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UNIDAD 5

PURIFICACIN DE ANTICUERPOS


GENERALIDADES:
Los anticuerpos (Ac) son glicoprotenas que pertenecen a la parte efectora de la
respuesta inmune humoral. Se sintetizan por las clulas plasmticas y se localizan
en la mayora de los fluidos biolgicos.

La purificacin de los Ac ha sido una prctica muy importante, debido a que los
productos purificados son utilizados como herramientas de uso teraputico,
preventivo, diagnstico y de investigacin. Como uso teraputico o preventivo en
humanos, se utilizan sueros homlogos (de la misma especie) y heterlogos (de
especie diferente) cuyo grado de pureza y efectividad deben de ser factores
importantes que considerar. En el caso de su uso como reactivos para diagnstico
e investigacin se requieren anticuerpos purificados que presenten gran
especificidad.

Existe una gran variedad de mtodos usados para purificar anticuerpos. La
eleccin correcta del mtodo de purificacin depende de una serie de variables,
como son el uso que se les dar a los anticuerpos, las especies filogenticas en
las cuales se generaron, la clase o subclase si es un anticuerpo monoclonal, etc. A
menudo es necesario combinar varias tcnicas para llevar a cabo la purificacin
con xito.

Los mtodos de separacin y purificacin de anticuerpos pueden ser
inespecficos, cuando se desea separar la fraccin de las -globulinas del resto
de las protenas que constituyen el plasma, o especficos cuando se desea
separar del suero o plasma anticuerpos con una especificidad determinada.

Purificacin Inespecfica
Los mtodos de purificacin inespecfica de los anticuerpos se basan en
aprovechar algunas de las propiedades fisicoqumicas de protenas como son:
diferencias en solubilidad, carga elctrica neta, tamao y peso molecular (PM);
pero tambin aqu se incluye un mtodo basado en una propiedad biolgica de las
bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus sp. que unen a travs de su
protena A y G respectivamente, la regin Fc de los anticuerpos de clase IgG.

Algunas consideraciones sobre estas propiedades son:
Solubilidad: la solubilidad de las protenas depende no solo de la variedad de
grupos residuales de aminocidos y de la manera en que se pliega la cadena
peptdica, sino tambin de las propiedades del sistema en el cul se encuentra la
protena. Los cuatro factores que afectan la solubilidad son: fuerza inica, pH,
temperatura y la constante dielctrica del disolvente. As, los siguientes mtodos
se basan en diferencias de la solubilidad de los anticuerpos con respecto a las
dems protenas:
Precipitacin fraccionada con sales neutras.



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Precipitacin fraccionada con sales neutras combinada con hidrlisis
enzimtica con pepsina.
Mtodo de Cohn o precipitacin fraccionada con disolventes orgnicos
miscibles con el agua (etanol, rivanol, acetona).

Carga: la carga neta de las protenas la determina en general los grupos de
aminocidos presentes y el pH del medio en que se encuentre. Los mtodos
basados en esta propiedad son:
Electroforesis
Cromatografa de Intercambio inico

PM-Tamao: bajo el principio de que una molcula de mayor peso molecular
tiende a ocupar mayor espacio y por lo tanto la resistencia que le ponga el medio
va a ser fundamental para determinar s fluye o sedimenta con mayor o menor
rapidez. Esto sucede en mtodos como:
Exclusin molecular.
Ultracentrifugacin en gradiente de densidad.
Electroforesis-SDS-Poliacrilamida.

Afinidad por protena A y G: la regin Fc de los anticuerpos IgG tiene una gran
afinidad por la protena A de Staphylococcus aureus y la protena G de
Streptococcus sp., siendo esto de utilidad para separar a los anticuerpos de esta
clase. El mtodo basado en esta propiedad es:
Purificacin de Ac de clase IgG por cromatografa de afinidad.

Purificacin especfica
Como se mencion anteriormente la purificacin especfica tiene como finalidad
separar del suero o plasma Ac con una especificidad determinada y para ello es
necesario utilizar reacciones Ag-Ac, es decir se basa en las propiedades
inmunolgicas de estas molculas. Bsicamente pueden ser llevados a cabo por:

Adsorcin: consiste en hacer interaccionar a los Ac indeseables con sus
correspondientes antgenos y separar de la mezcla los complejos Ag-Ac.
Eliminar los Ac indeseables.

Adsorcin-Elucin: se basa en utilizar antgenos puros que al interaccionar con
el suero inmune se combinan especficamente con sus anticuerpos especficos, se
separa el complejo Ag-Ac de la mezcla, y bajo el principio de que la reaccin es
reversible modificando el pH, la fuerza inica, la temperatura o la concentracin
del Ag, se disocia el complejo para obtener el Ac deseado.
Obtener los anticuerpos que se desean.

Cromatografa de Afinidad: es una tcnica que conjunta el principio de
adsorcin-elucin y la cromatografa. Se basa en hacer pasar la mezcla de Ac a
travs de una columna cromatogrfica empacada con un soporte (Sepharosa), el
cual tiene unido covalentemente (utilizando bromuro de ciangeno) un Ag puro.
Los Ac especficos se unirn al Ag. Posteriormente, se lava la columna para



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separar las protenas no enlazadas y el Ac deseado es separado de la columna
por elucin, disociando la reaccin Ag-Ac modificando el pH y/o la fuerza inica.
Tambin esta disociacin se puede lograr agregando una concentracin elevada
de antgeno en forma soluble. Adems de la reaccin Ag-Ac, este mtodo aplica a
otros sistemas en donde se encuentre un ligando bioespecfico como enzima-
sustrato, carbohidratos-lectinas, etc.




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PRCTICA No. 13
PURIFICACIN FRACCIONADA CON SALES NEUTRAS
Purificacin de -globulinas a partir de plasma humano


MARCO TERICO:
La precipitacin con sulfato de amonio es uno de los mtodos ms comnmente
usados para extraer protenas de una solucin. Las protenas en solucin forman
uniones de hidrgeno con el agua a travs de sus grupos polares y inicos
expuestos. Cuando se adicionan altas concentraciones de pequeos iones muy
cargados, estos hacen que disminuya la solubilidad de las protenas y precipiten.
Los factores que pueden afectar la concentracin a la cual una protena particular
precipite incluyen el nmero y posicin de los grupos polares, el peso molecular de
la protena, el pH de la solucin y la temperatura a la cual se lleva a cabo el
proceso.

En este mtodo se precipita a la -globulina mediante la adicin de solucin
saturada a temperatura ambiente de sulfato de amonio a tener una concentracin
en la mezcla de 1/3 de saturacin. Esta precipitacin se realiza varias veces. El
sulfato de amonio que queda atrapado en el precipitado se elimina mediante
dilisis contra solucin salina amortiguada con boratos. El producto resultante de
este mtodo no se encuentra totalmente puro, estar contaminado con otras
protenas de alto peso molecular y con protenas que quedan atrapadas en el
precipitado. Por esta razn, la tcnica se usa para concentrar y purificar
parcialmente Acs de todas las fuentes y especies y se recomienda combinarla con
otra como cromatografa de intercambio inico o exclusin molecular, para mayor
eficiencia en la purificacin; es barata, fcil y conveniente para grandes
volmenes.

MATERIAL:
1 Vaso de precipitado de 100 ml
1 Agitador magntico
1 Magneto
1 Pipeta de 10 ml
2 Tubos para centrfuga de plstico de 50 ml
1 Pipeta Pasteur
1 Bulbo.
1 Propipeta.
1 Centrfuga con cabezal para tubos de 50 ml
1 Frasco de 500 mL.
1 Probeta de 100 mL
Bolsa de dilisis.
Hilo camo.



REACTIVOS:
50 ml Plasma o suero humano



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75 ml Sulfato de amonio saturado
NaOH al 2N
BaCl
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al 10%
Solucin de boratos pH 7.8
Papel tronasol pH

TCNICA:
1. En un vaso de precipitado de 100 ml con un magneto, colocar un volumen
medido de plasma o suero humano. Poner en agitacin constante a baja
velocidad, evitando la formacin de espuma.
2. Adicionar gota a gota la cantidad adecuada de solucin saturada de
sulfato de amonio al plasma para tener 1/3 de saturacin de la sal neutra
(para 50 ml de plasma, adicionar 25 ml de solucin saturada de sulfato de
amonio). La adicin debe de ser lenta para evitar que precipiten protenas
indeseables. Al principio el precipitado se redisuelve inmediatamente y no
se debe agregar otra gota hasta que esto haya sucedido, de lo contrario
quedan englobadas en el precipitado otras protenas.
3. Una vez que se ha adicionado todo el sulfato de amonio, ajustar el pH a
7.8 con NaOH 2N. Si se trabaja con volmenes menores de suero, usar
NaOH 0.5 1 N, y si se trabaja con un volumen mayor usar NaOH 4 5
N.
4. Continuar con la agitacin durante 2 a 3 h a temperatura ambiente para
eliminar mecnicamente las protenas que hayan quedado englobadas en
el precipitado de -globulina.
5. Adicionar toda la solucin y precipitado obtenido en una tubo para
centrfuga.
6. Centrifugar durante 30 min a 3000 rpm. Este precipitado contiene toda la
-globulina, pero impurificada con trazas de albmina.
7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido con SSI
hasta tener el volumen inicial de plasma (si se inici con 50 ml de plasma,
aforar el precipitado a 50 ml con SSI).
8. Despus de haber resuspendido la protena, repetir la precipitacin dos
veces ms: para la segunda repetir los pasos 1-7 y para la tercera del 1-6.
En total se debe precipitar la protena 3 veces.
9. Despus de la 3 precipitacin y una vez centrifugado, resuspender el
precipitado con amortiguador salino de boratos en cantidad igual a la
mitad del volumen inicial de plasma (si se inici con 30 ml, se aforar a 15
ml).
10. Eliminar el sulfato de amonio mediante dilisis contra amortiguador salino
de boratos, cambiando esta solucin cada 12 a 24 h y manteniendo a 4 C
durante este proceso.
11. Continuar con el proceso de dilisis hasta que el dializado de negativa la
reaccin para sulfatos, la cual consiste en agregar unas gotas de BaCl
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Ba(OH)
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al 10% a una muestra del dializado, si se forma un precipitado
blanco de BaSO
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la dilisis an no ha terminado.
12. Recuperar la solucin de -globulinas purificadas de la bolsa de dilisis
cuando ya no contenga sulfato de amonio, y pasarla a un tubo de
centrfuga de 50 ml.



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13. Centrifugar en fro (colocar hielo en la camisa de la centrfuga) durante 30
min a 3000 rpm para eliminar partculas insolubles que se forman durante
la dilisis. La solucin final debe presentar slo una ligera opalescencia.
14. Envasar la -globulina purificada en un frasco vial. Para su conservacin
puede filtrarse por Seitz, liofilizarse o adicionarle un conservador como
timerosal a concentracin final de 1:10 000, glicerina a concentracin final
de 50% azida de sodio 1 mg/ml.
15. Etiquetar con los siguientes datos: Nombre del producto, fecha de
obtencin, volumen, conservador empleado y nombre de quien(es)
elaboraron.


CUESTIONARIO.
1. Qu significa Fab, Fc y F(ab)
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, y como se obtienen estas fracciones a
partir de un anticuerpo?
2. Qu mtodos de purificacin de anticuerpos son utilizados a nivel
industrial y por qu y qu mtodos de purificacin de anticuerpos utilizaras
para investigacin y por qu?
3. Por qu se denominan mtodos de purificacin fraccionada a la tcnicas
de precipitacin de anticuerpos por sales neutras o disolventes miscibles?
4. Investiga la concentracin de sulfato de amonio que precipita a la albmina,
al fibringeno y a las gammaglobulinas.
5. Para que sirven y qu significa Sephadex, Sepharosa y Sephacel?
6. Menciona un ejemplo de un intercambiador aninico y un ejemplo de un
intercambiador catinico y cul es el principio de la cromatografa de
intercambio inico.
7. Cul es el principio de la electroforesis?
8. El patrn de corrimiento de las protenas en electroforesis con SDS es el
mismo que el del una cromatografa de exclusin molecular filtracin por
gel?
9. Explica el principio de la ultracentrifugacin y menciona al menos 2
aplicaciones.
10. Haz un diagrama de flujo de los mtodos que utilizaras para obtener
anticuerpos puros que slo reaccionan con albmina srica humana (ASH)
y que sean de clase IgG, a partir de 100 ml de suero de conejo inmunizado
con ASH.

BIBLIOGRAFA.
1. Lubert Stryer. Bioqumica. Tomo I, 4 edicin, 1995.




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