarlo en la
solucin de extraccin.(Figura 1).
Las bolsas de extraccin de Agdia hacen muy fcil el triturar la
muestra. Cada bolsa contiene 3 ml de la solucin amortiguadora de
extraccin de muestras. Recomendamos hacer una dilucin 1:20,
la cual requiere de cerca 0.15 g de muestra (3 a 5 cm
2
o 1 inch
2
).
Sugerimos el uso de bolsas de muestreo tramadas de Agdia,
aunque otros medios de extraer muestras son aceptables

NOTA: La prueba ImmunoStrip no se desarrolla adecuadamente
si demasiado tejido vegetal est presente en el extracto.


Cortar la parte superior de la bolsa que contiene la
solucin de extraccin teniendo el cuidado de no
derramar la solucin de extraccin.


Colocar la muestra entre el entramado de la bolsa de
muestreo.


Con ayuda de un objeto de punta roma o un lapicero
triturar la muestra procurando mezclarlo con la solucin
de extraccin contenida en la bolsa. Utilizar solamente
una muestra por bolsa y estar seguro de etiquetarlo para
su identificacin. Realizar la prueba inmediatamente
despus de triturala. Si el extracto se deja por varios
minutos, vuelva a triturar la muestra o agitar la bolsa
para mezclar bien la muestra con la solucin de
extraccin antes de insertar el ImmunoStrip.




Retirar el ImmunoStrip del envase. Al manipular el
ImmunoStrip, tmela siempre la parte superior marcada
con el nombre de la prueba. No retirar el revestimiento
protector

Insertar el extremo inferior del ImmunoStrip, marcado
como sample, en la bolsa segn muestra la ilustracin
(5). Deje que el ImmunoStrip permanezca en el extracto
por un mximo de 30 minutos.

NOTA: No permita que el extremo del ImmunoStrip
se sumerga ms de 0.5 cm de pulgada en
el extracto de la muestra. El extremo del
ImmunoStrip debe permanecer en el extracto
durante todo el perodo de la prueba

PREPARACION DE LAS
MUESTRAS

1
INSTRUCCIONES PARA SU USO
2
3
4
5
4
5
2
3
1
22
RESULTADOS

La lnea de control asegura que la prueba est
trabajando correctamente. Si no aparece la lnea de
control, la prueba es invlida.

Si la muestra es positiva (+), la lnea de la prueba
aparecer. La lnea de la prueba ser de color rojo
a prpura as como la lnea de control. La
intensidad del color de la lnea de la prueba variar.
Un resultado positivo puede aparecer e
interpretarse en menos de 30 minutos.

Si la muestra es negativa (-), la lnea de la prueba
no aparecer. Las muestras con un ttulo bajo del
virus no se pueden detectar con el ImmunoStrip.
Deje que el ImmunoStrip permanezca en el extracto
por unos 30 minutos antes de declarar negativa la
muestra.

Utilizar las imgenes a la derecha como gua de
determinar resultados. En caso de necesidad,
alinear el ImmunoStrip con las imgenes para
determinar las posiciones exactas de la lnea de la
prueba y de la lnea de control.

Guardar y confirmar los resultados de la prueba

Si usted desea guardar una tira procesada de
manera permanente coloque los ImmunoStrips
entre toallas de papel y djelas secar. Las tiras
pueden ser scaneadas o pegadas en hojas de
papel para conservar un archivo.

Para algunas pruebas ImmunoStrip confirmacin de los resultados positivos pueden es posible traves de prueba
adicional de PCR.




Lo que sigue es una descripcin de los factores que podran limitar o interferir en los resultados de la prueba.

Solucin Amortiguadora de Extraccin: ImmunoStrip para diferentes patgenos puede requerir diferentes
soluciones amortiguadoras de extraccin (SEB 1, SEB 4, etc.). No utilizar otra solucin para la extraccin de la
muestras.

Dilucin de la muestra: El funcionamiento de la tira es dependiente en la dilucin apropiada de la muestra. Lo mejor
es utilizar 0.15 g del tejido vegetal con 3 ml de Solucin Amortiguadora de Extraccin recomendada para la prueba. Las
tiras no absorbern correctamente el extracto de las muestras que contienen grandescantidades de tejido.

Sumergiendo la tira: Las tiras de prueba no se deben sumergir ms de 0.5 cm o pulgadas. Si la tira se sumerge
demasiado, ciertos componentes de la tira son liberados en la muestra en lugar de correr hacia arriba por la tira. En la
mayora de los casos la prueba puede fallar y no se formar ninguna lnea de control.

Expiracin: La prueba se debe utilizar en el plazo de un ao posterior a la fecha de la compra.

Almacenaje: Los resultados de la prueba pueden ser muy dbiles o la prueba puede fallar si las instrucciones del
almacenaje no se siguen correctamente. El paquete de ImmunoStrip debe permanecer sellado con el desecante
cuando no es usado para prevenir la degradacin de la humedad. La degradacin por la humedad afectar los
resultados de la prueba.

Resultados: Algunos tejidos vegetales pueden ocasionar la aparicin de una lnea verde en la lnea de la prueba. Esto
puede ser debido al tipo de tejido o por que las muestras contienen gran cantidad de tejido. Las muestras que producen
LIMITACIONES

Resultado Positivo
Resultado Invlido
Lnea Control
Lnea de prueba
Lnea Control

NO Lnea de
prueba
NO Lnea Control

Lnea de prueba
Pgina 2
Resultado Negativo
INSTRUCCIONES PARA LAS PRUEBAS DE IMMUNOSTRIP DE AGDIA

Pruebas en tiras reactivas para la deteccin de patgenos vegetales



este tipo de resultado deben ser diluidas y ser probadas nuevamente. Si la lnea verde persiste, comunquese con Agdia
para la ayuda adicional.

Extracto de muestra: Si el extracto se deja por varios minutos se comenzar a agregar y puede llegar a ser menos
homogneo. Esto podra dar lugar a resultados dbiles o negativos. Por lo tanto es mejor probar la muestra inmediatamente
despus de la extraccin o agitar la bolsa para mezclar bien la muestra con la solucin de extraccin antes de insertar el
ImmunoStrip.

Sensibilidad: El patgeno puede estar presente en concentraciones muy bajas o puede distribuirse irregularmente en la
planta. Es importante recoger muestras de tejido que muestren sntomas para mejorar la capacidad de deteccin del virus.


ASISTENCIA TECNICA
Para asistencia tcnica o preguntas con respecto al uso de este producto, por favor comunquese con Agdia, Inc. de Lunes
a Viernes al 1-800-622-4342, 1-574-264-2014 o por correo electrnico a info@agdia.com.

Page 4
23
FITO PLASMAS Y
LIBERIBACTER
24
Protocolo para la extraccin del ADN de vegetales

Elabor: Dr. Isidro Humberto Almeyda Len

1. Se trituraran 250 mg de tejido en 2 ml de solucin de extraccin 2-ME/CTAB
precalentada a 65 C (2 % p/v CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM
EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl, 1 % p/v polivinypyrrolidona 40,000), con -
mercaptoetanol a una concentracin final de 0.2 %.
2. Alrededor de 750 ml de la muestra macerada se transfiere a un tubo
eppendorf de 1.5 ml estril y se incuba durante 45 minutos a 65 C.
3. Despus del perodo de incubacin se le agrega un volumen (considerando
el volumen de la muestra recuperada) de sevag (cloroformo-alcohol
isoamlico 24:1) y se centrifuga a 10,000 rpm durante 10 min a temperatura
ambiente.
4. Se recupera la fase acuosa (parte superior) y se le agrega 1 volumen de
sevag y se centrifuga a 10,000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente.
5. Se recupera la fase acuosa (parte superior) y se le agrega 0.5 volumen de
acetato de amonio (7.5 M), dejndolo 10 min en hielo y se centrifuga por 10
min a 14,000 rpm a temperatura ambiente.
6. Para precipitar el ADN, al volumen recuperado se le agrega 0.6 volumen de
isopropanol y se deja precipitar de 30 min a toda la noche a temperatura
ambiente.
7. Se centrifuga a 10,000 rpm durante 20 minutos y elimina el sobrenadante,
el precipitado se lava dos veces con etanol al 70% fro (centrifugando a
10,000 rpm durante 15 min), el precipitado se seca a temperatura ambiente
y se resuspende en 100 l de agua mQ estril y se almacen a 4C hasta
su uso.

25
Protocolo para la deteccin de la bacteria C. Liberibacter spp. s por medio
de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Elabor: Dr. Isidro Humberto Almeyda Len

Se utilizan el par de iniciadores Lp16S-1F/Lp16S-1R : (5-
CTGATCATGGCTCAGAACGA-3/5- CGGCGAAAGAGCTTTACAAC-3).

La mezcla de reaccin de PCR se prepara en un volumen final de 25 l de la
manera siguiente:

Reactivo Volumen Concentracin final
Buffer para PCR 2.5 l 1X
MgCL
2
1.0 l 2 mM
dNTPs 2.0 l 200 M
Primer Lp16S-1F 2.0 l 0.5 M
Primer Lp 16S-1R 2.0 l 0.5 M
Enzima 0.3 l 1.5 Unidades
ADN 2.0 l 50.0 ng
Agua ultrapura estril 13.2 l

Volumen final 25.0 l


Programa del termociclador:

1 ciclo
94
o
C 2 min

35 ciclos
94
o
C 1 min
60
o
C 1min
72
o
C 1 min

1 ciclo
72
o
C 10 min


Las muestras se fraccionan en geles de agarosa al 1.5%, se tien con bromuro
de etidio (0.5 g por ml de buffer) y se visualizan bajo luz ultravioleta.
26
Protocolo para la deteccin de fitoplasmas por medio de la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa Secuencial (PCR-Secuencial)

Elabor: Dr. Isidro Humberto Almeyda Len

Se utilizan dos juegos de iniciadores en la PCR-Secuencial, en el primer ciclo
de amplificaciones se utilizaron el par de iniciadores P1/P7: (5-
AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3/5-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3) y
en el segundo ciclo de amplificaciones se utilizaron el par de iniciadores
R16mF2/R16mR1: (5-CATGCAAGTCGAACGGA-3/5-
CTTAACCCCAATCATCGA).

La mezcla de reaccin de PCR se prepara en un volumen final de 25 l de la
manera siguiente:

Reactivo Volumen Concentracin final
Buffer para PCR 2.5 l 1X
MgCL
2
1.0 l 2 mM
dNTPs 2.0 l 200 M
Primer P1 2.0 l 12.5 pMoles
Primer P7 2.0 l 12.5 pMoles
Enzima 0.3 l 1.5 Unidades
ADN 2.0 l 50.0 ng
Agua ultrapura estril 13.2 l
Volumen final 25.0 l


Programa del termociclador para el primer ciclo de amplificacin:

1 ciclo
94
o
C 3 min

35 ciclos
94
o
C 1 min
55
o
C 30 seg
72
o
C 1 min 30 seg

1 ciclo
72
o
C 10 min



27
Para el segundo ciclo de amplificaciones el producto de PCR se diluye en
proporcin de 2:30 y se toman 2 l como ADN molde.


Reactivo Volumen Concentracin final
Buffer para PCR 2.5 l 1X
MgCL
2
1.0 l 2 mM
dNTPs 2.0 l 200 M
Primer R16mF2 2.0 l 12.5 pMoles
Primer R16mR1 2.0 l 12.5 pMoles
Enzima 0.3 l 1.5 Unidades
cADN 2.0 l
Agua ultrapura estril 13.2 l

Volumen final 25.0 l


Programa del termociclador para el segundo ciclo de amplificacin:

1 ciclo
94
o
C 3 min

35 ciclos
94
o
C 1 min
50
o
C 30 seg
72
o
C 1 min 30 seg

1 ciclo
72
o
C 10 min

Las muestras se fraccionan en geles de agarosa al 1.5%, se tien con bromuro
de etidio (0.5 g por ml de buffer) y se visualizan bajo luz ultravioleta.
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