UNIDAD PROFESIONAL INTERDICIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGA

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL



Laboratorio de Biotecnologa
molecular

Reporte
Transformacion por Agrobacterium rhizogenes
Segundo parcial
Arcos Manjarrez Carlos David
Betancour Acosta Jazmin
Buzzo Garca Ilse
Mercado Figueroa Guillermo


4BM5
INTRODUCCIN
En la actualidad existen diferentes tipos de organismos que afectan la calidad y
tiempo de cosecha de diversos productos agrcolas como la remolacha, la caa de
azcar, el maz, etc. Entre ellos se encuentran insectos plaga que pueden atacar
los cultivos en cualquier etapa de su desarrollo.
En el estado de Guanajuato los cultivos destinados a la produccin de maz se ven
afectados, principalmente, por el complejo gallina ciega (Phyllophaga spp). La
especie P. ravida presenta la distribucin ms amplia en el estado. El ciclo de vida
de este insecto se desarrolla de tal manera, que la larva se mantiene viva a
expensas de los nutrientes del suelo, sobreviviendo un considerable periodo de
tiempo.
Para erradicar este problema se han utilizado distintos plaguicidas, que adems
de provocar cierta resistencia en los insectos, son dainos para la salud humana y
el medio ambiente. Debido a esto, a mediados del siglo XIX se comenz a
proponer el uso de microorganismos para el control de plagas.
De las bacterias, virus y hongos entomopatgenos, stos ltimos han adquirido
importancia, ya que su mecanismo de interaccin con su hospedero es muy
especfico al igual que su proceso infectivo, a este tipo de microorganismos se les
denomina biopesticidas.
En los ltimos 30 aos se han desarrollado diversas tcnicas de transformacin,
tales como transformacin mediada por polietilenglicol, electroporacin
(electropermeabilizacin), bombardeo de partculas y, ms recientemente,
transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens (Agrotransformacin).
sta ltima, permite la transformacin de clulas intactas como los
conidios,disminuyendo la manipulacin de las clulas y por tanto disminuyendo las
probabilidades de contaminacin.
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria gram-negativa fitopatgena que tiene la
capacidad de integrar establemente parte de su material gentico dentro del
genoma de su hospedero, habilidad que ha sido explotada para introducir DNA no
solo a plantas, sino tambin a otros organismos que no son hospederos naturales
de la bacteria. Durante el proceso de infeccin A. tumefaciens introduce en la
clula vegetal un fragmento de DNA contenido en el plsmido pTi (plsmido
inductor de tumor), denominado T-DNA (DNA de transferencia) el cual es
integrado dentro del genoma de la planta.
Los genes contenidos en el T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la
formacin de tumores y la sntesis de compuestos fenlicos que son
aprovechados por la bacteria. El T-DNA est localizado en el plsmido pTi, que
adems contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e
incorporacin del fragmento de DNA en el genoma de la planta. El T-DNA est
delimitado por secuencias repetitivas en su extremo izquierdo LB (left border) y en
su extremo derecho RB (right border). El descubrimiento de que el rango de
hospederos de A. tumefaciens se podra extender incluyendo hongos, provee una
herramienta alternativa de transformacin para especies en donde es complicado
dirigir experimentos gentico-moleculares.


MATERIALES Y MTODOS

Material BIOLGICO
Races de Zanahoria (Daucus carota)
sanas y frescas.

MATERIAL DE LABORATORIO
3 vasos de precipitado de 250 ml
2 pipetas de 1 ml
1 piseta
2 cajas Petri
Hojas de papel blanco o papel kraft
(estril)

Bistur, navajas de bistur y pinzas de
diseccin


EQUIPOS
Campana de flujo laminar
Autoclave
Potencimetro
Balanza analtica
REACTIVOS
Etanol al 70%
Solucin de hipoclorito de sodio:
blanqueador comercial (5.5 % de
cloro
libre) al 10 %.
HCl 1.0 N
NaOH 1.0 N

Cefotaxima (antibitico). 100 mg/ml

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Protocolo de desinfestacin



Enjuagar con agua de la
llave
Cortar zanahoria por la
mitad
Trasvasar a etanol al 70%
durante 30 segundos
Encender mechero, colocar
frasco con EtOH al 96%.
Flamear pinzas
Trasvasar zanahoria a cloro
10% con tween 20 (2 gotas)
durante 10 segundos
Realizar 3 lavados
Sacar zanahoria en zona
asptica
Colocar zanahoria en cada
sistema y poner plstico
adherente
Cortar zanahora y realizar
asadas sobre los surcos
Pasar las sustancias a la
cmara de crecimiento a 25`C
con 12 horas de luz y 12 h de
oscuridad
Protocolo para cocultivo




Lavar zanahoria con agua y jabn
Pelarla, trabajar con la parte
central y cortar explantes
Colocar 3 explantes en EtOH 70% por
30 segundos
Agregar cloro 10%, 2 gotas de
Tween, 10 minutos, 7 minutos
Realizar la infeccin del cocultivo en
matraz LB
Inocular 5 ml, 28 oC por 2 das
Realizar 3 lavados
Incubar a 25oC durante 1 mes
RESULTADOS Y DISCUSIN

En la Figura 1 se muestra los resultados de la transformacin de explanes de
zanahoria usando Agrobacterium rhizogenes en la que se nota de manera visual
una clara contaminacin no de hongos sino
de la misma Agrobacterium rhizogenes, para
poder afirmar esto necesitaramos hacer una
tincin gram. La contaminacin pudo ser
ocasionada por no usar la suficiente
concentracin de antibitico (cefotaxima) o
no aplicar el suficiente tiempo de lavado con
dicho antibitico.
De haber obtenido xito en la transformacin
hubiramos notado races vigorosas peludas
como se muestra en la figura 2. Un forma de
observar esta tranformacion antes de las
raices se utilizo la proteina GFP como
indicador , observando la presencia de estas
con un color verde fluorescente conta lus UV

El mecanismo mediante el cual A. rhizogenes transfiere su material gentico al
husped es similar al mecanismo de A. tumefaciens con la pequea diferencia en
los plsmidos que

usan; plsmido Ti (inductor de
tumores) y plsmido Ri (inductor de
races) respectivamente. El plsmido Ti
tiene un tamao aproximado de 200 Kb
que contienen los genes que producen
tumores en el husped; en el se
encuentra la regin del DNA de
transferencia o T-DNA este es el que
se inserta en la planta husped y
posteriormente se expresa. El T-DNA
por si mismo no codifica los productos
que necesita para su transferencia,
Fig.1 Explanes de zanahoria contaminados con A.
rhizogenes. Fuente propia
Fig 2. Races transformadas por A. rhizogenes. Fuente
uvm.edu/rhizogenes_transformation
estos son codificados en otra regin del plsmido llamada regin vir o de
virulencia. La regin vir contiene 6 operones, y los genes dentro de la misma
poseen un sistema de regulacin muy fino y slo se expresan en presencia de
compuestos excretados por clulas vegetales heridas. Los compuestos fenlicos
producidos por la clula vegetal herida como la acetosiringona, cido sinapnico o
cido cafeico atraen por quimiotaxis a la bacteria y luego inducen la expresin de
los genes Vir (figura 3).









Los genes del T-DNA se pueden cortar y ser substituidos por otros genes sin
daos a la transferencia formando as los plsmidos desarmados, los cuales no
inducen la aparicin de tumores pero s permiten la transferencia de otras
caractersticas deseables. Existen
dos tipos fundamentales de
vectores para transformacin
con A. tumefaciens; el primero de
ellos lo constituyen los llamados
vectores cointegrativos, en los que
la informacin gentica a introducir
a la planta se cointegra al
plsmido Ti, por lo que el DNA-T y
la regin vir se encuentran en un
mismo megaplsmido. El otro tipo
de vectores son los llamados bina-
rios, en los cuales los productos de
la regin vir actan en trans, ya
que el DNA-T se encuentra en un plsmido y la regin vir en otro.
Fig 3. Insercin del T-DNA a la clula husped. Fuente. Lehninger (2004)
Fig 4. Maquinaria de protenas VIr en la insercin del T-DNA a la clula
husped. Fuente. V Citovsky. Cellular Microbiology (2007)
En la figura 4 se muestra en resumen lo que sucede dentro de la celula de
Agrobacterium y las estructuras que generan la maquinaria productora de
protenas Vir y las hebras T que luego son transportados a la clula vegetal, se
introducen en el ncleo y se integran en el genoma. El proceso de transformacin
comienza con el reconocimiento de seales que produce la planta por el sistema
sensorial VirA / VirG seguido por la activacin de los genes Vir y la unin de la
bacteria a la clula husped. La hebra T se separa de la regin de T-DNA por
medio de VirD2/VirD1 y son exportados a una molcula de VirD2 que est unida
covalentemente y en trans con varias otras protenas Vir en el citoplasma de la
clula vegetal a travs de un sistema de secrecin de tipo IV VIrB/D4. Dentro de
la clula husped se forma el conjugado VirD2-hebra T y es empaquetado por
numerosas molculas de VirE2 para formar un complejo T que se integra en el
genoma.
La transformacin de plantas con Agrobacterium rhizogenes es de gran inters en
la biotecnologa ya que por ser considerada de manera natural disminuye los
costos y el trabajo, la formacin de races transgnicas mediante esta tcnica
permite la produccin de metabolitos de inters como vacunas, anticuerpos,
alcaloides etc. Que comparados con otros sistemas de produccin resulta ser
ms factible obtenerlos por esta tcnica.
En la regin T del plsmido Ti se encuentra los genes que codifican para dar
resistencia a la kanamicina (antibitico), esta resistencia nos permite seleccionar
las plantas transformadas si las cultivamos en un medio que contenga el
antibitico al que la bacteria da resistencia al infectar a la planta; si esta crece nos
indica una transformacin exitosa de lo contrario quiere decir que no hubo
transformacin.

CONCLUSION
Los resultados no fueron los esperados debido que no se observo el color verde
fluorescente al poner los explantes contra luz UV.
La contaminacion de los explantes fue debido a una mala tecnica de laboratorio
incluso debido a la falta de concentracion del antibiotico epmpleado incluyendo el
tiempo del lavado.
La tecnica de tranfomacion mediante Agrobacterium rhizogenes no es rapida, pero
si natural lo que disminuye costos. El lavar esta bacteria despues del tiempo para
la transformacion es fundamental para obtener los resultados esperados.

BIBLIOGRAFA:
http://www.academicos.ugto.mx/memoria/PDF/s202-13.PDF
Hall R.D (2000). Plant cell culture initiation. Molecular Biotechnology 16:
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suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50:151-8.
Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and
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