Guia Pract. Microbiologia 2014-2-FN Final

Manual de Prcticas de Microbiologa FMH-USMP FILIAL NORTE
Docentes: Jos Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutirrez, Carlos Abanto Daz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles
Saavedra, Max Siaden

UNIVERSIDAD DE SAN MARTN DE
PORRES

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

MICROBIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS

2014

MANUAL DE PRCTICAS
Microbiologa.
Universidad de San Martn de Porres.
Facultad de Medicina Humana.
Chiclayo Per.

Dr. Jos Huapaya Yaya,

2007. Primera Edicin.
Derechos Reservados.
Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorizacin escrita de los
autores.


PRACTICAS
TIPO DE ASIGNATURA

: Terico Prctico
UBICACIN

: 2
do
Ao
DURACIN

: Semestral
SEDE

: Facultad de Medicina Humana
Filial Norte
CRDITOS DE LA ASIGNATURA

: 05
CARCTER

: Obligatorio
CDIGO

:


INTRODUCCIN

El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos a un mejor
conocimiento y aplicacin de los procedimientos de identificacin y aislamiento de la variada flora
microbiana de importancia en medicina humana. La microbiologa es una disciplina que estudia la biologa
de los microorganismos capaces de producir enfermedad.

Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias (Leewenhoek - Siglo
XVII), luego el aislamiento y diagnstico de distintos microorganismos sobre todo en las dos ltimas
dcadas del Siglo pasado en que se inicia la denominada poca dorada de la bacteriologa esta ha
evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos as como situaciones
nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de informacin cientfica relacionada con la
microbiologa clnica y la infectologa.

Los avances tecnolgicos, con un aumento de la automatizacin, el desarrollo de la biologa
molecular, la qumica de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa clnica y los conocimientos de
la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisin continua de los textos de microbiologa.

Tenemos el convencimiento que sta orientacin acadmica proporcionar a los alumnos de la
Asignatura de Microbiologa los recursos para prever el inicio del padecimiento. As como la base para el
diagnstico teraputica e investigacin de las enfermedades infecciosas.

Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio de las
bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos y ejercicios
fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios, acorde con la actualizada tecnologa.

Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la aplicacin de
los conceptos bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes procesos infecciosos en humanos.

El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas ms
comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin experimental de los
conceptos aprendidos durante las clases tericas.

Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas, no es una compilacin amplia
del tema, sino ms bien un Manual que contiene los requerimientos bsicos, orientacin, adecuando los
recursos y procedimiento que contribuirn a cimentar la formacin integral del mdico humano.

Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los objetivos,
utilizando los elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso enseanza - aprendizaje.

Docentes: Jos Huapaya Yaya, Lizzie Becerra Gutirrez, Carlos Abanto Daz, Jhonny Gordillo Carbonel Juan Giles Saavedra,
Max Siaden

GENERALIDADES

El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil, debido al tamao que presentan,
siendo ste entre 1 y 6 micras. Para su observacin se requiere el empleo del microscopio de luz; sin embargo,
esto no proporciona el suficiente poder de resolucin que permita observar las diferentes estructuras de las
bacterias lo que hace necesario el uso del microscopio electrnico.

Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos. El ms simple de ello
consiste en la observacin en fresco, de esta manera se visualizan caractersticas someras que proporcionan
una idea del tamao, forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con el empleo
del microscopio de contraste de fase.

Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias lo constituye los mtodos
tintoriales, que facilitan el estudio de la forma, agrupamiento y la afinidad a diversos colorantes. Entre las
tcnicas de mayor utilidad destaca segn su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas.

Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras tcnicas como la de Ziehl-Neelsen,
la cual identifica a las bacterias cido - alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras
importantes que pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de coloracin especiales, como por ejempl o, para
observar cpsula, esporas flagelos etc.

Para el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares las mismas que sern descritas en el
capitulo correspondiente

Max Siaden
ROL DE PRCTICAS

SEMANA FECHA
TEMA

1
ra
14 agosto
Practica N 1 Bioseguridad Practica

2
da
21 agosto N2. Obtencin y manejo de muestras clnicas
3
ra

28 agosto

Practica N3. Preparacin, fijacin y coloraciones bacterianas (coloracin simple
y coloracin diferencial: Gram y Ziehl Neelsen )
4
ta
4 septiembre Practica N4. Medios de Cultivo, Mtodos de siembra y aislamiento bacteriano
5
ta
11 septiembre
Practica N5. Pruebas bioqumicas para bacterias grampositivas

6
ta
18 septiembre Practica N6.Actividad antimicrobiana in vitro: Antibiograma
7
ma
25 septiembre PRIMER EXAMEN PRACTICO
8
va

2 octubre

Practica N7. Pruebas bioqumicas para bacterias gramnegativas
9
na
9 octubre
REVISION 1 DE TRABAJOS DE INVESTIGACION

10
ma

16octubre

Prctica de Laboratorio N 8 Identificacin y aislamiento de
Mycobaterium.
Coloracin de Ziehl- Neelsen

11
va
23 octubre
Prctica de Laboratorio N9:
Cultivo de muestras clnicas: Urocultivo, Coprocultivo

12
va
30 octubre
Prctica de laboratorio N10: Diagnstico micolgico: hongos
ambientales.
Prctica de Laboratorio N11
Tcnicas de diagnstico micolgico: Diagnstico de micosis
superficiales y cutneas.
13
va
6 noviembre
Prctica de Laboratorio N 12:
Tcnicas de diagnstico micolgico: Diagnstico de micosis
subcutneas, sistmicas y oportunistas.
14
va
13 noviembre
Prctica de Laboratorio N 13:
Diagnstico virolgico
15
va
20 noviembre
SUSTENTACION Y PRESENTACION DE TRABAJOS DE
INVESTIGACION
16
va
27 noviembre EXAMEN FINAL

INSTRUCCIONES PARA LA PRESENTACIN DEL INFORME DE CADA PRCTICA

1. Leer detenidamente los fundamentos tericos de la prctica y complementarlo con la bibliografa
adicional de la practica a realizarse.
2. Presentar adecuadamente los resultados, toda observacin microscpica deber contener el aumento
respectivo, tipo de coloracin realizada, tipo de muestra y deber sealar la estructura que se observa. Cabe
resaltar que los resultados sern presentados en su gua respectiva al finalizar la sesin prctica al
profesor de mesa encargado.
3. En cada prctica a de realizarse un comentario y/o discusin adems de las conclusiones de cada
practica con la debida referencia bibliogrfica, Todo esto ser presentado y redactado a mano la
semana siguiente de realizada la prctica a su profesor de mesa.
4. Las evaluaciones o cuestionarios que se encuentran en cada prctica de la gua debern ser resueltas antes
de la ejecucin de la practica, ya que formarn parte de la evaluacin (durante le ejecucin de la prctica).
5. El alumno podr hacer llegar las sugerencias que contribuyan al mejoramiento de las prcticas.
Max Siaden

MATERIAL Y EQUIPO BSICO EN LAS PRCTICAS MICROBIOLGICAS

En el campo de la microbiologa mdica se requiere de conocimientos bsicos, indispensables para facilitar el
estudio de los diferentes microorganismos; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el
principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e identificacin de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus). Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente esterilizados para
asegurar que los ejercicios renen los requisitos exigidos para el trabajo microbiolgico. A continuacin se
describen algunos de ellos:

Placa de Petri
Recipiente de vidrio o plstico que, en general se usa para contener medio de cultivo y proporciona una
suficiente rea para el crecimiento bacteriano.

Asa y aguja para siembras
Muy usada en la prctica bacteriolgica; hecha de alambre de platino o de otro material se inserta en un
mango que facilita su manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeo anillo.

Portaobjetos
Laminilla de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.

Gradilla
Soporte para tubos de ensayo.

Pipetas
Son tubos cilndricos de diversos materiales, puede ser graduadas y sirven para medir volumen conocido de
lquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia de lquidos.

Pipetas Pasteur
Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a 30 cm. de longitud. Se las emplea para la toma de
pequeos inculos de siembra.

Pipeteadores automticas
Pipetas que absorben en forma automtica sin necesidad de uno aspirar, pequeos volmenes (1 L a 1000
L) de muestras.

Crioviales
Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperaturas (-4 C) usados para guardar
muestras en la congeladora. Ej. Suero, cepas virales.

Matraces y balones
Recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes,
reactivos, medios de cultivo, etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esfrica con
fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.

Medios de cultivo
Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos; en su composicin se incluyen un
nmero balanceado de nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo a su consistencia pueden
ser lquidos, semislidos y slidos. Se presentan en forma deshidratada.

Mechero de Bunsen
Mechero de gas en el que este se mezcla con aire antes de producir la flama. Se utiliza para esterilizar el
alambre de platino.

Estufa
Aparato de dimensiones diversas, donde incuban los cultivos, generalmente a 37 C.

Autoclave
Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin, provisto de un manmetro y una llave que regula la
presin y la temperatura a la que desea esterilizar.

Max Siaden

Microscopio
Instrumento ptico utilizado para la observacin de microorganismos que no son visibles a simple vista.

Centrifuga
Aparatos diseados para acelerar la separacin de partculas slidas suspendidas en lquidos.

Filtros esterilizantes
Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado lquido, los que por su naturaleza no pueden
ser sometidos a la accin del calor en sus diferentes modalidades

Jarra de anaerobiosis
Instrumento til para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que permite un cierre hermtico no dejando
ingresar oxigeno.

Contador de colonias
Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta las colonias de microorganismos.

Flujo laminar
Equipo que proporciona rea estril, para los trabajos microbiolgicos, en especial cultivo, evitando la
interferencia de los microorganismos de contaminacin ambiental.

Max Siaden
Max Siaden
Microscopio Estufa
Autoclave Horno para Esterilizar
Max Siaden
Centrifuga Cmara de flujo laminar
Contador de Colonias Jarra Gaspak

Max Siaden
PRACTICA N 1

BIOSEGURIDAD

OBJETIVOS
Reconocer Situaciones De Riesgo y prevenir Los Accidentes Laborales
Aplicar las Precauciones Estndar
Producir Cambios de Actitud
Establecer Normas de Bioseguridad

INTRODUCCIN
Por las caractersticas de nuestra labor (trabajo con enfermos y/o sustancias y materiales que
potencialmente pueden causar dao), los trabajadores de salud estamos en permanente exposicin a las
enfermedades y a daos accidentales a sido necesario buscar medidas de prevencin, tales medidas que
tienen como objetivo proteger la salud y la seguridad del personal, de los pacientes y de la comunidad; frente
a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos y mecnicos; las llamamos
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD.
FACTOR DE RIESGO: Objeto, sustancia, forma de energa o caracterstica de la organizacin del trabajo
hospitalario, que puede contribuir a provocar un accidente de trabajo, a gravar las consecuencias del mismo o
provocar, a largo plazo enfermedades ocupacionales.
RIESGO BIOLOGICO: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infeccin, alergia, o toxicidad por una
exposicin no controlada a agentes biolgicos.
PRINCIPIOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD:
UNIVERSALIDAD: Todos los pacientes, sus muestras clnicas y sus fluidos corporales independientemente
del diagnstico de ingreso o motivo por el cual haya entrado al hospital o clnica, debern ser considerados
como potencialmente infectantes y se debe tomar las precauciones necesarias para prevenir que ocurra
transmisin.
PRECAUCIONES ESTANDAR: Buscan la disminucin del riesgo de transmisin de microorganismos de
cualquier fuente hospitalaria. Incluyen: Barreras de Contencin, Desinfeccin y Esterilizacin, etc.
BARRERAS DE CONTENCION PRIMARIA: Proteccin del personal (incluye vestimenta e incluso vacunas) y
del medio ambiente inmediato contra la exposicin a agentes infecciosos y/o productos qumicos de riesgo.
BARRERAS DE CONTENCION SECUNDARIA: Es la proteccin del ambiente externo contra la exposicin
de material infeccioso.
DESINFECCION:
Es el proceso intermedio entre limpieza y esterilizacin, sobre objetos inanimados
Se efecta utilizando agentes qumicos
Depende de concentracin desinfectante, el agente y tiempo exposicin
ESTERILIZACION:
Proceso eliminar toda forma de vida microbiana.
Mtodos: Vapor saturado o presin (autoclave), Calor seco (horno), Incineracin, Agentes qumicos (lquido,
gas)

NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Nivel 1: Incluye la manipulacin de microorganismos no patgenos o no se conozca que causen enfermedad
o muerte a adultos sanos. Ejemplo: Bacilllus subtilis, Enterobacterias, BGNNF, S. aureus, etc.
Las Medidas son las practicas Microbiolgicas estndar y no requiere equipos de seguridad
Nivel 2: El riesgo individual es moderado y el riesgo poblacional bajo. Incluye Microorganismo de riesgo
moderado asociados con enfermedades humanas por lastimadura de piel, ingestin o exposicin de
membranas mucosas. Ejemplo: Salmonella, Hepatitis B Viral. L La as s Medidas Microbiolgicas son estndar y el
acceso es restringido, etc.
Nivel 3: El Riesgo individual es elevado pero el riesgo poblacional es bajo. Los Microorganismos que pueden
producir la muerte o aquellos de riesgo moderado que incluya la infeccin por aerosoles. Ejemplo: Virus
influenza, HIV, Brucella, Tuberculosis. Se aplicaran medidas de bioseguridad del Nivel 2, acceso
Controlado, descontaminacin de todo desecho, etc.
Nivel 4: Riesgo individual y poblacional elevado. Los Microorganismos altamente patgenos y mortales que
no se conoce bien su forma de trasmisin. Ejemplo: Virus Ebola, etc. Se aplicaran m medidas del nivel 3,
Cambio de ropa antes de entrar, Ducha a la salida, etc.

Max Siaden
A continuacin se presentan algunas normas de Bioseguridad que debern cumplirse durante le ejecucin de
las prcticas:

INSTRUCCIONES DE BIOSEGURIDAD PARA LOS ESTUDIANTES DURANTE EL DESARROLLO DE LAS
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA:

1. No ser permitido ingresar a la Sala de Prcticas sin el respectivo guardapolvo blanco, guantes, mascarilla y
lentes de proteccin como medida de precaucin, adems no se permitir dejar sobre las mesas de trabajo
prendas de vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio.

2. Esta prohibido correr, jugar, comer, beber y/o fumar, ni aplicarse cosmticos durante las clases prcticas, as
como llevarse el lpiz, dedos o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos.

3. Antes de cada trabajo, limpiar el rea con desinfectante y luego lavarse las manos. Hacer lo mismo al
finalizar la prctica.

4. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de trabajo. En caso que se rompa
algn material de vidrio con cultivo bacteriano, avisar de inmediato al Profesor para que disponga la
inmediata desinfeccin y la limpieza.

5. Uno de los instrumentos de trabajo, el asa o mango de Kolle, terminado el ejercicio programado deber ser
esterilizado mediante flameado, de acuerdo con las instrucciones dadas por el profesor.

6. Todo material de trabajo como son: lminas, laminillas o pipetas debern ser depositados en los bocales de
vidrio con solucin desinfectante, los que estarn a la vista en cada mesa. Si fuera material de desecho,
como restos de algodn, papel etc., depositarlos en los baldes de basura, nunca en la mesa de trabajo ni en
el suelo. Los tubos, placas de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados
para ser esterilizados.

7. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda que se presente
en el desarrollo de las prcticas.

8. En caso de accidentes como rasguos, cortaduras o quemaduras, reportar inmediatamente al profesor.

9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el cual le servir de gua que han
de revisar con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los ejercicios que
se van a presentar.

Max Siaden
PRACTICA N 2

OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS

OBJETIVOS
Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clnicas para su ptimo
procesamiento.
Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas.

INTRODUCCIN
En trminos de la efectividad del laboratorio de microbiologa, nada es ms importante que la apropiada
seleccin, coleccin y transporte de las muestras clnicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas
veces por falta de cuidado y mtodos defectuosos usados en la recoleccin y el manejo de las muestras.
Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestras requieren metodologa de coleccin muy
especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar
las muestras clnicas:
La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la contaminacin con
microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con la interpretacin del cultivo y
enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la enfermedad.
Seleccione el tipo anatmico correcto donde se obtendr el espcimen, y utilice la tcnica apropiada y los
instrumentos o elementos adecuados para su obtencin. Especialmente en el caso de investigar
microorganismos anaerbicos.
Nunca refrigere una muestra por anaerobios.
Coleccione un apropiado volumen de muestra.
Insuficiente material puede ser causa de resultados falso-negativos.
Identifique cada muestra con el nombre del paciente, nmero de identificacin personal, procedencia, tipo de
muestra, fecha de coleccin, diagnstico clnico, duracin de la enfermedad, prueba requerida. e iniciales del
funcionario que tom la muestra.
Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos a agentes antimicrobianos. Si se han
administrado informar de ello al laboratorio. A menudo un LCR no revela patgenos bacterianos en frotis ni
cultivo cuando se ha tomado un antibitico en las 24 horas anteriores.
Coloque la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte con el fin de asegurar la
sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y mantener las medidas de
bioseguridad apropiadas.
Ordene siempre un frotis por gram para los especimenes que proceden de cavidades aspticas, y anote su
inters en determinado microorganismo.

LAS MUESTRAS MS FRECUENTES EN LOS ESTUDIOS MICROBIOLGICOS SON:

ORINA
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis entre lo cuales tenemos a: examen
microscpico de orina, urocultivo, determinacin de algunos residuos de medicamentos (Doping) e
investigacin de microorganismos especiales como Leptospira. El xito de estos exmenes depender de la
tcnica con que se tome la muestra y muy especialmente del tiempo transcurrido entre la toma y el anlisis,
ya que el proceso de descomposicin que se sucede en la orina por accin de las bacterias all presentes,
modifica los parmetros de los componentes y muy especialmente altera la carga microbiana.

Procedimiento
Lvese las manos
Los pacientes mujeres deben de realizar previamente el lavado de los genitales externos, con agua y jabn y
de adelante hacia atrs, mientras que los hombres solo lo realizaran en caso de solicitarse cultivos.
Squese con un apsito estril
Las muestras deben colectarse en frascos de boca ancha y tapa de rosca, estriles, depositar
aproximadamente entre 30 - 40 mL de preferencia la primera muestra de la maana a travs del chorro
medio (orinar una buena cantidad en el water y luego en el envase) .
En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente
Tape el frasco con precaucin, evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
En caso de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En el caso de no ser posible refrigerarla no ms
de 4 horas.

Max Siaden
HECES
Las muestras de heces se solicita para examen bacteriolgico, virolgico, bioqumico y para la bsqueda de
parsitos
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas debe colectarse antes de la
administracin de cualquier antibitico.

Procedimiento
Muestra evacuada: La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco,
teniendo cuidado de no miccionar y que esta no se mezcle con orina.
Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril, el
cual se desenvuelve y se lubrica previamente a su uso, introducindolo en el
medio de transporte de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto,
unos 3 cm, mediante movimientos de rotacin.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el
medio de transporte (Cary Blair o Amies)
El frasco con la muestro o el tubo con el medio de transporte se puede
conservar a temperatura ambiente hasta sus procesamiento o envi al
laboratorio, no mas de 12 hrs.
No se debe refrigerar la muestra

HEMOCULTIVO
La sangre de los individuos sanos es estril. Una afluencia repentina de bacterias habitualmente es
eliminada del torrente circulatorio en un periodo de tiempo corto, de minutos a horas, excepto cuando existe
una infeccin masiva o est presente un foco intravascular infectado. Bsicamente cuando las bacterias se
multiplican a tasas que exceden la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlas se habla de
BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se utiliza para designar la presencia de hongos en sangre.
Siempre que exista una razn para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre o
hemocultivo

Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el
incumplimiento de este punto puede dar lugar a resultados falsamente
negativos pudiendo comprometer la vida del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la
extraccin dificultando la interpretacin de los resultados. Adems
algunos contaminantes actan como patgenos oportunistas, por lo que
debemos ser muy cuidadosos durante la extraccin.
La toma debe realizarse por venopuncin y para ello, debe hacerse:
Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles.
Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de puncin.
Aplicar durante 1 minuto povidona yodada, dejar secar.
Desinfectar los tapones de los frascos.
Efectuar la extraccin.
No airear los frascos.
Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres, salvo en
aquellas circunstancias en que se indica especficamente.
Cuando la extraccin se haga con adaptador, este debe esterilizarse o
ser de un solo uso.

Max Siaden
MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES:
Ms del 70% de procesos estn ocasionados por virus: Rinovirus, Coronavirus, Adenovirus(3,4,7,14,21),
virus Parainfluenza, virus de la Gripe, Virus Coxsackie A y otros Enterovirus, virus Epstein-Barr y virus
Herpes Simple tipo I.
Entre el 10-20% de las faringitis agudas en nios de 5-10 aos, estn ocasionadas por Streptococcus
pyogenes. Otras bacterias patgenas son: estreptococos grupos C o G, C.diphteriae, A. haemolyticum, N.
gonorrhoeae, H.influenzae (epiglotitis)

Procedimiento
Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un
depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados,
membranas o inflamacin. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe
posterior. No se requieren medidas especiales para su transporte y conservacin.
En la toma de muestras de la epiglotitis, debido al riesgo de complicaciones, se
hace por un especialista en las condiciones adecuadas. Es recomendable realizar
hemocultivos.

MUESTRAS NASALES
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente humedecida, unos 2 cm en la
nariz, y girando suavemente contra la mucosa de la superficie nasal.

CATETERES
El estudio bacteriolgico de los catteres, nos va a permitir en ocasiones conocer el agente causal de una
bacteriemia relacionada con el catter y por otra parte, prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para
valorar su importancia, podemos decir que de una u otra forma el 82% de las bacteriemias nosocomiales se
relacionan con la presencia de catteres.
Vas de infeccin: a) Piel y catter. En los catteres perifricos y de corta duracin.
b) Endoluminal. En las vas centrales tunelizadas.

Procedimiento
Una vez extrado el catter, cortar 3 o 4 cm de la porcin distal en condiciones aspticas. Depositar en
frascos estril sin conservante y transportar de inmediato. Si ello no fuera posible conservar a 4C.

LIQUIDOS ESTRILES
El fundamento es la bsqueda de los microorganismos patgenos u oportunistas que pueden estar
presentes en los lquidos o fluidos orgnicos. En este grupo incluimos lquidos producidos, ya sea de forma
espontnea o bien provocada a nivel de serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y
son presumiblemente estriles. Su buen manejo presenta un triple inters por:
La trascendencia de esta patologa por su elevada morbilidad y mortalidad.
Dificultad en diferenciar patgenos y oportunistas como consecuencia de cuidados teraputicos instaurados
o prtesis aplicadas previamente.
Posibilidad de contaminacin exgena, sea en la obtencin o en su manipulacin, siendo por ello muy
importante extremar las medidas de asepsia de recogida y procesamiento.

Muestras
Lquido asctico o peritoneal
Max Siaden
Lquido articular o sinovial
Lquido pericardio
Lquido pleural

Procedimiento
Tras la obtencin mediante puncin en condiciones aspticas por personal especializado y en cantidad
suficiente, se depositar el lquido obtenido en frasco estril, a ser posible con tapn de rosca y fondo cnico
y se remitir de forma inmediata al laboratorio.
Una alternativa es la inoculacin directa del lquido biolgico en frasco aerobio y anaerobio de hemocultivos.

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO
La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central que afecta a las leptomeninges y al
lquido cefalorraqudeo. Se trata de una urgencia mdica y requiere un diagnstico y tratamiento precoz. Su
morbimortalidad, en meningitis agudas bacterianas, se relaciona directamente con el retraso en el inicio de
la teraputica.
Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas aparecen en edades extremas de la vida, an
cuando globalmente el 75% de los casos ocurren en menores de 15 aos.

Muestra
La toma de muestra lo realiza el medico tratante o el patlogo clnico del laboratorio.
Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana siempre que las condiciones lo permitan.
LCR se obtiene por puncin lumbar
Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio bioqumico, el segundo para el
estudio microbiolgico con el mayor volumen posible. El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa.
Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meningitis suelen ir acompaadas de un
proceso bacterimico.
Volumen mnimo: Para el estudio bacteriolgico rutinario es suficiente al menos 1ml. aunque es preferible
disponer de volmenes superiores.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes etiolgicos, como S.
pneumoniae pueden lisarse rpidamente a partir de la primera hora de su recogida.
Si no fuera posible se mantendr en estufa a 35 - 37 C y una parte se incubar en frasco de hemocultivo,
que se mantendr en idnticas condiciones.
Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se refrigerar pues se afectar la
viabilidad de N. meningitis y H. influenzae.

Procesamiento del LCR.
Centrifugar a 1.500- 3.000 revoluciones durante 15- 20 minutos.
En caso de lquidos muy purulentos no ser necesario centrifugar.
Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estril y conservarlo a 4C en frigorfico.
Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en: Agar sangre: (35-37C) atmsfera de CO2 . Agar chocolate
(35-37C) atmsfera de CO2, Tioglicolato o B.H.I. ( 35-37C) (72 horas).
Se harn tres extensiones para tincin: Tincin de Gram, azul de metileno, col. Wright.

Max Siaden

MATERIALES
Guantes quirrgicos estriles
Hisopos estriles
Laminas porta objetos
Mechero de alcohol
Mechero de gas

METODOLOGA

HISOPADO FARNGEO
1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, enseara a
tomar una muestra de exudado faringeo. El paciente (en este
caso un alumno), se sentar cmodamente de frente al
profesor; el rea debe tener buena iluminacin para que permita
visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y mediante el bajalenguas se deprime la
misma para favorece que la faringe quede expuesta con una
hisopo estril se frotar firmemente la pared posterior de la
faringe y las amgdalas, particularmente en donde existan
puntos blancos o reas que presente signos de inflamacin, o
sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr
del fondo de las fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo se
deber tener la precaucin de no hacer contacto con ninguna
otras reas de la boca.
4. A partir de las muestras tomada se realizara el aislamiento por
el mtodo de estra en placa, se usaran placas de agar sangre,
agar chocolate y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo, elaborar 2 frotis, fijarlos al calor y
teir uno con la tcnica de Gram y el otro para observar
cpsulas.

Frotis de hisopado farngeo :

Coloracin simple : Azul de Metileno (Prctica 3)
Coloracin compuesta: Tincin Gram (Prctica 3)

Hisopo
Lmina
portaobjetos
Aislamiento en estra
Max Siaden
RESULTADOS:

Graficar lo realizado en prctica

DISCUSION:

CONCLUSIONES:

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Max Siaden

PRACTICA N3

PREPARACION, FIJACIN Y COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES Y
COMPUESTAS

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda las tcnicas de preparacin de frotis, fijacin y coloraciones ms utilizadas en el
estudio microbiolgico ya sea a partir de muestras directas o de cultivos bacterianos.
Identifique las diferentes formas bacterianas y de importancia clnica.
Conocer el fundamento de las respectivas coloraciones asi como la aplicabilidad de las mismas.

INTRODUCCIN

Debido al pequeo tamao de los de microorganismos se requiere de un microscopio ptico, ya sea de
campo claro (lo mas usado) o de campo oscuro para hacer la descripcin morfolgica de estos. La
observacin de los frotis teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin de los
microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tien los microorganismos.

Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los
mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y
del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
a. Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien.
Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
b. Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino
el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
c. Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn. Por otro lado las
tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos.

Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el protoplasma microbiano y
permiten localizar estructuras especficas del microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamao,
agrupacin y afinidad a ciertos colorantes. Las bacterias pueden presentar las siguientes formas: esfricas
(cocos), estos a su vez pueden disponerse en cadenas (estreptococos), en pares (diplococos), o en racimos
(estafilococos), sarcinas, en formas alargadas cilindricas (bacilos) y espiralas (espiroquetas y espirilos)

De acuerdo al numero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes
tipos de tinciones como son:
Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin
qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un
colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica,
y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los
microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones
de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen).
Estas tinciones utilizan ms de un colorante.
Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin
qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de
paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

MATERIALES

Muestra de secrecin faringea
Asa bacteriolgica.
Equipos de coloracin para tincin simple y Gram.
Mechero, portaobjetos y puentes para tincin.
Microscopio.

METODOLOGA
Preparar un frotis a partir de hisopado farngeo de la prctica anterior
Max Siaden

COLORACIN SIMPLE CON AZUL DE METILENO
Es un tipo coloracin simple, la cual solo permite observar ausencia o
presencia de microorganismos, y distinguir algunas formas bacterianas
(cocos, bacilos, espirilos).
Para este tipo de coloracin se usa el colorante azul de metilenos, el cual se
agrega sobre la extensin por 1 minuto, transcurrido este tiempo se enjuaga,
se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con el
lente de mayor aumento.

COLORACIN COMPUESTA: GRAM

Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en 2
grupos taxonmicos: Gram (+) y Gram (-). En esta tcnica se debe tener en
cuenta tres aspectos fundamentales: (a) las bacterias Gram positivas retienen
firmemente el colorante inicial; (b) al aadir el mordiente se forma un complejo
molecular de gran tamao; y (c) la penetracin esta condicionada por la
permeabilidad de la pared celular.

Al finalizar la coloracin las bacterias Gram positivas quedan teidas con el cristal
violeta (morado), mientras que las bacterias Gram negativas quedan teidas con
el colorante de contraste Safranina (rojo).

Tcnica de Coloracin Gram

Cubrir las preparaciones con cristal violeta durante un minuto; lavar ligeramente
con agua corriente.
Cubrir con lugol durante un minuto; lavar ligeramente con agua corriente.
Decolorar con la mezcla alcohol - acetona (escurrir 5 a 6 gotas); lavar con agua
corriente.
Cubrir con safranina durante 30 segundos; lavar con agua corriente y dejar secar.
Colocar sobre la coloracin una gota de aceite de inmersin.
Observar al microscopio con el lente de mayor aumento.
1. Cubrir con Azul de
metileno
2. Lavar con agua
OBSERVAR
Max Siaden

1. Cubrir con
cristal violeta
(1 minuto)

2. Lavar con
agua corriente
3. Cubrir con lugol
(1 minuto)
4. Lavar con
agua corriente

5. Decolorar con
alcohol acetona
(5 a 6 gotas)
6. Lavar con agua
corriente

7. Cubrir con
safranina
(30 segundos)
8. Lavar con
agua corriente

SECAR A T
AMBIENTE Y
OBSERVAR
Max Siaden
RESULTADOS

Graficar lo observado al microscopio

TINCION GRAM
TINCION SIMPLE
Max Siaden

DISCUSION:

CONCLUSIONES:


Max Siaden
PRACTICA N4

MEDIOS DE CULTIVO, MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

OBJETIVOS
Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico.
Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y funcin.
Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento bacteriano
Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo mixto.

INTRODUCCIN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las
condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de
los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparacin de un
medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de
inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se
esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave.

CONDICIONES GENERALES
Presentar todos los elementos necesarios y en sus proporciones y/o cantidades necesarias.
pH adecuado.
Condiciones osmticas adecuadas.
Estril y preservado de cualquier contaminacin.
Medio fresco (ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de componentes).

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Agua (Destilada o desionizada),
Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las
bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la
lactosa y la sacarosa.
Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor.
Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.
Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas
animales o vegetales.
Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son aadidos a los
medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos.
Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo
del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos.
Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio.
Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el
desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato.

CLASIFICACIN

Por su consistencia:
Medios de cultivos lquidos: caldo nutritivo, caldo selenito, caldo peptonado
Medios de cultivos semislidos: agar SIM, agar MIO
Medios de cultivos slidos: agar sangre, agar MacConkey, agar manitol salado

Por su funcin o fines especiales:
Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que bacterias poco exigentes desarrollen. Ej: caldo
y agar nutritivo
Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden ciertos productos a manera de
suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento. Ej: agar sangre, agar chocolate, etc.
Max Siaden
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin qumica favorecen o permiten la
multiplicacin de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de otros. Ej: caldo selenito, caldo
peptonado alcalino.
Medios selectivos: permiten el crecimiento solo de la especie que se desea aislar, para lo cual se les agrega
colorantes bacteriostticos (azul de metileno, verde de malaquita, verde brillante, etc.). Ej: agar Mac
Conckey, agar Salmonella-Shigella (SS), agar manitol salado.
Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permite detectar las
reacciones bioqumicas especficas de los microorganismos: Ej: agar triple azcar (TSI), agar urea, agar
citrato, etc.
Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al laboratorio:
caldo hafna, Cary Blair, Stuard, etc.

MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO:
En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porcin de una
poblacin de microorganismos, denominada inculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su
crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados
y siguiendo las instrucciones de los monitores de prcticas. La principal advertencia consiste en trabajar
siempre prximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de conveccin verticales que genera,
es capaz de crear un ambiente estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de clulas bacterianas (inoculo) sea
transferido (inoculado) a un medio de cultivo estril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una
muestra con mezcla de microorganismos deben emplearse tcnicas de aislamiento lo que permiten
obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilizacin de medios tanto simples como especiales, mayormente
slidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo.
Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas.

1. Por Siembra: es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de
cultivo, para que en condiciones optimas de temperatura y tiempo de incubacin pueda desarroll ar y
multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para obtener un cultivo puro de bacterias a partir de una
muestra problema (orina, heces, secreciones, aguas servidas, etc).
La siembra puede ser:
- Por inoculacin
- Por estras simples
- Por dispersin o agotamiento
- Por puntura

2. Por diluciones sucesivas: que consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inculo, es decir
esta se utiliza cuando se tienen muestras lquidas (orina, agua, etc) y como su nombre lo indica se realiza
haciendo diluciones a las muestras (1:100, 1:1000, 1:10000, etc). Posteriormente se siembra cada dilucin
en placas petri con medios de cultivo.

Una vez obtenidos los cultivos puros, pueden procederse al examen microscpico (tinciones especficas), al
examen macroscpico (morfologa de las colonias) y posteriormente al estudio de las actividades
bioqumicas o caractersticas inmunolgicas de los microorganismos aislados. Todos los procedimientos
mencionados permitirn lograr la identificacin precisa de las bacterias.

Max Siaden
MATERIALES
Caldo nutritivo: en matraz y tubos
Agar nutritivo: en matraz, placa y tubos
Agar Mac Conckey, Agar Salmonella Shgella (SS), Agar Manitol Salado, Agar Sangre, Agar Chocolate, TSI,
Citrato, Urea, SIm.
Asa de siembra en aro y en punta
Tubos de vidrio 16 x 150 mm
Tubos de caldo nutritivo con cultivo mixto bacteriano (Staphylococcus aureus y Escherichia coli)
Placas con agar nutritivo, agar sangre y agar manitol salado
Tubos con caldo y agar nutritivo
Suero fisiolgico estril
Mechero de Bunsen

METODOLOGA
Observar y diferencias los distintos medios de cultivo proporcionados en la practica

Max Siaden
Manejo del asa bacteriolgica
El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las precauciones que se deben tener en la
toma de la muestra, tales como: esterilizar el asa, dejara enfriar para evitar al quemar a las bacterias.
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido (ya que este sitio se encuentra una mayor concentracin de
microorganismos) y observar que el asa al retirarle del tubo est cubierta por una pelcula lquida.

Mtodo de siembra por agotamiento: aislamiento a partir de un cultivo mixto
1. Tomar un lpiz graso y marcar por detrs de la caja que contiene el agar, las lneas, como est indicado en
la figura 1, quedarn tres sectores, el sector nmero 1 es ms pequeo que los otros dos y servir para
descargar el asa.
2. Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio lquido (como se indic previamente). Cerrar el
tubo y colocar en una gradilla.
3. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y sembrar trazando una serie de
lneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector 1. (Esto mismo se puede hacer colocando la caja
de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano, hacer un movimiento rpido para levantar el fondo que
contiene el medio de cultivo, como indicar el profesor).
4. Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el sector
2 hacia arriba. Sin volver a tomar inoculo, trazar un zigzag un poco ms abierto en el sector 2, invadiendo el
sector 1 en las primeras lneas de zigzag, pero no en las ltimas.
5. Girar nuevamente la placa 90 grados, ahora el sector 2 estar a la izquierda y el sector 3 hacia la derecha.
6. Hacer un nuevo zigzag en el sector 3, invadiendo el sector 2. Este paso puede repetirse, sembrando un
cuarto sector.
7. Incubar las cajas a 37 C durante 24 horas. Las cajas ya sembradas debern colocarse con la tapa hacia
abajo y la parte que contiene el agar sembrado, hacia arriba.

Mtodo de siembra en Caldo de cultivo:
Coger el asa de siembra en aro, esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos.
Abrir una placa con medio de cultivo y cultivo bacterianos y coger una colonia bien aislada, con ayuda del
asa de siembra.
Luego destapar un tubo con Caldo de cultivo cogiendo la torunda con el dedo meique de la mano con que
se esta cogiendo el asa de siembra con la colonia.
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lpiz
El tapn del tubo se toma con el
dedo meique de la mano derecha
La boca del tubo se flamea despus de abrirlo
y antes de cerrarlo
Figura N 1 Figura N 2
1
2 3
1
2
3
Max Siaden
Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de
siembra.
Tapar el tubo con la torunda, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el Caldo.
Llevar a incubar a 37 C por 12 hrs.

Transcurrido el tiempo de incubacin, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo liquido,
slido
Medio lquido la turbidez indica desarrollo
Medio slido: presencia de colonias

Figura N1
Figura N2
Max Siaden

RESULTADOS:

Medios Simples :

Medios Enriquecidos :

Max Siaden

Medios Selectivos :

Medios Selectivos :

Max Siaden
RESULTADOS

Realizar la lectura, observar y graficar los resultados .

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol
Salado
Agar Nutritivo Agar Sangre Mac Conkey

Max Siaden
DISCUSION:

CONCLUSIONES:


Max Siaden
PRACTICA N 5

DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias gram positivas.
Aislar e identificar bioqumicamente las diferentes bacterias gram positivas de importancia clnica.

INTRODUCCIN

Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica con formas de cocos Ejm:
Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus, principalmente S.pneumoniae y cocos anaerobios
(Peptostreptococcus)

Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos: Ejm Bacillus anthracis, Clostridium,
Gardnerella, Listeria, Corynebacterium

Todas estas bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos
casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por
eso se hace necesario para su aislamiento e identificacin realizar tomas de muestras y procesamiento
bacteriolgico correctos.

Dentro de los gram positivos los cocos y en especial las especies de estreptococos y los estafilococos son
los ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemolsis, pruebas bioqumicas o
diferenciales especificas como prueba de catalasa para diferenciar estafilococos de estreptococos, la prueba
de coagulasa para diferenciar estafilococos patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para
distinguir Neumococos, etc.

MATERIALES
Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar sangre
Cultivo de Staphylococcus aureus en agar manitol salado y agar sangre
Tubos con plasma (1 mL) y pipetas graduadas de 1 mL estriles
Reactivo de perxido de hidrogeno
Kit de Coloracin Gram
Laminas portaobjetos
Asas bacteriolgicas, mecheros
Microscopios

METODOLOGA

Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus
1. Observar el tipo de hemolsis que se forma en las placas de agar sangre
2. Realiza la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar sangre (AS) y con una del manitol salado
(MS).
3. Para la prueba de coagulasa, en dos tubos con un mL de plasma cada uno, depositar en uno 0,5 mL del
cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un mL de S.epidermidis. Incubar 30 minutos a 37 C.
4. Prepara frotis de las colonias que han desarrollado en AS y en MS.

Max Siaden
Preparacin de Frotis :

METODOLOGA
La identificacin inicial de estreptococos, estafilococos, se basa en la morfologa colonial de los cultivos
primarios y el tipo de hemlisis en agar sangre. Sin embargo, para evitar errores de interpretacin, se
emplean pruebas bioqumica como:

Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se
encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos, excluyendo
los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de
burbujas: la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Esta prueba
se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero
Streptococcus (catalasa negativo).

1. Con el asa de siembra
tomar una colonia de la
placa de Petri
2. Extender la muestra sobre la
lmina portaobjetos
3. Fijar el extendido con la
llama del mechero
Max Siaden

Fermentacin del manitol
El agar manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de estafilococos patgenos en
cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los estafilococos de desarrollar en presencia de NaCl
al 7,5% y la de fermentar manitol; en este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el agar
circundante a las colonias.

Coagulacin del plasma
Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa, capaz de aglutinar el plasma tratado con
oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.
Este factor srico reacciona con la coagulasa, activando el fibringeno y produciendo un coagulo o trombo
de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la
actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos
(coagulasa nido), tambin llamado factor de agregacin la prueba en tubo se hace poniendo 1 mL de plasma
al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S.aureus. Se incuba la mezcla a 37 C durante 4
horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulacin.

Perxido de
hidrgeno
Figura N 1
Figura N 2
Figura N 3
(+) BURBUJEO : Staphylococcus
(-) NO BURBUJEO : Streptococcus
POSITIVO NEGATIVO
Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin
Con el asa de siembra se toma
una colonia del cultivo del
microorganismo y se coloca en la
lmina
Max Siaden

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS

Streptococcus

Hemlisis
Fermentacin
del manitol
Prueba de catalasa
POSITIVO NEGATIVO
(+) PRUEBA POSITIVA
Formacin de cogulo

(-) PRUEBA NEGATIVA
No hay formacin de cogulo
Staphylococcus epidermidis

Max Siaden


Staphylococcus epidermidis

Fermentacin
del manitol

Prueba de
catalasa

Prueba de
coagulasa

Fermentacin
del manitol

Prueba de
catalasa

Prueba de
coagulasa

Max Siaden

DISCUSION:

CONCLUSIONES:


Max Siaden
PRACTICA N 6

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO: ANTIBIOGRAMA

OBJETIVOS
Entender el fundamento del antibiograma, el modo que se realiza y las principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en
prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer
INTRODUCCIN
La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro para obtener la
informacin que permita decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva; no actan directamente sobre el husped, sino
que se combinan qumicamente con determinados sistemas de los microorganismos, enfocando as la accin
sobre los microorganismos ms que sobre el husped.
La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mnima necesaria del
quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clnico y detectar
mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo dilucin y el del
disco difusin en agar , a ste ltimo se le denomina antibiograma.

Accin de los Antibiticos
La actividad antimicrobiana in vitro determina: (a) la potencia de un agente antibacteriano en solucin; (b) su
concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos; y (c) la sensibilidad de un microorganismo dado a
concentraciones conocidas del medicamento.
Inhibicin de sntesis de pared celular: por ejm. Penicilina, Cefalosporina, Bacitracina, Vancomicina,
Novobiocina.
Alteracin de permeabilidad de membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina.
Inhibicin de sntesis proteica: Aminoglucsidos (Kanamicina, Amikacina, Estreptomicina), Tetraciclinas,
Cloranfenicol, Macrlidos (Eritromicina, Lincomicinas (Lincomicina, Clindamicina)
Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos: Acido Nalidixico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin,
Rifampicina.

Medicin de la actividad antimicrobiana
Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo standard y una
cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utiliza las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de
difusin.

Prueba de dilucin
En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos; se inoculan
despus con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias
antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba.

MTODO DE DIFUSIN

Preparacin del inoculo
La tcnica de antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se
proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo de medio lquido apropiado (caldo nutritivo, infusin cerebro-corazn)
o preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente mtodo: Tomar de una
colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo.
Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez n 0.5 de McFarland (0,5 ml de
cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 M). Esto equivale aproximadamente a una
densidad de 108 clulas/ml. Diluir si es necesario la suspensin o aadir ms inculo.

Impregnar una torunda con la suspensin del inculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar con ella
toda la superficie de la placa, mediante estras cruzadas en varias direcciones. Antes de 15 minutos deben
colocarse los discos de antibiticos. Con pinzas flameadas y fras (o con un aplicador automtico) se
disponen los discos sobre las placas, de forma que disten unos 15 mm del borde de la placa y unos 30 mm
Max Siaden
entre s. En una placa de 9 cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las
pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 37C .

Despus de la incubacin se mide el dimetro de la zona clara de inhibicin que rodea el disco antibitico.
La dificultad principal de ste mtodo est en las diferentes velocidades del crecimiento para los diversos
microorganismos.

El uso de un disco para cada antibitico estandarizado, permite el informe de S (sensible), I (intermedio) y R
(resistente).

Se ha sealado la existencia de factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro, entre ellos
estn:
- El pH del medio siendo que algunos antibiticos son ms activos a pH cido (ejemplo nitrofurantoina)
otros a pH alcalino (ejemplo, aminoglucsidos, sulfanomidas).
- Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a las penicilinas desde 40% para la
meticilina y 98% para la dicloxacilina.
- Estabilidad de los medicamentos, as a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos
pierden su actividad.
- Cuanto ms grande sea el inoculo bacteriano, mas baja ser la sensibilidad del microorganismo.
- Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad que tienen de presentarse las
mutantes resistente, igualmente los microorganismos que crecen rpido y activamente son ms
sensibles a la accin de los antibacterianos que aquellos que se encuentra en la fase de reposo.
Dilucin en tubo
Dan un resultado cuantitativo, destacando dentro de ello dos caractersticas o actividades importantes:
- CMI o concentracin mnima inhibitoria, que es la concentracin mnima de antimicrobiano que inhibe el
crecimiento de un microorganismo.
- CMB o concentracin mnima bactericida, que es la concentracin que mata a los microorganismos.
Normalmente, la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin ya que los mecanismos
inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo, siendo el trmino que ms se usa.
MATERIALES
Caldos de cultivo con la suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0.5 de McFarland placas de
petri con agar Mueller Hinton
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos
Pinzas estriles
METODOLOGA
Sumergir la torunda en caldo tripticasa soya con cepa bacteriana, escurrir en las paredes del tubo y extender
uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller Hinton
Colocar con ayuda de pinzas los discos impregnados con diferentes antibiticos sobre la superficie del agar
Los discos deben quedar a una distancia de 20 mm entre ellos
Incubar a 37 C durante 24 horas

Max Siaden
RESULTADOS

Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.
LECTURA de DISCOS DE SENSIBILIDAD
El dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placa de Petri.
El limite del rea de inhibicin esta dado por la inhibicin completa del desarrollo tal como se puede preciar a
simple vista.
Los milmetros de la lectura sern llevados a la tabla para traducir su interpretacin en los trminos
susceptible (S), intermedio (I) y resistente (R).

Escherichia coli

ANTIBIOTICOS
RESULTADOS GRAFICO
S I R


ANTIBIOTICOS
RESULTADOS GRAFICO
S I R

Max Siaden
DISCUSION:

CONCLUSIONES:


Max Siaden

LECTURA DE HALOS DE INHIBICIN DE LOS DISCOS DE SENSIBILIDAD
Quimioterpico Concentracin
del disco mcg
Halo de inhibicin de desarrollo
Sensible Intermedio Resistente
Ampicilina AM
Amikacina AK
Ac. nalidxico AN
Cefalotina CF
Cefoxitina CTX
Ceftriaxona CRO
Cloranfenicol C
Kanamicina K
Nitrofuranos FD
SulfatrimetoprimSXT
Ciprofloxacina CIP
10 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
30 ug
300 ug
231.2 ug
5 ug
+17 14-16 - 13
+17 - 15
+19 14-18 - 13
+18 15-17 - 14
+21 16-20 - 15
+21 14-20 - 13
+18 15-18 - 14
+18 14-17 - 13
+17 15-16 - 14
+16 11-15 - 10
+21 16-20 -15
Mtodo de difusin por discos
Halos de inhibicin
Jos Huapaya Yaya, Martha Flrez Flores
PRACTICA N 7

IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

OBJETIVOS
Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacterias gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con las diferentes especies de
bacterias gram negativas.

INTRODUCCIN

Las bacterias gram negativos pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los ms
abundantes tanto del hombre como de los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora
intestinal normal y otros estn asociados a infecciones entericas y a otros procesos infecciosos
(especialmente cuando estas bacterias invaden otros rganos o sistemas)

Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal, de un portador sano, o de la diseminacin
endgena de la bacteria en un sujeto susceptible, pudindose ver afectados casi cualquier rgano del
cuerpo.

Familia de Bacilos Entericos:

Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran
nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al patgeno, para que
posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los
epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin. Dentro de los bacilos gram negativos las
enterobacterias son responsables del 30 al 35% de todas las septicemias, ms del 70% de todas las
infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.

Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones entricas,
tenemos: Salmonella, Shigella y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infeccin
sistmica que son procesos infecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica.

Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otros.
Esta capacidad puede ser moderada (como en EMB y McConkey), alta (como en SS, desoxicolato y citrato)
o completamente especfica (sulfato de bismuto y verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde un principio
tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa
(como Salmonella y Shigella).

Medios diferenciales (pruebas bioqumicas)
Son aquellos en los que se ponen de manifiesto las propiedades metablicas de los microorganismos frente
a diferentes substratos. Existen medios que permiten observar una, dos o ms caractersticas metablicas
de la bacteria inoculada. Entre los ms utilizados estn:

TSI (Agar hierro triple azcar): Medio slido que contiene glucosa, sacarosa, lactosa, hierro y un indicador
de pH. Con este medio se puede conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos.
Tambin se detecta la produccin de H2S, as como de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra, por
lo que se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio.

LIA (Agar hierro lisina): Medio slido que contiene lisina, sales de fierro, glucosa y un indicador de pH. Con
este medio se determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la produccin de H2S y la
fermentacin de la glucosa. Se siembra igual que el TSI, por picadura y estra.

MIO (Movilidad indol ornitina): Es una medio semislido. Contiene ornitina, triptfano y glucosa. Las
reacciones que se pueden presentar en el son: movilidad de la bacteria, descarboxilacin de la ornitina,
produccin de indol a partir del triptfano y fermentacin de la glucosa. Se siembra por picadura con asa
recta.

CITRATO DE SIMMONS: Medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado
como nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estra.

Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas, como son:
rojo de metilo, Voges Proskawer, hidrlisis de la urea. Utilizacin del malonato, entre otras; todas ellas
ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. Sin embargo, en ocasiones a pesar de recurrir a
diversas pruebas metablicas, no se consigue la identificacin, siendo necesario recurrir a reacciones
inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.

BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias pigenas gram
negativas, estos pueden ser cocos o cocobacilos y las enfermedades que producen por lo general incluyen
la acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio.
Dichas enfermedades comprenden uretritis purulenta (gonococos), meningitis, neumona, bronquitis,
sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis, etc.

Las bacterias pigenas gram negativas patgenas en humanos son: Neisseria, Haemphilus, Bordetella,
Moraxella.

Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados adyacentes son
aplanados o ligeramente cncavos. Solo dos especies de este gnero son patgenas exclusivamente de
humanos: N. gonorroheae o gonococo, agente causal de una enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea
y la N. meningitidis e meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el
tracto respiratorio superior. Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca,
N.mucosa, etc.

El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de N.gonorroheae.
Para el diagnstico de la gonococia, el lugar de toma de la muestra depender de la edad, sexo y de las
caractersticas de la infeccin.

La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva.
Para los cultivos, el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan
medios selectivos como Thayer- Martn modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas
cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar adems en
una atmsfera que contenga de 3 a 5% de CO2.

El diagnostico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de LCR,
sangre, liquido sinovial, pleural o pericardio. Las ms utilizadas son las dos primeras

Con la coloracin Gram se observan como diplococos gram negativos, crecen en los medios de cultivo
enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO2 . Son oxidasa positivo y fermentan los
carbohidratos.

MATERIALES

Placas con EMB sembradas con cepas problema
Placas con medio de MacConkey, EMB y SS
Tubos con medio TSI, Citrato, LIA, UREA, MIO (sin sembrar y sembrado con cepa problema)
Asas bacteriolgicas
Reactivo de Kovacs
Laminas fijadas con frotis de Liquido cefalorraqudeo con coloracin gram.
Microscopio
Aceite de inmersin.
Placas de cultivo con agar chocolate.

METODOLOGA
Enterobacterias :
En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitirn observar las caractersticas del
cultivo y con ello su identificacin:
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa bacteriolgica previamente esterilizada una muestra
y sembrar por estras en los medios EMB y SS. Incubar a 37 C por 24 hrs.
Transcurrido el tiempo de incubacin, observar la morfologa de las colonias de las placas sembradas
(MacConkey, EMB y SS).
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato, LIA, y MIO esto se hace por puntura
en los medio y luego en estras en la parte de inclinacin, como los indicara el profesor en cada medio.
Llevar a incubar a 37 C por 18 a 24 hrs.
Hacer la lectura de pruebas bioqumicas. Interpretar y realizar la identificacin del microorganismo
proporcionado utilizando las tablas adjuntas.

Interpretacin bioqumica

TSI
Fermentacin de glucosa: en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a amarillo. Es una reaccin dbil.
Fermentacin de sacarosa: en todo el tubo el medio cambia a amarillo, principalmente en el fondo, donde
intensifica el calor debido a la reaccin de la glucosa.
Fermentacin de lactosa: en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentacin puede haber produccin de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas
en el medio.
Produccin de cido sulfhdrico (H2S): por degradacin enzimtica de aminocidos que contienen azufre,
originan un precipitado de color negro. La produccin de SH2 tiene lugar en ambiente cido, de ah que el
precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As, un
fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado
con el precipitado negro.

LIA
Descarboxilacin de la lisina: el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie.
Fermentacin de la glucosa: en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
Desaminacin de la lisina: vira a color rojizo en la superficie del medio. Es caracterstico en Proteus y
Providencia.
Produccin de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente).

CITRATO DE SIMMONS
Utilizacin del citrato como fuente de carbono: el medio vira a color azul.

UREA
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la
alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un
viraje del indicador de pH (rojo de fenol)..

MIO
Motilidad: La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen si son
mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se
puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil.
Indol: La aparicin, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y
el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de
reaccionar con el grupo aldehdo del reactivo originando un complejo de color rojo.
Produccin de H2S: precipitado de color negro (por el mecanismo citado anteriormente).

MENINGOCOCOS :
Observar las placas con medios para meningococos
Observar la morfologa de las bacterias en las laminas fijadas

RESULTADOS
Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.


DIFERENCIALES
SIN SEMBRAR
TSI LIA Citrato de
Simons
SIM UREA

Klebsiella sp.

Diferenciales TSI LIA Citrato de
Simons
SIM UREA
Reacciones se
observan

Lectura

Proteus sp.

Simons
SIM UREA
Reacciones se
observan

Lectura

Diferenciales TSI LIA Citrato de SIM UREA
Simons
Reacciones se
observan

Lectura

Salmonella sp.

Simons
SIM UREA
Reacciones se
observan

Lectura

Shigella sp


Escherichia coli

Simons
SIM UREA
Reacciones se
observan

Lectura

DISCUSION:

CONCLUSIONES:



ANEXO:


PSEUDOMONA

Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la
tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos
encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como
comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con
excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribucin ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos
orgnicos como fuentes de carbono y nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos
El gnero Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri,
Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa,
Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la produccin
de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo
luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Slo una especie,
Pseudomonaaeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de
agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las
colonias tienen un aspecto de piel de caimn y con brillo metlico.
La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es
caracterstico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibitico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza,
tambin puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de
adquirir fosfatos inorgnicos. Se
puede realizar una identificacin rpida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las
siguientes caractersticas : morfologa tpica de las colonias, produccin de pigmentos
difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.

CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:

PRUEBA Pseudomonaaeruginosa Pseudomonafluorescens Pseudomonaputida
PIOVERDINA + + +
PIOCIANINA + - -


PRACTICA N 8

IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM
Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS:

1.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS ANAEROBIAS:

OBJETIVOS
Conocer las condiciones y exigencias para el cultivo de bacterias anaerobias.

INTRODUCCIN
Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar el oxgeno como aceptor terminal
de electrones. Tales organismos se llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los
anaerobios aerotolerantes, que pueden tolerar el oxgeno y crecer en su presencia, an cuando no pueden
utilizarlo, y los anaerobios estrictos (u obligados) que mueren en presencia del oxgeno.
La razn por la que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxgeno, es probablemente por que son
incapaces de eliminar algn producto txico derivado del metabolismo del oxgeno. Cuando se reduce el
oxgeno, se producen algunos elementos txicos tales como el perxido de hidrgeno (H2O2), superxido
(O2-) y radicales hidroxilo (OH-). Muchos anaerobios estrictos son ricos en enzimas flavnicas, que
reaccionan espontneamente con el oxgeno para dar estos productos txicos. Por el contrario, los aerobios
poseen enzimas que descomponen los productos txicos; tales enzimas no estn presentes en los
anaerobios.
Como ocurre con los aerobios, algunos de ellos pudieron tolerar la presencia de O2 y de substancias
oxidantes, pero en la mayora de los casos, el O2 se comporta como un gas txico que provocaba la
oxidacin de ciertos radicales libres altamente agresivos imposibles de neutralizar. Fusobacterium,
Prevotella y Porphyromonas no sobreviven ms de 10 a 30 minutos de exposicin al aire. Actinomyces,
Propionibacterium, Bacteroides y algunos Clostridium, son relativamente aerotolerantes.
RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLNICAS :
Las muestras clnicas deben ser obtenidas del sitio infectado usando procedimientos que garanticen el
mantenimiento de una atmsfera carente de oxgeno y eviten contaminacin con flora endgena. En general
el procedimiento recomendado es aspiracin con aguja del material purulento o por biopsia despus de
desinfeccin apropiada.
Estas muestras deben ser procesadas en el laboratorio lo ms rpido posible, manteniendo en todo
momento su estado libre de oxgeno. La obtencin de muestras son aceptables solo en casos de incluir un
medio de transporte apropiado para anaerobios y sean sembradas antes de 30 minutos de obtenida la
muestra. Las muestras para cultivos anaerbicos nunca deben ser refrigeradas.
La aspiracin directa con aguja es el mejor mtodo de obtener una muestra representativa para cultivo. Los
especimenes obtenidos de los lquidos normalmente estriles tales como sangre, lquido cefalorraqudeo o
peritoneal, se recogen despus de la descontaminacin cuidadosa de la piel.
Los dispositivos del transporte contienen generalmente ambiente libre de oxgeno proporcionados por una
mezcla del bixido de carbono, hidrgeno, nitrgeno, ms un indicador aerobio de la condicin. Los
especimenes se deben poner en un transportador anaerobio cuanto antes. Los especimenes se inoculan en
un frasco anaerobio del transporte o una jeringuilla con aguja. Despus de que se expelan todas las
burbujas de aire, el extremo de la aguja se debe insertar en un tapn de caucho estril, ya que el aire puede
difundirse gradualmente a travs de la pared plstica de la jeringuilla.
A pesar de que las bacterias aerobias y anaerobias son indistinguibles por la tincin, el frotis directo
proporciona informacin preliminar importante con respecto a tipos de organismos presentes, sugiere
terapia inicial apropiada y sirve como control de calidad. Estos anaerobios pueden mostrar un patrn
morfolgico tpico que puede ser reconocido por un microscopista experimentado. Se recomienda
especialmente el frotis directo por Gram de la muestra para ayudar a evaluar el cultivo posterior.


Examen directo de los materiales clnicos:
El anlisis macroscpico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos
orientadores sern el hallazgo de un olor ftido, el aspecto purulento de muestras lquidas as como el
hallazgo de tejido necrtico y gas. En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la
fijacin con metanol que el calor; se deben observar caractersticas celulares y el fondo del frotis y en la
tincin de Gram , observar la forma, tamao, disposicin de las bacterias y registrar el nmero de
microorganismos presentes . Observar caractersticas morfolgicas distintivas como : presencia de esporas,
ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas granulares. La tincin de Gram permite
determinar caractersticas celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar informacin
adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las ms tiles para detectar bacterias en hemocultivos,
lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido articular y exudados.

Procesamiento de las muestras
Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo comn con incubacin en
jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cmara anaerobia.
Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una atmsfera anaerobia es la jarra
para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plstica transparente ( disponible en el comercio) con una
tapa que se cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el
uso de un sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el
agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego
de 1 a 2 horas.
Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de varios tamaos, con capacidad
para una a tres placas de Petri de 100 mm de dimetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una
atmsfera cuando se le agrega agua, partculas de catalizador de paladio fro y resazurina como indicador.
La bolsa se sella con calor luego de la activacin del generador para permitir el mantenimiento de las
condiciones anaerobias.

Incubacin de los cultivos
En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el aislamiento primario de
bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y
colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4
das para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como
ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse
si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento
lento pueden morir debido a la exposicin de oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada de las placas
recin inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clnicas como
Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando
las placas recin inoculadas se mantienen en el aire ambiental.


MATERIALES

Laminas con frotis de bacterias anaerobias
Caldo tioglicolato con bacterias anaerbias

METODOLOGIA

Observacion macro y microscopica de las muestras anaerpbicas

RESULTADOS

DISCUSION:

CONCLUSIONES:


2. IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MICOBACTERIUM

OBJETIVOS
Conocer los riesgos y precauciones durante el procesamiento de muestra con micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestras para el estudio de micobacterias

INTRODUCCIN
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa producida por Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium bovis, que estn estrechamente relacionados por sus caractersticas bacteriolgicas y
similitud en su ADN, siendo la especie ms frecuentemente aislada M.tuberculosis. Las fuentes de infeccin
son a partir de los esputos secos del suelo y la leche contaminada y el mecanismo de transmisin se da a
travs de las vas respiratorias.

Las muestras necesarias para el aislamiento de M.tuberculosis son muy variadas, dependiendo de la
localizacin de la lesin: esputos, aspirados bronquiales, orinas, LCR, biopsias, contenido gstrico, heces
etc. Si no se puede procesar el mismo da ser necesario guardarlas a 4 C de temperatura (refrigeradora)
para impedir la proliferacin de la flora secundaria. Para manipular las muestras y sobretodo los pasajes a
otros medios de cultivos, es importante hacerlos en la cabina de seguridad.

Las micobacterias son microorganismos de forma bacilar que se caracterizan por contener un elevado
porcentaje de lpidos, por lo que para su coloracin se emplea la tincin de Ziehl -Neelsen (coloracin cido
resistente). En los medios de cultivos desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente
nutritivos.

El que no se pueda observar bacilos en una extensin no quiere decir necesariamente que no los haya,
pues se considera que debe haber unos 10 000 bacilos por mL de muestra para que la microscopa no
resulte positiva con una probabilidad del 50 por 100 bacilos por mL, aproximadamente. Es frecuente obtener
cultivos positivos a partir de muestras cuya baciloscopa fue negativa.

En los medios de cultivo desarrollan con lentitud y exigen que los medios sean altamente nutritivos. Dentro
de los medios de cultivo ms conocidos tenemos el de Lowenstein-Jensen. La temperatura ptima de
crecimiento es de 37 C. Se revisaran diariamente hasta un total de 60 das, pasados los cuales si no hay
crecimiento se consideran negativos.

LECTURA
Los bacilos aparecern como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teidos de rojo, aislados, en
parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.
Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observacin, leyendo de izquierda a derecha del extendido un
mnimo de 100 campos tiles, equivalentes a 5 minutos. Los campos en que no aparezcan dichos elementos
no deben contabilizarse en la lectura. Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa:

RESULTADO INTERPRETACIN

(-)
No se encuentran BAAR en 100 campos microscpicos
observado

(+)
Menos de un BAAR por campo en 100 campos
observados (de 10-99 BAAR)

(++)

Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados

(+++)

Mas de 10 BAAR por campo en 20 campos observados
BAAR: Bacilo cido alcohol resistente

Si en un frotis se encuentran de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos ms. Si
persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado y solicitar
nueva muestra.

TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN

Fundamento
Las bacterias cido - alcohol resistentes son aquellas que una vez teidas
no son decoloradas por el alcohol - cido. Esta propiedad est relacionada
con la existencia en la pared celular, de sustancias lipoides como la cera
D, que ante la accin disolvente del fenol contenido en la fucsina cida en
presencia de calor, permite la penetracin del colorante primario.
El enfriamiento de los compuestos mencionados impide que el colorante
sea eliminado por la accin del decolorante.

Material
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos.
Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Lowenstein-Jensen mostrando colonias de
micobacterias
Equipos de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen
Mecheros
Portaobjetos 26 x 76 mm
Microscopios
METODOLOGA

1. Realizar un extendido del esputo en una lamina portaobjeto limpia y sin ralladuras.
2. Dejar secar a temperatura ambiente antes de la tincin.
3. Cubrir con solucin de fucsina de Ziehl y calentar hasta la emisin de vapores durante 3 minutos, cuidando
que el colorante no hierva ni se seque.
4. Dejar enfriar, decolorar con la mezcla de alcohol- cido, hasta que no escurra colorante; lavar con agua
corriente.
5. Cubrir con azul de metileno durante 3 minutos; lavar con agua corriente y dejar secar.
6. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio con el lente de mayor aumento

Las bacterias cido - alcohol resistentes se tien de color rojo. Todos los elementos no cido - alcohol
resistentes se observan de color azul.

1. Cubrir con fucsina
bsica fenicada
2. Calentar suavemente con
ayuda del hisopo (5 minutos)

6. Cubrir con Azul de
metileno (1 minuto)
5. Enjuagar con
abundante agua

4. Cubrir con solucin
decolorante (3 minutos)
3. Enjuagar con
abundante agua
7. Enjuagar con
abundante agua
RESULTADOS

Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.

DISCUSION:

CONCLUSIONES:


PRACTICA N 9

CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS

OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.
Identificar los microorganismos mas frecuentes causantes de patologas clnicas
Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra de para el cultivo de muestras clnicas

CULTIVO DE ORINA (UROCULTIVO)

La infeccin del tracto urinario (ITU), se define como la presencia y multiplicacin de microorganismos en el
tracto urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en orina, indica respuesta
inflamatoria del Tracto urinario, la mayora de las veces debido a invasin tisular por bacterias. Por lo
general la piuria esta presente en las ITU, lo que se considera un criterio diagnstico de ITU.

La mayora de la ITU, son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias, siendo Escherichia
coli y Klebsiella sp., los ms frecuentemente aislados, en infecciones no complicadas. Tambin puede ser
causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp., Enterobacter sp. y Pseudomonas aeruginosa
sobre todo en pacientes sometidos a instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas
anatmicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.

Entre las bacterias Gram positivos pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la
mayora de las ITU, se recupera un nico microorganismo en la orina. La presencia de ms de una especie
bacteriana puede deberse a contaminacin de la muestra o en pacientes con infecciones complicadas como
por ejemplo litiasis, abscesos renales o sondaje prolongado.

El diagnstico definitivo de las ITU se hace mediante el cultivo de la orina (urocultivo). Hay que tener en
cuenta que por cuidadosa que sea la tcnica de toma de la muestra (salvo puncin suprapbica), es difcil
excluir la contaminacin de la orina con bacterias del tramo distal de la uretra lo que puede ser causa de
interpretaciones erradas.

La orina de miccin media es la ms recomendada para el urocultivo. En mujeres es necesario el lavado de
los genitales externos. En el hombre tambin retraer la piel del prepucio. La primera parte de la miccin,
casi siempre est contaminada con flora bacteriana uretral, esa es la razn por la que debe descartarse. La
miccin media se debe recoger en un envase estril. Es recomendable obtener la primera orina de la
maana, donde se encuentra mayor nmero de bacterias.

El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes por mL de
orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias por mL (UFC). La muestra de orina debe
enviarse al laboratorio en el plazo ms corto posible, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para
muchas bacterias y la multiplicacin de los grmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo
alterar los resultados.

Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo, se haga un examen microscpico
cuantitativo para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico.

MATERIALES
Frasco estril x 100 mL
Asas de platino (calibrada 0,01 mL)
Pipetas graduadas x 1 mL estriles
Placas con Agar McConkey, EMB.
Laminas, laminillas.
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Centrifuga y microscopio

METODOLOGA
Evitar que se contamine la muestra utilizando equipos estriles (frascos, pipetas, placas Petri, tubos de
prueba estriles).

1. Examen Directo:
Centrifugar aproximadamente 10 mL de orina por 3 min a 3000 r.p.m y luego decantar el sobrenadante y
sedimento observar al microscopio a lente de 40x.
2. Cultivo
Con el asa de platino calibrada (0,01 mL), previa agitacin de la muestra, tomar una asada de orina y
sembrar por estra en agar McConkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes, empezando las estras
por el primero y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el II, III y IV cuadrantes.
Rotular la placa con nombre y grupo e incubar 24 horas a 37 C

RESULTADOS

Hacer la lectura de las placas y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioqumicas para la
diferenciacin bioqumica.
Realizar el contaje de colonias para realizar el recuento total de UFC/ml.

UROCULTIVO
Orina:

Sedimento urinario:

AGAR SANGRE

Mac Conckey: Cultivo a las 24 hrs
Rec.Colonias:
Pruebas Bioqumicas

Lectura de las pruebas
bioqumicas

TSI CIT LIA SIM UREA


ANTIBIOGRAMA

CULTIVO DE HECES (COPROCULTIVO)

La diarrea puede definirse como el proceso que va acompaado de eliminacin frecuente de heces,
disminucin de su consistencia o ambas cosas. El diagnstico etiolgico de este padecimiento, se realiza
mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal. A este procedimiento se le
denomina coprocultivo y con l se logran, primero el aislamiento y posteriormente la identificacin de las
bacterias presentes en heces.

Las bacterias causantes de diarreas frecuentemente son: Salmonella, Shigella y Escherichia coli
enteropatgenas. En la actualidad se han descrito otras bacterias tambin asociadas con cuadros diarreicos,
como: Campylobacter sp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y Clostridium
difficile.

Para realizar con xito este mtodo se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad.,
antes de instituir el tratamiento, y que se deposite en una frasco limpio y estril, procurando no mezclarla
con la orina. Las muestras de heces se procesarn para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes a su
emisin. Si esto no es posible, es conveniente su conservacin en un medio de transporte adecuado
mantenindose en refrigerador hasta su siembra

MUESTRAS INACEPTABLES.
Muestras no conservadas de ms de 4-6 horas.
Muestras mltiples en el mismo da.
Muestra contaminadas con orina.

METODOLOGIA
1. Examen directo.
El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de polimorfonucleares, que sugiere
infeccin por un patgeno invasivo.
1.1. Examen en fresco y/o tincin con Azul de metileno de Loeffler.
1.2. Tincin de Gram: permite observar polimorfonucleares y flora predominante.

2. Inoculacin.
El coprocultivo se realiza a partir de las heces recin emitidas de preferencia.
Sembrar en los medios para diferenciar los bacilos entricos fermentadores de la lactosa (L+) de los no
fermentadores (L-), al tiempo que se inhibe el crecimiento de flora Gram positiva aerobia.
-- Agar MacConkey, Eosina Azul de Metileno.
Usar Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato), SS. (Salmonella Shigella) para inhibir el crecimiento de la
mayora de las Enterobacteriaceae mientras se permite el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp.
Utilizar el medio Selenito F (medio lquido) para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas
iniciales de incubacin. Se resiembran en medio slido a partir de las 6 horas. Este medio sirve asintomticos.
En el caso que se sospeche de Vibrio spp: Agua de Peptona alcalina (medio enriquecido) a partir de 6 horas,
subcultivar en TCBS (Tiosulfalfato Citrato Bilis Sacarosa) o de Campylobacter spp Medio Camp.

RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas realizar las pruebas bioqumicas
para diferenciar las especies de enterobacterias

COPROCULTIVO
Agar Salmonella Shigella (SS)

Sin Sembrar Cultivo a las 24 hrs
Pruebas Bioqumicas

TSI CIT LIA SIM

Lectura de las pruebas bioqumicas

CULTIVO DE SANGRE (HEMOCULTIVO y MIELOCULTIVO)

La deteccin de microorganismos viables en muestras de sangre tiene una gran importancia diagnstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del sistema
reticuloendotelial de remover stas del torrente sanguneo, se produce bacteremia o fungemia. Bacteremia
persistente o crnica ocurre cuando no se ha podido localizar el foco, o cuando no se ha podido drenar o
tratar adecuadamente el foco de la infeccin.

La entrada directa de bacterias al torrente sanguneo ocurre en infecciones intravasculares como:
endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas micticas, flebitis supurativas, catteres intravenosos
infectados, y catteres arteriales permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede
ocurrir una bacteremia para planificar los mtodos de diagnostico y la interpretacin de los resultados. Las
fuentes de bacteremia son: sistema genitourinario 25%; tracto respiratorio 20%; abscesos 10%; heridas
quirrgicas 5%; otros sitios conocidos 10%; y sitios desconocidos 25%

Siempre que exista una razn para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre
(perifrica o medular). Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnstico por este
procedimiento. El aislamiento de un microorganismo en los hemocultivos es transcendente porque
establece el diagnstico etiolgico de la bacteriemia y permite elegir el tratamiento ms eficaz.

Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis, neumona, pielonefritis: el hemocultivo en estos casos debe
considerarse un procedimiento de urgencia. Bacteriemias continuas de origen intravascular como
endocarditis, infecciones asociadas a catteres, de origen desconocido, con sospecha de fungemia e
inmunodeprimidos: se puede tomar en cualquier momento.

Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizarla cuando el paciente tiene escalofros o poco despus, o
durante el pico febril. Entre el 14 al 25 % de los enfermos hospitalizados tienen sospecha de bacteriemia y
en un 14% de los casos el hemocultivo establece el diagnstico lo que repercute en la curacin de los
pacientes considerablemente.

INDICACIONES:
Fiebre alta, aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro
general, shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenias no
relacionadas con procesos hematolgicos.
Siempre se deben realizar un mnimo de 2 hemocultivos
NUNCA DEBE REFRIGERARSE ANTES DE SU ENVO, PODR CONSERVARSE EN ESTUFA

CULTIVO DE SECRECIONES

EXUDADOS VAGINALES (EXOCERVICALES)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal, cuyo conocimiento y consideracin debe tenerse en
cuenta a la hora del estudio microbiolgico de infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones:
- Saber cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante.
- Bsqueda de agentes exgenos, transmitidos normalmente por va sexual.
- Deteccin de portadoras de determinados microorganismos.
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para el
aislamiento visualizacin del agente etiolgico son:
1. Vulvovaginitis: cuyos agentes etiolgicos ms frecuentes son Candida spp (principalmente C.albicans),
Trichomonas vaginalis y Virus herpes simple. Asimismo la presencia de un cultivo puro de otros
microorganismos observados en una tincin de Gram con leucocitos puede tener significacin.
2. Vaginosis: estado caracterizado, desde el punto de vista microbiolgico, por la ausencia o franca
disminucin de Lactobacillus spp y abundante flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios
(Mobiluncus, Bacteroides, Cocos anaerobios...) y Mycoplasma hominis.
3. Infeccin gonoccica: La endocervicitis gonoccica aunque cursa con leucorrea, el exudado vaginal no
es la muestra adecuada para su diagnstico siendo recomendable la obtencin de un exudado endocervical.

TIPOS DE ESTUDIOS MICROBIOLGICOS
Cultivo bacteriano.
Cultivo de levaduras.
Despistaje de Streptococcus agalactiae.
Cultivo de virus Herpes simple (puesto que requiere toma de muestra y medio de transporte y cultivos
especiales solo se har por peticin expresa del clnico y su protocolo de cultivo e identificacin se recoger
en otro captulo).
TOMA DE MUESTRAS
No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra. Si se utiliza espculo, lubricar con agua caliente.
Es recomendable tomar dos hisopados. Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra
de la zona de mayor exudado, y en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo
en medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando no pueda
procesarse en el momento se mantendr en frigorfico o a temperatura ambiente. Nunca refrigerar si existe
sospecha de infeccin gonoccica. Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte: 24h.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo.
1. Examen microscpico: es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la vaginosis
bacteriana. Se har una extensin del hisopo en portaobjetos y tincin de Gram.
2. Cultivo: Pueden establecerse distintas combinaciones de medios en funcin de la orientacin diagnstica:
- Agar sangre en atmsfera de CO2., agar Chocolate en atmsfera de CO2., Mc Conkey, Thayer Martin en
atmsfera de CO2.. medio para Gardnerella en atmsfera de CO2., Sabouraud con antibitico u otro medio
para Candida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis.
EXAMEN DE LA MUESTRA
1. Examen microscpico: En el exudado vaginal normal se observar flora regional con predominio de
morfotipo Lactobacillus sp y clulas epiteliales.
- La presencia de leucocitos.
- La presencia de levaduras o pseudohifas.
- La presencia nica o abundante de cualquier otro microorganismo.
- El exudado caracterstico de la VAGINOSIS BACTERIANA:
a) Presencia de Clulas clue (clulas epiteliales recubiertas de bacilos o cocobacilos Gram variables.)
b) Ausencia o escasos Leucocitos.
c) Flora mixta alterada (Ver Criterios de Nugent en tabla 1).

Tabla 1: Interpretacin de VAGINOSIS BACTERIANA mediante tincin de Gram

Lactobacillus Puntuacin CBGV
(1)
Puntuacin BGNC
(2)
Puntuacin INTERPRETACIN
4 (+) 0 4 (+) 4 3-4 (+) 2 Cuantificacin:
4 (+) = > 30 org/campo
(3)

3 (+) = 6-30 org/campo
2 (+) = 1-5 org/campo
1 (+) = < 1 org/campo
0 = ningn org/campo 3 (+) 1 3 (+) 3 1-2 (+) 1
2 (+) 2 2 (+) 2 0 0 Interpretacin Puntuacin
De 0 a 3: No vaginosis bacteriana
De 4 a 6: flora vaginal alterada
De 7 a 10: VAGINOSIS
BACTERIANA
1 (+) 3 1 (+) 1
0 4 0 0

(1): Cocobacilos Gram-variables (morfotipo Gardnerella/Bacteroides).
(2): Bacilos Gram negativos curvados (morfotipo Mobiluncus).
(3): Campo de mximo aumento (inmersin).

2. Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. .
Agar sangre (S.pyogenes), Agar Chocolate (Neisseria y Haemphillus), Thayer Martin (Neisseria) Medio
Gardnerella (Gardnerella vaginalis), Sabouraud (levaduras)

SECRECION URETRAL

La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de Transmisin Sexual (ETS) aunque
muestra un claro descenso en las ltimas dcadas en relacin con otras ETS., tanto en Espaa (ver tabla 1)
como en otros pases desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican en uretritis gonoccica y no
gonoccicas (UNG), siendo estas ltimas las ms frecuentes en pases desarrollados.

N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25% de todos los episodios de uretritis. Los
restantes estn causados por C. trachomatis, por Ureaplasma urealyticum y por un nmero variable de otros
potenciales patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la uretritis est menos aclarada . La
asociacin de ms de un patgeno como causa de la uretritis es ms que anecdtica y la ms frecuente de
ellas es la asociacin de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T.
vaginalis como nico agente encontrado hasta en un 4% de las uretritis no gonoccicas. Cuadros de
uretritis pueden estar causados por la presencia de condilomas intrauretrales.

La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 6 das tras la exposicin, en tanto que la UNG es variable,
desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonoccicas como no gonoccicas producen supuracin uretral,
disuria y picor

El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan dos de los siguientes supuestos:
1. Sntomas: historia de secrecin uretral y/o disuria.
2. Examen clnico: presencia de secrecin uretral purulenta, mucopurulenta o blanquecina
3. Demostracin (tincin de Gram) de > de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo de 1000 aumentos
en el examen directo de la secrecin uretral.
Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin uretral visible, deben ser examinados, pidindoles que
no orinen en las 4-8 horas previas a la toma de muestras. Se obtienen los 5-10 primeros ml de orina y tras
centrifugacin a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de > de 15 leucocitos
polimorfonucleares por campo confirma el diagnstico de uretritis.

Los sntomas de la uretritis gonoccica pueden permanecer hasta ms de 7 das, por ello la uretritis
postgonoccica se suele diagnosticar despus de transcurrido este periodo. En el examen con tincin de
Gram la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares, establece el diagnstico de uretritis
gonoccica. La presencia de clulas inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos
gramnegativos y cultivo negativo para N. gonorrhoeae establece el diagnstico de UNG.

El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende en gran medida de la correcta
obtencin, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos torundas, una
para el cultivo y otra para la extensin del exudado uretral para realizar la tincin de Gram. Las muestras
para cultivo debern inocularse en medios selectivos, (Thayer- Martin modificado, Martin-Lewis ) e
incubarse de modo inmediato a 35 -37 C durante 72 horas en una atmsfera de 3-10% de CO2 y humedad.
Cuando esto no sea posible, es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies).

Examen microscpico: En la secrecin uretral se debe observar presencia de clulas y bacteria
especialmente diplococos gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar: La presencia de leucocitos Polimorfonucleares.
1. Examen en medios de cultivo: Examinar todos los medios a las 18-24 horas. Si no hay crecimiento de
patgenos, incubar hasta las 48 h, . El Thayer Martn se incubarn, si es negativo, hasta 72 horas.
Agar sangre: (Streptococcus pyogenes o S.pneumoniae), Agar Chocolate (Haemophilus sp). Thayer Martin
(gonococo).
2. Pruebas bioqumicas: A todas las colonias sospechosas realizar pruebas bioqumicas Ejm. Prueba de
oxidasa y fermentacin de carbohidratos para el caso de Neisseria

METODOLOGIA

Observar las lminas previamente fijadas y coloreadas

RESULTADOS


DISCUSION:

CONCLUSIONES:



GLOSARIO

Aerobio, microorganismo que requiere del oxigeno
para su desarrollo.

Aerognico, que produce gas (CO2 y H2).

Agar, polisacrido extracto de un alga roja que se
utiliza como agente solidificante en medios de
cultivo biolgicos.

Aguja de inoculacin, pieza de platino fijado a un
mango de metal que se utiliza para efectuar la
estriacin de un medio bacteriano o para recoger
colonias para su transferencia.

Aislamiento, mtodo para obtener bacterias en
cultivo puro, por medio de subcultivos de colonias
discretas, utilizando diferentes tipos de medio.

Anaerobio, microorganismo que slo puede
desarrollar en ausencia total o parcial de oxigeno.

Anerognico, que no produce gas (CO2 y H2)

Antibitico, sustancia qumica producida por un
microorganismo y que tienen la capacidad de
inhibir el desarrollo de otros organismos vivos
sensibles.

Antimicrobiano, agente biolgico o qumico que
inhibe el crecimiento de microorganismos.

Antisuero, suero que contiene anticuerpos para
antgenos especficos

Bactericida, sustancia o agente qumico que
resulta letal para las bacterias, es irreversible.

Bacteriemia, presencia de bacterias en el torrente
sanguneo, acompaa a estados spticos y
tambin no infecciosos.

Bacteriosttico, sustancia o agente qumico que
inhibe el crecimiento bacteriano, es reversible.

Bacteriuria, presencia de bacterias en la orina;
puede presentarse en estados clnicos y
subclnicos.

Caldo, medio de cultivo lquido para bacterias
heterotrficas, compuesto por elementos nutritivos
esenciales.

Cepa bacteriana, cultivo puro de bacterias
formada por los descendientes de un solo
aislamiento.

Coliforme, bacilos gramnegativos aerbicos y
anaerbicos facultativos, que no forman esporas y
fermentan la lactosa con formacin de gas.6

Colonia, crecimiento visible de microorganismos,
en general en un medio slido y derivado de la
multiplicacin de un solo tipo de organismo.

Cromognico, que produce pigmento.

Cultivo, crecimiento de microorganismos.

Cultivo mixto, crecimiento de dos o ms
microorganismos en el mismo medio.

Cultivo puro, cultivo que contiene un crecimiento
bacteriano especfico de una sola especie de
microorganismo

Disentera, inflamacin del intestino, caracterizada
por dolor abdominal, tenesmo, y diarrea don sangre
y moco en las heces.

Entricas, relacionado al tracto intestinal.

Enterotoxina, toxina que produce cambios
patolgicos en el tubo digestivo, ejemplo toxina de
clera

Esterilizacin, proceso qumico o fsico o qumico,
utilizado para eliminar todos los microorganismos.

Extendido, preparado sobre un portaobjeto de una
capa muy delgada de material para su examen con
el microscopio.

Haloflico, microorganismo que puede tolerar una
alta concentracin de sales, por lo general hasta un
10%.

Hemlisis, presencia de una zona de eritrocitos
hemolisados alrededor de una colonia cultivada en
una placa de agar sangre.

Incubacin, mantenimiento de cultivos bacterianos
en condiciones favorables para su crecimiento,
especialmente temperatura.

Indicador, sustancia que hace visible el final de
una reaccin. Compuesto que cambia de color con
las variaciones del pH de una solucin o medio.

Infeccin, presencia de microbios vivos en tejidos.

Infecciones asintomticas, infecciones sin
sntomas clnicos; si los microorganismos se van
eliminando, tales infecciones tambin representan
un estado de portador.

Inhibicin, disminucin o suspensin de la funcin
como prevencin del crecimiento o la multiplicacin.
El crecimiento es inhibido por el agregado de
sustancias qumicas como los colorantes y los
antibiticos a un medio de cultivo.

Inoculacin, introduccin de un microorganismo o
inoculo, en un organismo animal o en un medio de
cultivo.

Inoculo, material que contienen el microorganismo
que va a ser introducido o transferido a un medio
de cultivo.

Latente, aparentemente inactivo.

Medio de cultivo, mezcla de sustancias nutritivas
en una forma slida, semislida o lquida, que llena
los requerimientos para el crecimiento y
reproduccin de los microorganismos.

Nutriente, material o sustancia que puede ser
utilizado como fuente de alimento.

Periodo de incubacin, es el tiempo entre el
momento de la inoculacin y el crecimiento visible
de bacterias en medios artificiales.

Puncin, cultivo en el cual los microorganismos
son inoculados con una asa de inoculacin en la
parte superior del medio para permitir el posible
crecimiento anaerbico.

Quimioterpico, compuesto qumico sinttico que
acta en forma bactericida o bacteriosttica sobre
los microorganismos, inhibiendo funciones vitales.

Resistente, que soporta la accin o efecto a algo.

Sensible, susceptible a la accin o efecto a algo.

Septicemia, presencia de microbios en la sangre,
relacionada con una infeccin o sepsis.

Subcultivo, transplante de bacterias viables
derivadas de otro cultivo.

Tiempo de generacin, es el tiempo que demora
una bacteria en dividirse o lo que es lo mismo, una
poblacin bacteriana en multiplicarse. Depende de
la especie bacteriana y las condiciones
nutricionales y ambientales.

Vector, agente animado o inanimado que lleva a
un microorganismo patgeno de un husped
enfermo a uno sano, causndole infeccin.

Virulencia, poder patgeno relativo de diferentes
cepas de microorganismos dentro de una especie.

Zoonosis, enfermedades de animales transmitidas
al hombre.

PRACTICA N 10

DIAGNSTICO MICOLGICO

OBJETIVOS
Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.
Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes etiolgicos de las micosis
humanas.
Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de hongos.

INTRODUCCIN
La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico presentan una variedad de morfologa, desde las
levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la industria alimentaria,
qumica o farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies estudiadas hasta la fecha (ms de
250,000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en stos
casos las enfermedades denominadas micosis.

Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfolgicos bsicos:
levaduras y mohos.

Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin o fisin
binaria. Una levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de una especie
filamentosa se denomina a esto dimorfismo.

Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una
espora. El elemento tubular que emerge se denomina hifa, el que sigue creciendo y ramificndose llegando
a formar un conjunto entrelazado al que se denomina micelio o talo. Parte de las hifas se introduce en el
sustrato y forman el micelio vegetativo y las que se proyectan hacia el exterior constituye el micelio areo
muchas levaduras, en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie, pueden producir
pseudohifas.

El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la identificacin
primaria; pueden ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En el
se producen los elementos de propagacin, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de
germinar en nuevo sustrato y as producir un nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas
sobre el medio de cultivo se denomina colonia.

Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico, ribosomas,
mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana
y una pared celular con caracterstica muy definidas. Se multiplican a travs de estructuras que puede ser
asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas distintas. Tambin lo hacen
mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o
fragmentos de micelio.

Como en otras enfermedades infecciosas, las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el
esquema clsico: examen directo, cultivos e inmunodiagnstico.

EXAMEN DIRECTO
El examen microscpico de la muestra patolgica; escamas de piel, pelos, fragmentos de uas, exudado
purulento, LCR o biopsias, permite observar las caractersticas hifas, esporas, levaduras, etc.

Se hace una preparacin en lmina portaobjetos con una gota de KOH al 10%. Para la cpsula de
Cryptococcus neoformans (LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cpsula. En los
exudados purulentos se recomienda realizar una tincin con Gram, Giemsa y tambin Wright. Si se trata de
cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina.

CULTIVOS
El medio ms utilizado en micologa mdica es el descrito por Sabouraud. A ste medio base se le aade
una cantidad superior de glucosas (40 x 100), denominndose as agar glucosado de Sabouraud (SGA), al
cual posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de evitar la contaminacin bacteriana y ciclo
eximida (actidiona) para inhibir los hongos saprofitos.

La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2-3 das para
levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C; los dermatofitos y otros causantes
de micosis cutneas a 25 a 30 grados centgrados (temperatura ambiental).

El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo con el tipo de micosis por
investigar.

MATERIALES
Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
Cultivos de especies ambientales: Penicillium, Alternaria, Aspergillus, Hormondendrum
Frasco con KOH al 10%, Mango de Kolle
Microscopio

METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con azul de lactofenol para su observacin
microscpica.

RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.

Jos Huapaya aya, Martha Flrez Flores

DISCUSION:

CONCLUSIONES:



OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS AMBIENTALES
Hongo ambiental y oportunista
Aspergillus spp.
Hongo ambiental
Penicillium sp



PRACTICA N 11

DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS

OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis superficiales y cutneas en
cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscpicamente.

INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina micosis. Dentro
de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada
de la piel o pelo. Varios son los agentes etiolgicos que pueden colonizar la piel.

Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y
anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa cornea o llegar a los estratos ms
profundos, sin invasin linftica. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades
por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el de
dermatofitosis se reserva para los producidos por los hongos dermatofitos.

MICOSIS SUPERFICIALES

Piedra negra
Se caracteriza por la presencia de mdulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de color negro. El
agente causal es Piedra hortae.

Piedra blanca
Muestra mdulos blanco-grisceos, que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte
distal o central de pelo axilar, pubiano y crural. Agente causal Trichosporum cutaneum o T.beigelii.

Tia negra
Es una infeccin superficial del estrato corneo de la piel debido a la colonizacin Hortaea werneckii. Se
caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras; frecuente en
palmas, dedos y plantas que en otro lugar de la piel.

Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas confluentes con pigmento variable
(hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco,
sobre todo hombres y espalda. Al examen microscpico detectan los grupos de levaduras con las hifas.

MICOSIS CUTNEAS

Dermatomicosis
Micosis producida por Candida albicans, hongo oportunista. Agente causal de los intertrigos (submamario o
inguinal), eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidisico. Adems de s
C.albicantambin pueden producir onicomicosis Candida stellatoidea, C.tropicalis, C.guillermondii y
C.parapsilosis.

Las preparaciones teidas con Gram, muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales, con brotes de
blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud.

La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Candida; de todas
formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibiticos (cloranfenicol). Los
medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies.

La incubacin se realiza a temperatura ambiente (2530 C) cuando se trata de medios con inhibidores y a
37 C. en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se
pueden observar las colonias caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o
mates de 1 a 3 mm de dimetro. La prueba de filamentacin y produccin de clamidosporas caractersticas
son muy sencillas y tiles para la identificacin de C.albicans.

Dermatofitosis
Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo y uas) que ocurre en los seres humanos y
animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados dermatofitos.

Los agente etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros: Epidermophyton, Microsporum y
Trichophyton. El diagnstico se puede hacer mediante:

Examen Directo
Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso sern pelos, escamas de piel o
muestras ungueales, que se toman con pinzas o bistur estril del centro o borde de la lesin y se colocan
en un portaobjetos. Se transportan entre dos portaobjetos limpios, y se observa directamente al microscopio,
con una gota de hidrxido de potasio (KOH) al 10%, cubierto con un cubreobjeto.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor
del tallo (ectotrix).

Cultivo
Las muestras se siembran en SGA, adicionado de cicloheximida, que inhibe los hongos saprofitos. La
identificacin se hace sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias entre ellos la produccin de
pigmento. Luego las caractersticas microscpicas, observacin de macroconidias y microconidias y
elementos accesorios sirven para definir cada gnero y especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de sus colonias desarrolladas en
SGA.

MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de:
- Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
- Microsporum gypsum, Microsporum canis
Preparaciones en lmina coloreadas con azul de lactofenol
Microscopio

METODOLOGIA:

Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

RESULTADOS:

MUESTRA OBSERVACION
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:
NOMBRE DEL HONGO:


MICROSCOPICA:
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:

DISCUSION:

CONCLUSIONES:


Microsporum canis
Col. Azul de Lactofenol
Epidermophyton flocosum
Trichophyton rubrum


PRACTICA N 12

DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS
SUBCUTNEAS, MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS

OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas, y subcutneas.
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de hongos causantes de las micosis cutneas y
subcutneas.
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis sistmicas.
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de hongos causantes de las micosis sistmicas.

INTRODUCCIN

MICOSIS SUBCUTANEA:
Se consideran en ste grupo las infecciones fngicas que afectan tejido subcutneo, dermis y epidermis,
causadas por hongos exgenos, saprofitos, cuyo hbitat es el suelo y las plantas. Las infecciones ms
frecuentes son:

La esporotricosis, debida a Sporothrix schenckii, que se produce habitualmente por la penetracin en la piel
de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infeccin tiende a permanecer localizada en
el tejido subcutneo y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de
inoculacin, que va seguida de la formacin de ndulos y abscesos mltiples que siguen las vas de drenaje
de los linfticos superficiales.

La cromomicosis (cromoblastomicosis), es causada por Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y
Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una ppula en el sitio de inoculacin, que
ms tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales, semejantes a una coliflor; puede haber
infeccin secundaria y ulceracin. Las lesiones, por lo general, estn limitadas a los pies y las piernas, pero
puede afectar la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; tambin pueden haber abscesos
cerebrales.

El micetoma (maduromicosis), es causado por Nocardia y Streptomyces.

MICOSIS SISTEMICAS Y OPORTUNISTAS:

Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afecta varios rganos y tejidos. Encontramos aqu dos
grupos:

(a) Las producidas por especies consideradas patgenas, con carcter endmico, este tipo de micosis se
transmite por inhalacin, ingesta, o traumatismos: blastomicosis y paracoccidiodomicosis; y
(b) Las producidas por especies oportunistas, Estas patologas se dan en huspedes inmunodeprimidos (con
trastornos endocrinos, inmunodeficiencias, enfermedades oncohematolgicas, alteraciones metablicas y
anatmicas, drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o citostticos,
sometidos a ciruga, dializados, quemados, trasplantados y cateterizados) y son causadas por hongos saprofitos
del ambiente o comensales de cuerpo humano. Por ejemplo Candida y Cryptococcus.

La infeccin se adquiere por la inhalacin de conidios en la fase micelial, desarrollndose en el husped un foco
pulmonar primario. En caso que el paciente presente inmunodeficiencia puede haber una diseminacin
sistmica.

El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase levaduriforme en los siguientes
productos: expectoracin, secrecin de lesiones mucocutneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se
puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37 C. Estas pueden ser:

Blastomicosis (Blatomyces dermatitis)
La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va hematgena, causando lesiones
destructivas focales en los huesos, piel, prstata y otras vsceras; en general no se afecta el tubo digestivo.

Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas, parecen originarse como metstasis a partir de las
lesiones pulmonares primarias, que se abren a la superficie cutnea causando lesiones ulceradas y
encostradas. Las lesiones se caracterizan por inflamacin granulomatosa, microabscesos y progresiva
destruccin de los tejidos; la calcificacin es rara.

Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis)
Las primeras lesiones aparecen en las mucosas de la boca o de la nariz y se difunden por expansin directa,
es decir, a travs de los lmites cutneo-mucosos afectan la cara; en ocasiones, la diseminacin se produce
a travs de los tejidos linfticos incluyendo el bazo.

En el tubo digestivo las lesiones comienzan en el tejido linfoide submucoso y pueden originar formacin de
lceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutneos que, por extensin a la superficie
cutnea, pueden producir lesiones deformantes de gran tamao, encostradas o ulceradas. Las lesiones
cutneas constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.

Histoplasmosis (Histoplasma capsulatum)
Causada por la inhalacin de esporas lo que conduce a la infeccin pulmonar; aparecen lesiones miliares
distribuidas por todo el parnquima pulmonar y aumento de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin
inicial es benigna, puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como una infeccin respiratoria
autolimitada.

En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa, se disemina y causa lesiones prcticamente
en todos los tejidos y rganos; aparece fiebre y postracin, as como el aumento del tamao del hgado,
bazo y ganglios linfticos, simulando tuberculosis miliar; en ocasiones, puede evolucionar como una
enfermedad pulmonar crnica con cavitacin, simulando la tuberculosis pulmonar crnica. Las lesiones de
los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamacin granulomatosa.

Coccidiomicosis (Coccidioides immitis)
La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire; aproximadamente en el 60% se
pone de manifiesto nicamente por la adquisicin de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los
antgenos del hongo; en un 40% se presenta neumonitis aguda acompaada con frecuencia de pleuresa y
varias erupciones cutneas; alrededor del 5% desarrollan una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin
que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificacin; en menos del 1%
aparece una diseminacin con lesiones granulomatosas spticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos la
piel, huesos, articulaciones y meninges.

Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las causadas por bacterias
pigenas, pero en la enfermedad pulmonar crnica y en las formas diseminadas, la inflamacin es
granulomatosa.

Criptococosis
Esta ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de clulas T y se debe a Cryptococcus
neoformans, este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hbitat es el suelo
contaminado con material fecal de aves.

La Criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el SIDA. Dentro de las formas clnicas
existe: criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada, cutnea y mucocutnea.

El producto ms frecuente a analizar es sedimento de LCR, en el se observan las tpicas levadura
capsulazas que se destacan por contraste negativo mediante emulsin con tinta china.

Candidiasis (Candida spp)
Las infecciones causadas por Candida es muy variada, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser
patgeno en humanos y animales en los cuales viven en estado saproftico. La cavidad bucal y el resto del
tracto gastrointestinal son los territorios preferentes, en donde C.albicans se encuentra en el 20% de las
personas y en menor proporcin otras especies de Candida.

Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de Candidiasis:
1. Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo
2. Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e inmunosupresores.
3. Maniobras diagnosticas y teraputicas agresivas (cateterismos, sondajes)
4. Debilidad general y/o desnutricin.
5. Infeccin por el virus de inmunodeficiencia humana y la drogodependencia.

El diagnostico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin directa de Candida (mediante
coloraciones Giemsa, Gram) en muestra clnicas y en cultivos.

MATERIALES

Tubos sellados de SGA con cultivos de las diferentes micosis
Lminas, laminillas, colorante azul de lactofenol
Microscopio

METODOLOGA

Observacin de las muestras macroscpicamente
Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar a 10x y 40x.

RESULTADOS
Graficar lo observado.

MUESTRA OBSERVACION
NOMBRE DEL HONGO:


MICROSCOPICA:
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:


MUESTRA OBSERVACION
NOMBRE DEL HONGO:


MICROSCOPICA:
NOMBRE DEL HONGO:

CARACTERISTICAS

MACROSCOPCA:

MICROSCOPICA:


DISCUSION:

CONCLUSIONES:



Phialophora verrucosum
Col. Azul de lactofenol
Sporothrix schenckii
Cladosporium carrionii
Examen directo con KOH

Histoplasma capsulatum
Cryptococcus neoformans
Coccidioides immitis

Candida albicans
Coloracin Gram
Candida albicans
Examen directo con KOH

GLOSARIO

Absceso, acumulo local de pus que representa los
restos licuados de leucocitos (neutrfilos) y tejido
destruido.

Algodoncillo, una micosis de la mucosa de la boca
y vas respiratorias altas.

Clulas eucariticas, clula con membrana
nuclear.

Conidios, esporas asexuales de hongos nacidos
en estructuras ramificadas a modo de tallo llamado
conidiforos.

Descamacin, esfacelo excesivo de las capas
superficiales de un tegumento, como la epidermis
de la piel.

Dermatofitos, grupo de hongos queratinfilos que
invaden las zonas queratinizadas superficiales del
cuerpo (pelo, piel, uas).

Dermatomicosis, proceso mictico de la piel
causada por cualquier tipo de hongos,
frecuentemente Candida.

Dermatitis, inflamacin de la piel.

Hematgena, originado en o transportado por la
sangre.

Hifa, estructura tubular de hongos vegetativos que
posee paredes cruzados (tabiques).

Hongos dimrficos, hongos que pueden sufrir
conversin morfolgica y crecer en forma de
levadura o de moho segn las condiciones
ambientales; muchos hongos patgenos son
dimrficos.

Inmunodeficiente, relativo a un trastorno del
sistema inmunitario en el que la inmunidad humoral
o celular es infrecuente, y esta disminuida la
resistencia a la infeccin.

Inmunoincompetente, incapacidad para
desarrollar una respuesta inmunitaria al estimulo de
los antgenos.

Macroconidios, el mayor de dos tipos de conidios
producidos por hongos que tienen de ambos tipos
pequeos y grandes.

Micelio, la masa de hifas, frecuentemente de
aspecto algodonoso, formada por una colonia de
mohos.

Micetoma, infeccin crnica causada por diversos
hongos y actinomicetos.

Microconidios, el tipo ms pequeo de conidios en
hongos.

Miliares, relativo al trastorno caracterizado por la
aparicin de lesiones muy pequeas, como la
tuberculosis miliar, que se caracteriza por la
aparicin de tubrculos diminutos distribuidos por
todo el organismo.

Mohos, grupo heterogneo de hongos que crece
en forma filamentosa; unos pocos son dimrficos.

Saprofito, microorganismo que normalmente existe
en material orgnico muerto.

Tia, lesin circular causada por hongos
queratinfilos (dermatofitos); la lesin es escamosa,
pruriginosa y se difunde perifricamente.

Tubo germinativo, yemas alargadas que se
desarrollan cuando hongos dimrficos se convierten
de la forma levadura a la forma moho de
crecimiento, y maduran para producir hifas
verdaderas.

PRACTICA N 13

MTODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO

OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades
que presentan.
Observar y caracterizar morfolgicamente clulas cultivadas.
Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras disciplinas cientficas.

INTRODUCCIN
Los virus son microorganismos intracelulares obligados por carecer de sistemas energticos. Estas
caractersticas son explotadas para su aislamiento y diagnstico adems de muchos otros tales como su
accin patgena que depende de muchos factores inherente al microorganismo y al hospedador, receptores
especficos existentes, pH.

Un factor determinante y definitivo para el aislamiento viral es la obtencin temprana de una muestra
adecuada, esto debido a que la excrecin del virus tiende a ser por pocos das y la concentracin de
partculas virales disminuye progresivamente con el tiempo. Toda muestra para estudio virolgico debe
obtenerse con mucha asepsia, usando siempre soluciones tamponadas, con antibiticos, sobre todo su
transporte debe ser con hielo inmediatamente para ser procesadas o colocadas en congeladores a -20 C,
estas no deben dejarse a temperatura ambiente o en incubadora, tampoco es recomendable congelar y
descongelar las muestras, pues as se podra alterar la estructura del agente viral.

Es importante que las muestras incluyan una ficha de datos epidemiolgicos como: Nombre, edad, sexo,
antecedentes, fecha de inicio de la enfermedad, sntomas, procedencia, etc.

TIPOS DE MUESTRAS

Hisopado farngeo
Lavado de garganta, hisopado nasofarngeo del fondo de la garganta. El lavado de garganta dentro las 18
horas de iniciado la enfermedad. Para adenovirus, influenza, sarampin, citomegalovirus y parotiditis.

Heces
Recolectar en frasco estril (aproximadamente 2 g) y guardar a 20 C, hasta el envo al laboratorio, la
muestra se obtiene dentro de los 10 das de iniciada la enfermedad, si es hisopado rectal humedecer la
torunda con suero fisiolgico; obtenida la muestra colocarla en caldo tioglicolato hasta su envo siempre en
refrigeracin. Para aislar rotavirus, adenovirus, coxsackie A y B, reovirus y poliovirus.

Piel
Raspado de la ppula o mcula, fluido de vescula o pstula con ayuda de un hisopo colocar en un caldo
buffer a 20C. Tambin puede colocarse la muestra directamente sobre un cubreobjetos para anticuerpos
fluorescentes. Para herpesvirus, varicela.

Secreciones oculares
Con ayuda de un hisopado humedecido obtenerse secreciones de la conjuntiva, lavado de ojos, colocar las
muestras en tubos con caldo buffer y con otro hisopo para improntas sobre portaobjetos para conjugados
fluorescente. Para aislar virus como adenovirus, herpesvirus, sarampin.

Tejidos
Se obtiene por biopsias, se limita a algunos rganos como hgado, bazo, verrugas, ganglios inflamados;
mantener a 20 C hasta su procesamiento.

Sangre
Sangre venosa en cantidad de 510 mL sin anticoagulante para la obtencin del suero; generalmente es
usada para pruebas serolgicas en caso de hepatitis, HIV, etc.

El xito en el aislamiento del virus depende de la correcta recoleccin, transporte y almacenamiento de las
muestras.

TCNICAS DIRECTAS PARA LA DEMOSTRACIN VIRAL
Dentro de las tcnicas directas se encuentran:
- Las que visualizan la partcula viral o su efecto especifico (efecto citoptico) como las tinciones para
microscopia de luz, microscopia electrnica y el cultivo de aislamiento viral.
- Las pruebas para demostracin de antgenos virales: los inmunoensayos (ELISA, IFA, RIA) y las pruebas de
ltex.
- Las que evidencian la presencia de material gentico viral como: ensayos de amplificacin gentica
(reaccin en cadena de la polimerasa o PCR) e hibridacin (sondas, ADN ramificado, etc.).
- Visualizacin de la partcula viral.

AISLAMIENTO VIRAL EN CULTIVO
Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en
lneas celulares. La invasin viral se evidencia a travs de un cambio celular o efecto citoptico (EC) y
mediante pruebas complementarias. Por la especificidad de los virus estos no desarrollan en cualquier clula
pues requieren de receptores especficos es por ello que existen variabilidad de clulas las que las
clasificamos por su origen en:

Cultivos primarios
Son aquellos que se obtienen por disgregacin enzimtica y mecnica de embriones, rganos o tejidos
(normales o tumorales) de humanos o animales, para producir una suspensin celular. Se mantienen
intactas por 3 a 5 pasajes.

Lnea celular
Cuando un cultivo primario es subcultivado por primera vez. Existen varios tipos de lneas celulares. Una
lnea celular diploide presenta el 75% de sus clulas con el cariotipo original de donde fueron obtenidas. Una
lnea celular establecida es aquella que ha demostrado potencialidad de ser subcultivada indefinidamente in
vitro. Ej. Vero, MCR5, HELA, Hep2, W138, Flow 2002.

TCNICAS INDIRECTAS PARA EL DESCUBRIMIENTO VIRAL

Estas son las tcnicas serolgicas tradicionales para descubrir anticuerpos contra determinado agente viral,
teniendo en cuenta que la exposicin al agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que
genera la produccin de anticuerpos especficos. Estos ensayos se pueden clasificar en tres grupos con
base en la cuantificacin de la reaccin antgeno-anticuerpo:

a) Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se une al antgeno para ejercer alguna funcin no
relacionada con el virus. Ej. Fijacin del complemento (FC), hemoaglutinacin indirecta (HAI), aglutinacin
por ltex (AL).

b) Los que miden la capacidad de los anticuerpos para bloquear la funcin viral especfica como la
neutralizacin, la inhibicin de la hemoaglutinacin (IHAI), la inhibicin de la neuraminidasa (que mide la
capacidad de los anticuerpos para bloquear la infectividad viral), la hemoaglutinacin viral y la actividad de la
neuraminidasa.

c) Los que miden directamente la interaccin antgeno-anticuerpo como por ejemplo: la inmunofluorescencia
(IFA) indirecta, el radioinmunoanlisis (RIA), ELISA y el Western Blot (WB).

INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO

La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas
(EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida , constituye uno de los
primeros inmunoensayos enzimticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y
luego aplicados al diagnstico microbiolgico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre
las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya que, la enzima acta
catalticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir la densidad ptica de la coloracin
final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-istopos
utilizados en radioinmunoensayo (RIA)
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios mdicos y de
investigacin, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la
identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en muchos
laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin y corto tiempo
de vida de los materiales radioactivos.
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran nmero de
muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn reemplazando parcialmente a tcnicas en el
laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en funcin de
como se combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antgeno o de
anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos que permiten valorar las
uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubacin, con la adicin posterior
de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de
reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima
que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en
la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del
paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG)
para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el anticuerpo
tenemos:

Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de las
molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la proximidad del
Ag y el Ac es grande.

Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga inica
opuesta, como sucede con los grupos NH3
+
(amonaco)que reaccionan vidamente con el grupo
COOH
-
(grupo carboxilo).

Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos electropositivos
de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno.

Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en:
ELISA directo: ensayo ELISA simple de dos capas
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antgeno en la
solucin analizada. Se debe incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las
analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado y
controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirecto
Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los controles positivos y
negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos : uno primario contra el
antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios por cada
primario.
ELISA sndwich: ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos
Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un
segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un
anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo
tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo
anticuerpo.

Fijacin del Antgeno a la fase slida:
La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o
nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de poliestireno
gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para formar enlaces
estables que los de poliestireno no tratados.

El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los sitios
activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer puede ser
carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.

La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son factores
importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden afectar la
sensibilidad del ensayo.

Reaccin con anticuerpo:

La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiolgicas:
pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl).
El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas.

Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado final
del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso (0,1% a 1%)
de una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase
slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero entero, gelatina u otros.

Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno sorbitn
{ surfactante } )para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es agregado en
los tampones de dilucin y de lavado.

Adicin del conjugado enzimtico :

El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta
enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradish peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina
(Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la seleccin
de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla
eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo.

Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgeno-
anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.

Adicin del sustrato:

La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP
hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El
sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros
compuestos cromgenos tales como:

Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro.

o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja
a pardo oscuro.

cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede variar del
color al azul.

La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reaccin.

La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros

PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es
la deteccin precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El
diagnstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas
precoces de la infeccin, as como intentar modificar las conductas que favorecen la transmisin del
virus a otras personas.

Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH

Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo y generan un
resultado en menos de 15 minutos en comparacin con la prueba estndar de cribado con tcnicas
de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o das. Tanto la prueba
de deteccin rpida como el EIA detectan anticuerpos especficos del VIH.

Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de deteccin rpida del
VIH:

Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)
Ser reproducible
Ser fcil de aprender, realizar e interpretar
Ser precisa
Ser de fcil almacenamiento
No requerir equipamiento adicional
No tener carcter invasivo

Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que los pacientes reciban
informacin y asesoramiento sobre la enfermedad y la infeccin. Si la prueba es negativa, se
considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el perodo
ventana de exposicin (primeros 3 a 6 meses de post exposicin). Si el resultado es positivo, se
considera un resultado preliminar que debe confirmarse con tcnicas de EIA y con la prueba Western
blot.
Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de las pruebas de
deteccin rpida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario para
realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de un control de
procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (ms
fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan visualmente.

Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH

Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las numerosas
pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de
accin ms frecuentes en estas pruebas son la aglutinacin, la inmunoconcentracin (flow through),
la inmunocromatografa (lateral flow) y la fase slida (solid phase).
El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara entre las distintas
pruebas de deteccin. La mayora incluye uno o ms antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160)
y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antgeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3 6 meses. En general,
se recomienda el alta mdica a los 6 meses despus de una actividad de riesgo de infeccin.

PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT
Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una
membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son
recombinantes o sintticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una enzima que
se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin del color en el papel.
Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus. Las
pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 15
minutos.

TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO
Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus, demostrndose la reaccin
positiva por la muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos en el uso de
animales de laboratorio: el confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una
infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia de enfermedades vricas
latentes en los animales de experimentacin que pueden activarse por el mismo trauma que supone
la inoculacin con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretacin de los resultados.
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va de
inoculacin, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos
respecto a un tipo de clulas .El animal ms utilizado es el ratn de menos de dos das de edad
especialmente como animal de rutina con fines diagnstico siendo el que proporciona el principal
mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A.
el ratn lactante se utiliza en virologa para :
Inocular por va intracerebral (0,06 ml) : Herpes simple
Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y Reovirus
Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie
el ratn adulto se utiliza :
Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de encefalitis
Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intranasal ( 0,05 ml): Influenza A,B y C
Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de inmunosueros.
la cobaya se utiliza para :
Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de inmunosueros
hasta un ml.
el conejo se utiliza para :
Inocular por va intradrmica Herpes tipo B
Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas
Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o intraperitoneal
hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros.

Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn.
Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin
Tcnica :
a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior de un embudo
invertido, introducir en l el ratn.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de inoculacin que
puede ser: IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutnea, ID intradrmica, IV
intravenosa, IP intraperitoneal.
Interpretacin de los resultados: Se manifiesta la infeccin en el ratn, se observar sta por la
sintomatologa , la muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos o ms
semanas el animal inoculado


TCNICAS DE INOCULACIN EN EMBRIN DE POLLO
Existen varios mtodos de inoculacin de huevos frtiles, dependiendo del virus que desea cultivarse.
Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38C dependiendo del virus).
Antes de proceder a la inoculacin de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con
alcohol.
Inoculacin corio-alantoidea
Edad del embrin : 10 a 12 das
Mtodo :
Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lmpara de 100 vatios. sta tcnica llamada de
iluminacin permite apreciar los vasos sanguneos del embrin, la cmara de aire con claridad a
travs de la cscara. Con un lpiz se delimitar la cmara de aire as como tambin el punto en que el
corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cmara de aire artificial de la siguiente
manera:
a) Quitar un pequeo tringulo de cscara de encima del corio-alantoides sin daar la frfara
b) Utilizando una aguja de diseccin incidir cuidadosamente la frfara sin daar la membrana corio-
alantoidea que est debajo.
c) Realizar una pequea abertura en la cmara de aire y valindose de un gotero realizar una succin
suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corio-alantoidea se separa de la frfara
efectundose entonces la inoculacin a travs de la hendidura de la misma.
Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 das examinando diariamente

Inoculacin en saco amnitico
Edad del embrin: 7 a 14 das
Mtodo
Proceder como para la inoculacin corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea aparezca
se aumenta el tamao del orificio .A travs de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas
estriles se extrae una parte de la membrana amnitica. Inocular en la cavidad amnitica, sellar e
incubar.
Inoculacin de saco alantoideo
Edad del embrin : 10 das
Mtodo
Se procede como en la inoculacin corio alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular
directamente en la cavidad alantoidea. Con el agujero realizado en la cmara de aire se evita el
reflujo del inculo motivado por la presin. Sellar e incubar.
Inoculacin en saco vitelino
Edad del embrin: 3 a 8 das
Mtodo
Tomado de Microbiologa Granados 1
a
edicin
Se efectuar la inoculacin directa a travs de la cmara de aire, puesto que a la edad sealada el
saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar.
Examen
Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodn empapado en desinfectante. Utilizando
tijeras y pinzas estriles eliminar la cscara de encima de la cmara de aire. Extraer la membrana
interna (frfara) y colocarla en agua destilada estril. Examinarla para apreciar lesiones.
La identificacin de virus aislados en huevos puede hacerse por tcnicas de neutralizacin o de
fijacin del complemento con sueros especficos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular
producido por el virus como la formacin de placas o muerte del embrin, como en el caso de los
myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los hemates. Las pruebas de
fijacin de complemento tienden a dar reacciones de grupo ms que especficas de tipo.

MATERIALES

Frascos para cultivos celulares con medio de cultivo de crecimiento EAGLE (20% de suero bovino fetal).
Lminas fijadas con efectos citopticos de virus de la rabia
Microplacas para ELISA para VHA.
Prueba de ELISA rpida para VIH

METODOLOGA

Observar los medios de cultivos usados para cultivo celular
Observar las laminas fijadas al microscopio y las pruebas de ELISA.

Tomado de Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica Baker
RESULTADOS:

DISCUSION:

CONCLUSIONES:



Corpsculo de Negri en Neuronas
Virus de la Rabia
Efecto citoptico
Sincitio (Clulas multinucleadas)
Virus Sincitial Respiratorio
GLOSARIO

Acido nucleico viral, puede ser ADN o ARN,
consta de una sola cadena abierta o circular,
monocatenario o bicatenario; se conoce como
prfago.

Bacterifago, virus que infectan a las bacterias; se
reproducen en cultivos de bacterias susceptibles.

Cpside, constituida por la unin de protenas
globulares o capsmeros, protege al cido nucleico;
puede ser icosadrica, helicoidal o compleja.

Ciclo ltico, clula receptora + virus fijacin
penetracin replicacin del cido nucleico
sntesis de capsmeros ensamblaje de los
nuevos virus lisis o liberacin.

Ciclo lisognico, clula receptora + virus
fijacin penetracin prfago + ADN celular
sntesis de capsmeros ensamblaje clula
lisgena: ADN viral + cromosoma bacteriano.

Cuerpos de inclusin, estructuras intracelulares
pueden ser agregados de virus en el interior de una
clula afectada o acumulo anormales de material
celular que se producen como consecuencia del
trastorno metablico inducido por el virus.

Efecto citoptico (ECP), cambios en la morfologa
celular, lisis celular, vacuolizacin, formacin de
sincitios y existencia de cuerpos de inclusin.

ELISA, abreviatura de anlisis de inmunoabsorcin
ligado a enzimas.

Hemaglutinacin, propiedad que permite detectar
virus en cultivos celulares por aglutinacin de
eritrocitos.

Inmunodeficiente, relativo a un trastorno del
sistema inmunolgico, en el que la inmunidad
humoral o celular es infrecuente, y esta disminuida
la resistencia.

Inmunodiagnstico, relativo o perteneciente a un
diagnstico basado en reacciones antigeno-
anticuerpo.

Inmunofluorescencia, tcnica utilizada para
identificar rpidamente un antgeno, exponindolo a
los anticuerpos conocidos, marcados con
fluoresceina y observando la caracterstica reaccin
de precipitacin antgeno-anticuerpo.

Inmunoincopetencia, incapacidad para desarrollar
una reaccin inmunitaria al estimulo de los
antgenos.

Inmunocomprometido, relativo a una situacin o
sujeto caracterizado por que las respuestas
inmunitarias esta debilitado por una infeccin o por
un frmaco inmunosupresor.

Respuesta inmunitaria, funcin defensiva del
organismo con produccin de anticuerpos para
destruir antgenos y tumores invasores.

Sincitio, acumulo de clulas que contienen mas de
un ncleo.

Transduccin viral, es la transferencia de ADN de
un husped a otro, por un virus; ocasiona la
resistencia a los antibiticos.

Virus, son elementos genticos extracromosmicos
constituidos por un cido nucleico y una cpsula
proteica o cpside; en ocasiones puede presentar
una envoltura membranosa; son especficos en
cuanto a que huspedes pueden infectar. A las
partculas vricas se les denomina viriones.

Viroides, filamentos sencillos de ARN, sin cpside;
se replican dentro de clulas vivas, sus huspedes
son plantas.


FUENTES DE INFORMACIN

Arenas R. Micologa Mdica Ilustrada.2 edicin.2005. Editorial Mc Graw Hill
Bailey & Scott. Diagnstico Microbiolgico .11 edicin 2004.Editorial Mdica
Panamericana.
Granados R. Microbiologa Tomo II.2 edicin.2003.Editorial Thomson Paraninfo
Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica 18 edicin 2005 Editorial
Manual Moderno
Koneman Diagnstico Microbiolgico 6 edicin .2008.Editorial Mdica
Panamericana
Murray P. Microbiologa Mdica.5 edicin 2008.Editorial Elsevier
Sherris Microbiologa Mdica. 4 edicin.2005.Editorial Mc Graw Hill
Baker F.J, Breach M.R. Manual de Tcnicas de Microbiologa dica.1990.Editorial
Acribia
Cann A Principios de Virologa Molecular. 4 edicin.2005. Editorial Acribia
Organizacin Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional
de la Organizacin Mundial de la Salud. Garanta de calidad en el diagnstico
serolgico de la Infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana .
Publicacin N 42
Ministerio de Sanidad y Poltica Social. Catalua .Espaa. Prueba de deteccin
rpida de la infeccin por VIH. AATRM Nm. 2007/3
Cristhopher Donats Cruz Malpica. Estandarizacin de la prueba de Ensayo
Inmunoenzimtico para la deteccin de anticuerpos IgG en sueros humanos para
el virus Phlebotomus fever. Tesis para optar el ttulo de qumico farmacutico.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioqumica
2001
http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.h
tm
Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.
Procedimientos en Microbiologa Clnica.
www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm
Moura AC Diversidade gentica, densidade populacional e potencial de promoo
de crescimento de rizobactrias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestra].Bahia :
Universidade Federal do Renccavo ; 2007.
Chaves L Aspectos bioqumicos e moleculares de bacterias isoladas de terra preta
antropognica (TPA) na regio da Amaznia Brasileira.[Tesis Maestra] Piracicaba :
Universidade de So Paulo; 2007

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