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Silvana Fernanda Olvera Villegas

Grupo: 1111


Tcnicas de hibridacin

La hibridacin es un mtodo para localizar mRNA o DNA mediante la hibridacin de la
secuencia de inters con una sonda de nucletidos de secuencia complementaria. Describe
la capacidad de las molculas monocatenarias de DNA o RNA de interaccionar (hibridarse)
con secuencias complementarias. Requiere aislamiento del DNA o RNA, que luego se mezcla
con una secuencia de nucletidos complementaria (llamada sonda de nucletidos). Con
mucha frecuencia los hbridos se detectan mediante el uso de una marca radiactiva
adherida a uno de los componentes del hbrido. Se usan a menudo en el diagnstico de
enfermedades, la identificacin de microorganismos patgenos, el estudio de perfiles de
expresin gnica, la localizacin de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridacin
in situ) o en la comparacin de especies hibridando su ADN.

El Southern Blot es una tcnica que permite la identificacin de secuencias especficas
de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin utilizando sondas
especficas.


El Northern Blot es una tcnica muy similar al Southern Blot que permite la identificacin de
secuencias especficas de RNA.

En la hibridacin in situ la unin de la sonda de nucletidos con la secuencia de DNA o RNA
de inters se produce dentro de las clulas o los tejidos, como las clulas de cultivo o
embriones enteros. Se basa en la capacidad que tienen las monocadenas de cidos
nucleicos que tienen secuencias de bases complementarias de unirse entre s. Se utilizan
varias sondas de nucletidos. Para la localizacin especfica del mRNA se utilizan sondas de
RNA complementarias. Estas sondas se marcan con istopos radiactivos, las sondas
radiactivas pueden detectarse y visualizarse mediante la radioautografa. La digoxigenina y
la biotina se detectan con mtodos inmunocitoqumicos y citoqumicos, respectivamente.
Si se espera que una muestra de tejido contenga una cantidad muy pequea de mRNA o
un transcrito viral, puede usarse la amplificacin de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) para el DNA o la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para el RNA. Los transcritos
amplificados que se obtienen durante estos procedimientos suelen detectarse mediante el
uso de sondas de nucletidos complementarias marcadas en tcnicas de hibridacin in situ
estndares.

Recientemente se combinaron colorantes fluorescentes con sondas de nucletidos, lo que
permiti la visualizacin de muchas sondas al mismo tiempo. Esta tcnica se llama FISH
(hibridacin in situ con fluorescencia), esta tiene un uso bastante conocido en clnica para
pruebas genticas. Se utiliza para analizar simultneamente cromosomas, expresin
gentica y distribucin de los productos genticos.

La tcnica de hibridacin in situ, en sus distintas formas, ha sido usada rutinariamente en
laboratorios por unos cuantos aos. Sin embargo, esta tcnica ha mantenido la reputacin
de ser una de las tcnicas moleculares biolgicas ms complicadas. Esto podra ser debido al
origen de la tcnica, que usualmente requiere una mezcla de habilidades biolgicas
moleculares y de habilidades histolgicas.



Microscopio confocal de barrido
Permite determinar la localizacin de molculas de inters en cortes de tejidos de seres vivos,
acoplados a fluoroforos, as como tambin la localizacin celular de protenas unidas a
molculas reporteras, como son las protenas fluorescentes tanto in vivo, in vitro y en muestras
fijadas.
Combina componentes de un microscopio ptico de campo claro con un sistema de barrido
para disecar pticamente una muestra. Permite visualizacin en tres dimensiones. Las lentes
del microscopio confocal (objetivo y fototubo) estn alineados para enfocar la luz
proveniente del punto focal de una lente en el punto focal de la otra. Tiene una apertura de
detector (orificio puntiforme) que est en conjuncin con el punto focal de la lente. La luz
fuera de foco tiene bloqueado el paso hacia el detector. Utiliza un sistema de iluminacin
lser fuertemente convergente y en consecuencia produce una luz de gran intensidad en
forma de un punto de barrido muy superficial. Se exploran muchos puntos individuales en un
mismo plano focal y un programa informtico reconstruye la imagen a partir de los datos
registrados durante la exploracin.

Es posible crear imgenes mltiples de distintas profundidades de la muestra. La imagen
tridimensional resultante tiene iguales caractersticas de nitidez.
La principal rea de aplicacin es la biologa con muestras fijadas.



Bibliografa

Darby, Ian A. In Situ Hybridization Protocols. Humana Press, Australia. 2nd edition, 2000.
Geneser, Finn. Histologa. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, tercera edicin,
2000.
Ross. Pawlina. Histologa. Texto y Atlas color con Biologa Celular y Molecular. Editorial
Mdica Panamerica. Argentina, 6ta edicin, 2012.
http://www.quimica.unam.mx/cont_espe2.php?id_rubrique=83&id_article=340&color=
992113&rub2=259 1/septiembre/2013
http://www.inb.unam.mx/unidades/microscopia/confocal.html 1/septiembre/2013