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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POST GRADO


PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS






EFECTO ADYUVANTE DE LAS SAPONINAS DE Sapindus saponaria L. PARA
ANTGENOS DE Leishmania braziliensis EN MSCULO ESTRIADO DE Rattus rattus
var albinus

TESIS
PARA OPTAR EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Autor: M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva

Asesor: Dr. Ramn Piminchumo Carranza

TRUJILLO - PER
2013

i




INDICE
Pgina
INDICE i
RESUMEN ii
SUMMARY iii
I. INTRODUCCIN 1
II. MATERIAL Y MTODOS 37
III. RESULTADOS 40
IV. DISCUSIN 42
V. CONCLUSIONES 48
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 49
VII. ANEXOS 52

NDICE DE ILUSTRACIONES
Figura Anexo 1. Corte de pelo del muslo izquierdo para inyectar 53
Figura Anexo 2. Inyeccin en el msculo del muslo izquierdo 53
Figura Anexo 3. Grupo testigo T. Recibi Solucin Salina Fisiolgica 54
Figura Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibi Asociacin Saponinas
Antgenos de L. Braziliensis 54
Figura Anexo 5. Obtencin de Sangre Perifrica (colas) 55


ii

Resumen
Se llev a cabo un estudio comparativo en Rattus rattus var. Albinus para investigar el efecto
coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. (sapindussaponina) para los
antgenos de Leishmania braziliensis. Con tal finalidad se inyect va intramuscular (IM) a 4
grupos de cinco ratas machos cada uno, en el msculo del muslo izquierdo solucin salina
fisiolgica, antgenos de Leishmania braziliensis, sapindussaponina, y la asociacin
sapindussaponina - antgenos de Leishmania braziliensis correspondientemente. Para evaluar
los cambios en la frmula leucocitaria, a las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre
perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepararon los frotis y se realiz el
conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin. Los resultados
porcentuales fueron sometidos al anlisis de varianza ANOVA de un factor con la prueba post
hoc t de Dunnett. Se concluye que la inyeccin de sapindussaponina y sapindussaponina -
antgenos de Leishmania braziliensis provoca cambios en la frmula leucocitaria; y que las
variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos
indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas fracciones antignicas
de Leishmania braziliensis.

Palabras clave: Sapindussaponina, antgenos de Leishmania braziliensis, inyeccin
intramuscular, respuesta celular.


ii

Summary

They conducted a comparative study in Rattus rattus var. Albinus to investigate the adjuvant
effect of Sapindus saponaria L. saponins (sapindussaponin) for Leishmania braziliensis
antigen. For this purpose was injected intramuscularly (IM) to 4 groups of five male rats each
in left thigh muscle physiological saline, Leishmania braziliensis antigen, sapindussaponin
and the association sapindussaponin - Leishmania braziliensis antigen correspondingly. To
assess changes in the leukocyte, 48 and 192 hours, peripheral blood samples (tail) of the
specimens of each group. Smears were prepared and performed the white blood cell count
with microscope immersion lens. The percentage results were subjected to analysis of
variance one-way ANOVA with post hoc Dunnett t. We conclude that injection of
sapindussaponin and sapindussaponin - Leishmania braziliensis antigen causes changes in
the leukocyte, and that variations in percentage of leukocytes: neutrophils, eosinophils,
lymphocytes and monocytes indicate the cellular response to the saponins and the association
saponins - fractions antigenic Leishmania braziliensis.

Keywords: Sapindussaponin, Leishmania braziliensis antigens, intramuscular injection,
cellular response.


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I. INTRODUCCION
El hombre siempre ha estado interesado por conocer la naturaleza y aprovecharla para la
solucin de diferentes problemas (Boege, n.d.) tales como la necesidad de a) alimentacin
para una poblacin humana cada da mayor, b) nuevos medicamentos para las
enfermedades que en la actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas
industriales; motivo por el cual, se ha empeado en investigar cientficamente las
sustancias presentes en los seres vivos que le rodean, tanto plantas (Fitoqumica) como
animales (Zooqumica).
ADYUVANTES VACUNALES: ESTADO ACTUAL Y NUEVAS TENDENCIAS
Aguilar J. y Leal M. (1999) presentaron un trabajo de revisin sobre el estado de
desarrollo y los principales resultados obtenidos con los adyuvantes; ellos exponen que:
La meta principal de la vacunacin contra enfermedades infecciosas, es el
establecimiento de una resistencia de larga duracin contra la infeccin luego de una o
pocas inmunizaciones. En el caso de las vacunas vivas atenuadas como las que se
emplean contra la varicela y la poliomielitis, esta meta se ha alcanzado con xito,
mientras que las vacunas que contienen microorganismos inactivados o sus subunidades
son menos inmunognicas y, con frecuencia, se administran con un adyuvante.
Los adyuvantes son sustancias o procedimientos que aceleran, prolongan o potencian la
respuesta inmune especfica contra los antgenos inoculados. La palabra adyuvante
proviene del latn adjuvare, que significa ayudar, asistir.
Los adyuvantes inmunolgicos se comenzaron a desarrollar a partir de la segunda
dcada del siglo xx, cuando Ramon y colaboradores observaron que los caballos que
desarrollaban abscesos en el sitio de inyeccin del toxoide diftrico, generaban mayores

2

ttulos de anticuerpos especficos que aquellos que no los tenan. Posteriormente, se
report que los abscesos generados por la inyeccin de sustancias extraas junto con el
toxoide, aumentaban la respuesta antitoxina en caballos.
En 1926, Glenny demostr la actividad adyuvante de los compuestos de aluminio
mediante el uso de una vacuna de toxoide diftrico precipitado en almina. En la
actualidad, los adyuvantes de aluminio (fosfato e hidrxido de aluminio) continan
siendo los adyuvantes inmunolgicos ms ampliamente usados y los nicos presentes en
las vacunas licenciadas en los Estados Unidos.
En 1936, Freund desarroll una emulsin de agua en aceite mineral que contiene
micobacterias muertas, lo que actualmente se conoce como adyuvante completo de
Freund (ACF). El ACF es uno de los adyuvantes ms poderosos, pero es muy
reactognico para ser usado con fines clnicos. Aun as, el adyuvante incompleto de
Freund (AIF) la emulsin sin la adicin de la micobacteria muerta ha sido
empleado en formulaciones vacunales en humanos.
En 1956, Johnson demostr la actividad adyuvante de la endotoxina lipopolisacardica
(LPS) proveniente de una bacteria gramnegativa. Estos estudios son la base del uso
actual del LPS detoxificado o de sus componentes como candidatos de adyuvantes para
uso en humanos.
En 1974, Lederer y colaboradores identificaron el muramildipptido (MDP) como un
componente con actividad adyuvante de la micobacteria presente en el ACF. Ms
recientemente, otros compuestos de origen bacteriano han sido identificados y
caracterizados, y se ha comprobado su funcin inmunomoduladora e
inmunopotenciadora como parte del ACF.

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Se conoce que cientos de compuestos naturales y sintticos poseen actividad adyuvante.
Estos adyuvantes, que pueden ser usados para adicionar o reemplazar a la almina en
vacunas humanas, han estado en desarrollo y evaluacin preclnica durante dcadas.
Varios de ellos han demostrado ser ms efectivos que la almina y potencian respuestas
inmunes mediadas por anticuerpos, as como respuestas celulares intensas.
En la actualidad, se consolidan estrategias ms racionales en el diseo de vacunas. stas
requieren la identificacin de eptopos apropiados y el desarrollo de formulaciones que
permitan generar una respuesta inmune protectora con esos eptopos. La funcin de los
adyuvantes inmunolgicos en el diseo racional de vacunas, es dirigir y optimizar
respuestas inmunes apropiadas hacia eptopos vacunales protectores ().
Adyuvantes vacunales
Ventajas de su uso
Entre las ventajas del uso de adyuvantes se hallan: (i) su capacidad de potenciar la
inmunogenicidad de antgenos con un grado de pureza elevado o recombinantes; (ii) la
reduccin de la cantidad de antgeno y del nmero de reinmunizaciones requeridas para
proveer una inmunidad protectora; (iii) el aumento de la eficacia de las vacunas en los
recin nacidos, los ancianos y las personas inmunocomprometidas, y (iv) permitir el
envo mucosal de vacunas dirigidas a incrementar la respuesta inmune a nivel de
mucosas.
A diferencia de la presentacin del antgeno en su entorno microbiano natural, el uso de
adyuvantes permite una forma menos txica y ms segura de inoculacin. Su utilizacin
desborda el universo de las vacunas preventivas y se introduce en las formulaciones
vacunales con objetivos teraputicos.

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Seleccin
Entre los factores involucrados en la seleccin de un adyuvante se encuentran: el tipo de
respuesta deseada o que se quiere evitar, la especie vacunada, la ruta de administracin
y los efectos colaterales inducidos por el adyuvante.
La disponibilidad clnica de adyuvantes adecuados, seguros y efectivos es decisiva en el
desarrollo de las nuevas vacunas. De forma ideal, los adyuvantes deben ser materiales
baratos, no txicos y poco inmunognicos. Adems, deben ser estables, biodegradables
y, preferiblemente, deben promover inmunidad tanto humoral como mediada por
clulas, en dependencia del requerimiento de proteccin del patgeno.
La generacin de una respuesta inmune protectora a nivel de mucosas, es de gran inters
para quienes estudian las enfermedades que afectan las mucosas o que tienen en ellas su
puerta de entrada. Existen diferencias en la efectividad de los adyuvantes por las
diferentes rutas, debido a que las vas mucosales tienen caractersticas fisiolgicas que
las diferencian entre s y de las rutas sistmicas. De ah que el desarrollo de vectores,
sistemas de envo de antgenos y otros compuestos con actividad adyuvante tiene en
cuenta las caractersticas de la ruta por la cual ha de ser inoculado.
Seguridad
Los beneficios de la incorporacin de adyuvantes en formulaciones vacunales para
potenciar su inmunogenicidad, deben ser sopesados con el riesgo de reacciones adversas
que estos compuestos pueden inducir.
El marcado efecto inmunopotenciador de la mayora de los adyuvantes est relacionado
directamente con su toxicidad. La introduccin de adyuvantes potentes en los ensayos

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clnicos, comenz en relacin con las vacunas preventivas y teraputicas en las que los
adyuvantes de aluminio son inefectivos. Uno de los objetivos del desarrollo actual en
materia de adyuvantes, consiste en disminuir al mximo su toxicidad sin afectar el
efecto inmunopotenciador.
Las regulaciones establecidas para el uso de los adyuvantes novedosos en humanos son
rigurosas, comparado con las que se aplican para las vacunas veterinarias. Los animales
afectivos son diferenciados de los dems.
Las reacciones adversas asociadas a los adyuvantes se clasifican en locales y sistmicas.
Las reacciones adversas locales incluyen dolor, inflamacin local, necrosis en el sitio de
la inyeccin o en zonas adyacentes, linfadenopatas regionales y, en raras ocasiones, la
induccin de granulomas y la formacin de abscesos estriles. Las reacciones sistmicas
observadas incluyen nuseas, fiebre, artritis por adyuvante y uvetis, anafilaxis,
toxicidad especfica de rgano e inmunotoxicidad, como por ejemplo, liberacin de
citocinas, inmunosupresin y enfermedades autoinmunes.
La evaluacin toxicolgica sistemtica, como la requerida para productos
farmacuticos, no es rutinaria en el caso de vacunas que tienen compuestos de aluminio
como adyuvante. Aunque el uso de estos compuestos ha sido asociado con algunas
reacciones locales, la vasta experiencia con este tipo de adyuvantes en vacunas indica
que la observacin del animal posinyeccin y del sitio de inyeccin es generalmente
adecuada desde un punto de vista de la seguridad preclnica, sin la necesidad de una
toxicologa formal, a menos que exista algn problema especial con el antgeno. A
diferencia de los compuestos de aluminio, muchos de los adyuvantes en investigacin
deben ser objeto de un estudio toxicolgico ms intensivo. Para algunos adyuvantes,

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existen datos histricos que constituyen pruebas de seguridad adicionales previas a la
evaluacin de la formulacin antgeno-adyuvante en humanos.
Como parte de la evaluacin inicial, se deben realizar estudios preclnicos con el
adyuvante por separado, como los estudios toxicolgicos de dosis nicas y repetidas,
incluida la ruta de inoculacin que se pretende para el uso clnico. Usualmente, se
dispone de informacin sobre estudios toxicolgicos con el adyuvante solo, incluso en
ms de una especie, realizados por los fabricantes del adyuvante. Adems de los
estudios preclnicos realizados con el adyuvante solo, el producto combinado antgeno-
adyuvante debe ser caracterizado en un estudio de seguridad que cuente con buenas
prcticas de laboratorio y obtenga datos relevantes, como mnimo, para apoyar la
iniciacin de los estudios de fase I en humanos.
Esta evaluacin debe ser conducida en una especie animal pequea en que el antgeno
sea inmunognico, y que pueda ser inmunizada por la misma ruta anticipada para uso en
humanos. La dosis o frecuencia de inmunizaciones con el candidato vacunal, debe ser
igual o mayor que aquellas que van a ensayo clnico en cuanto a cantidad, y similar en
cuanto a frecuencia e intervalos. Lo expuesto anteriormente es un mandato de la
Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA, por sus siglas en ingls) de los Estados
Unidos, con el objetivo de ofrecer la mejor oportunidad para identificar problemas
potenciales de seguridad.
Los puntos de mayor inters para avalar la seguridad, donde no se incluyen todos los
aspectos de rutina de un estudio toxicolgico, se muestran en la Tabla. Hay que destacar
que los estudios preclnicos pueden ser usados para seleccionar dosis apropiadas e
identificar situaciones donde se deben garantizar con cuidado rangos de dosis para los

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estudios de fase I. Adems, estos estudios pueden avalar nuevas dosis y esquemas, o
detectar situaciones especiales durante el desarrollo del producto.
Tabla. Puntos de mayor inters en los anlisis de seguridad preclnica de un adyuvante.
Valores
de laboratorio
Panel de ensayos sricos pre y posvacunacin. Pruebas de
funcionamiento heptico y renal, creatina-kinasa
y hematologa (conteo completo de clulas de la sangre). La
inmunogenicidad se puede determinar para correlacionarla
con otros hallazgos, aunque no sea definitoria.
Observaciones
Observacin del sitio de la inyeccin anterior y durante tres
das despus de cada inyeccin. Observacin
del funcionamiento del miembro vacunado durante tres das al
menos.
Patologa
Evaluacin por cuantificacin de las reacciones inflamatorias.
Adems, se debe realizar una necropsia completa con
descripcin de los rganos, peso e histopatologa si se
considera necesario para un estudio
en particular. Considerar los datos disponibles en la
literatura.*
Otros
Evaluacin especial de ciertos parmetros especficos del
producto o clase, por ejemplo, anlisis de induccin de uvetis
si fuese aplicable. Los estudios preclnicos pueden ser
usados para la seleccin de rangos de dosis o para resolver
problemas de desarrollo del producto.
*Si se dispone en la literatura de datos clnicos favorables y de un estudio toxicolgico bien
fundamentado con el mismo adyuvante solo o combinado con otros antgenos, y si el antgeno en
cuestin no posee ningn riesgo adicional, es menos crtica la necesidad de un estudio toxicolgico
preclnico que incluya la necropsia completa antes de la fase I. En el desarrollo clnico inicial del
producto, se recomienda la inclusin de grupos controles con el antgeno solo y/o adyuvado con almina.
Ya se han evaluado diversos adyuvantes en humanos, tanto en voluntarios sanos como
enfermos. Estos adyuvantes se han relacionado con el desarrollo de vacunas, tanto
preventivas como teraputicas, contra diferentes enfermedades y microorganismos. Una
informacin ms detallada acerca de la toxicidad de los distintos adyuvantes, se puede

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encontrar ms adelante junto a la descripcin de los tipos de adyuvantes y sus
mecanismos de accin.
Clasificacin
Los adyuvantes inmunolgicos pueden ser clasificados atendiendo a su fuente de
origen, mecanismos de accin y propiedades fsicoqumicas.
(), los adyuvantes pueden ser separados en tres clases amplias: (i)
inmunoestimulantes activos, que son agentes que aumentan la respuesta inmune
especfica contra el antgeno; (ii) portadores, que son protenas inmunognicas que
proporcionan ayuda de clulas T; y (iii) adyuvantes tipo vehculo, como las emulsiones
oleosas y los liposomas, que sirven como matriz para el antgeno y para la
inmunoestimulacin. Esta clasificacin tiende a confundir por la propia forma en que se
dividen.
Tambin se han dividido en adyuvantes mucosales y sistmicos, teniendo en cuenta que
las caractersticas fisiolgicas en cuanto a la toma y procesamiento del antgeno para
ambas vas de inoculacin generan procederes diferentes de adyuvacin.
Otra clasificacin aceptada los divide en: sales de aluminio y otros adyuvantes
minerales; agentes tensoactivos; derivados de bacterias; vehculos y materiales de
liberacin lenta, y citocinas.
Una clasificacin reciente de los adyuvantes considera su separacin en los grupos
siguientes: adyuvantes de tipo gel, agentes tensoactivos, productos bacterianos,
productos basados en aceites y emulsiones, adyuvantes particulados, protenas de fusin
y lipopptidos. De acuerdo con la definicin general de adyuvantes, a esta lista se

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pudieran adicionar los inmunomoduladores e inmunoestimulantes como las citocinas y
otros compuestos naturales que activan el sistema inmune innato y que no estn
incluidos en ninguno de los grupos destacados.
Limitaciones
A pesar del progreso actual en la definicin y comprensin de la naturaleza y
mecanismos de accin de los adyuvantes, an existen limitaciones con respecto a su
uso.
Entre las limitaciones ms frecuentes se encuentran su grado de toxicidad,
pirogenicidad, estabilidad, degradacin in vivo y rpida excrecin. Se han encontrado
restricciones de tamao, carga e hidrofobicidad en la incorporacin de protenas y
pptidos. Adems, se conoce que ocurren modificaciones epitpicas durante la
formulacin o conjugacin. En el caso de las protenas transportadoras, una inmunidad
preexistente contra ellas es una limitante para su uso repetido y eficiente. An est por
demostrar para muchos adyuvantes si estos problemas se pueden superar.
Cada adyuvante posee un perfil de respuesta inmunolgica caracterstico. La
ineficiencia de los adyuvantes de aluminio para inducir ciertos isotipos y subclases, as
como su incapacidad para generar clulas T citotxicas y proveer una buena respuesta
inmune contra antgenos polisacardicos u otros antgenos T-independientes, limita su
aplicabilidad, especialmente en aquellos casos donde estas caractersticas sean un
requisito indispensable para una buena proteccin.
Principales tipos de adyuvantes y sus mecanismos de accin

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De acuerdo con las clasificaciones existentes sobre adyuvantes, a continuacin se
expone una descripcin de las caractersticas fsicoqumicas e inmunolgicas de los
principales grupos de adyuvantes, y al mismo tiempo se describen sus mecanismos de
accin.
Adyuvantes de uso sistmico
Adyuvantes de tipo gel. () las sales de aluminio principalmente aquellas de fosfato
o hidrxido han sido ampliamente utilizadas para inmunizar humanos y animales.
Estos compuestos son los nicos adyuvantes de aprobacin general para su uso clnico.
Los compuestos basados en aluminio, a pesar de ser considerados seguros, son
adyuvantes dbiles y muy poco consistentes en su capacidad de estimular respuestas
inmunes mediadas por clulas, especialmente respuestas de clulas T citotxicas.
Los primeros estudios acerca del modo de accin de los adyuvantes de aluminio,
evidenciaron la formacin de un depsito en el sitio de la inyeccin, donde el antgeno
es liberado lentamente. Investigaciones ms recientes sugieren que el antgeno soluble
atrapado en el gel permite prolongar el tiempo de interaccin entre l, las clulas
presentadoras de antgenos (CPA) y los linfocitos. El mecanismo de adyuvacin
tambin abarca la estimulacin de clulas inmunocompetentes a travs de la activacin
del complemento, la induccin de eosinofilia en el sitio de inyeccin, la activacin de
macrfagos y la toma eficiente de partculas de antgeno por las CPA dada su
naturaleza particulada y su tamao inferior a 10 mm.
Aunque los efectos colaterales son relativamente pocos, se han observado mucho ms
granulomas en el sitio de inyeccin por va subcutnea o intradrmica que por la ruta
intramuscular.

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Entre otras limitaciones se encuentran: la generacin de reacciones locales, la
produccin de anticuerpos de tipo IgE y la inefectividad para algunos antgenos.
Tambin hay reportes de la neurotoxicidad del aluminio y se plantea que pudiera
desempear algn papel en la enfermedad de Alzheimer y el sndrome de encefalopata
asociado a dilisis. Se conoce, adems, que la almina no es biodegradable y se detecta
en el sitio de la inoculacin al ao de haber sido inyectada.
En vacunas para uso en humanos, los adyuvantes de aluminio fueron usados
inicialmente contra ttanos, difteria, pertusis y poliomielitis. Aunque algunos
componentes de Bordetella pertussis pueden ocasionar efectos colaterales, se ha
demostrado una reduccin significativa de dichos efectos con la adsorcin a adyuvantes
de aluminio.
En vacunas veterinarias, estos adyuvantes han sido utilizados ampliamente contra
agentes virales y bacterianos, as como en vacunas antiparasitarias. Existen algunas
similitudes entre la respuesta inmune estimulacin de IgE y eosinofilia inducida
por algunos helmintos y la provocada al inmunizar con adyuvantes de aluminio. Dichas
similitudes hacen que estos adyuvantes sean candidatos interesantes para vacunas
antiparasitarias.
Las sales de otros metales como el calcio, el hierro y el circonio, tambin han sido
utilizadas para adsorber antgenos, pero no han tenido el amplio uso de las sales de
aluminio. No obstante, el fosfato de calcio ha sido empleado durante dcadas para las
vacunas del grupo de difteria-ttanos-pertusis. Aunque tiene propiedades similares a las
de los compuestos de aluminio, esta sal presenta varias ventajas potenciales sobre ellos
como: es un constituyente normal del cuerpo y, como tal, es bien tolerado; adsorbe
eficientemente a los antgenos y permite su liberacin lenta; genera niveles elevados de

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anticuerpos IgG; y no incrementa la produccin de IgE. En varias pruebas se ha
encontrado que el uso de vacunas adyuvadas con calcio es eficiente y seguro contra
reacciones adversas a largo plazo que slo pueden ser reconocidas despus de muchos
aos. Vale la pena destacar que se han observado reacciones neurolgicas espordicas
en el caso de vacunas de pertusis adsorbidas a fosfato de calcio, y que algunos
componentes de B. pertussis tienen propiedades inmunomoduladoras que contribuyen al
efecto adyuvante de la preparacin vacunal.
Agentes tensoactivos. La saponina Quil A extracto acuoso de la corteza de Quillaja
saponaria Molina, y fracciones purificadas de sta principalmente QS-21,
constituyen alternativas a la almina con potencial para inducir respuestas celulares
intensas.
Las saponinas son glicsidos tensoactivos que contienen un ncleo hidrofbico de
estructura triterpenoide, y cadenas de carbohidratos enlazadas al triterpeno que
conforman regiones hidroflicas. Entre las propiedades asociadas a las saponinas de Q.
saponaria Molina, se incluyen: un excelente efecto adyuvante para antgenos tanto T-
dependientes como T-independientes, y la estimulacin de isotipos asociados a
respuestas de clulas T auxiliadoras de tipo 1 (Th1). Esta clase de adyuvantes induce,
adems, respuestas de linfocitos T citotxicos (-CTL) CD8+, propiedad asociada
usualmente con vectores virales. Las saponinas tambin potencian vacunas
administradas por las vas mucosales.
La saponina Quil A ha sido empleada en varias vacunas veterinarias. Es un producto
heterogneo compuesto por 23 picos diferentes de saponinas detectables por
cromatografa lquida de alta presin, que se une al colesterol de la membrana de los
eritrocitos y los rompe provocando efectos colaterales indeseables.

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Estudios clnicos preliminares han demostrado la viabilidad, con un patrn toxicolgico
aceptable, de usar la saponina QS-21 en vacunas humanas, como alternativa a los
adyuvantes tradicionales de aluminio.
Derivados de bacterias. Las estructuras bacterianas constituyen la principal fuente de
inmunoadyuvantes. Incluso, se conoce que copias sintticas de bajo peso molecular
como el pptidoglicano de la pared celular o el lpido A de bacterias gramnegativas, son
capaces de alterar el sistema inmune sin ser ellas mismas inmunognicas. Esto se puede
deber a que imitan las estructuras microbianas que proporcionan la seal de peligro para
el inicio de las defensas del hospedero. () la base para el efecto adyuvante podra ser
el reconocimiento de componentes microbianos definidos por receptores presentes en
las clulas accesorias. Este reconocimiento induce a dichas clulas a producir citocinas
que determinan la activacin de las subpoblaciones de linfocitos Th1 o Th2. Las
estructuras microbianas conservadas tambin pueden inducir la activacin directa de
clulas B o macrfagos que expresan una potente actividad coestimulatoria de la
expansin clonal de las clulas T CD4+.
Entre las bacterias usadas como adyuvantes se incluyen: Mycobacterium spp.,
Corynebacterium parvum o C. granulosum, y B. pertussis. Lamentablemente, estos
microorganismos o sus productos son considerados muy txicos para ser usados como
adyuvantes en humanos. Se ha trabajado mucho en la purificacin de los componentes
activos de Mycobacterium spp., B. pertussis y C. granulosum. En la actualidad, se
presta atencin a la purificacin de los componentes con poder adyuvante presentes en
la micobacteria.
El poder adyuvante del N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutamina o el muramildipptido
(MDP) el componente con actividad inmunopotenciadora ms estudiado del ACF

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depende de la forma en que se administre. En solucin salina aumenta principalmente la
inmunidad humoral contra un nmero de antgenos naturales y sintticos de bacterias,
virus y parsitos, mientras que incorporado a liposomas o mezclado con micolato de
glicerol induce inmunidad mediada por clulas. Se ha demostrado que el MDP activa
varios tipos celulares (macrfagos, leucocitos polimorfonucleares, mastocitos,
plaquetas, clulas endoteliales y fibroblastos, entre otros) e induce la secrecin de una
variedad de citocinas, incluidos la interleuquina 1 (IL-1), el factor de crecimiento de
clulas B y el factor de activacin de fibroblastos. El MDP provoca, adems, un
incremento en la produccin de superxidos, prostaglandinas y colagenasa. Se han
obtenido algunos derivados del MDP para retener el poder adyuvante con un mnimo de
toxicidad. De ellos, uno de los ms prometedores es el treonil-MDP, un adyuvante
potente y apirognico.
Los LPS y sus derivados son componentes de la pared celular de bacterias
gramnegativas. Sus derivados son compuestos mitognicos para las clulas B, estimulan
a las clulas T para que produzcan interfern gamma (IFN-g) y median las respuestas de
hipersensibilidad tarda (DTH, segn sus siglas en ingls). La estructura de estos
compuestos consiste en un polisacrido hidroflico unido a una porcin hidrofbica de
naturaleza lipdica: el lpido A, que es el responsable de la toxicidad y el efecto
adyuvante de los LPS. Por hidrlisis del lpido A en condiciones de mediana acidez, se
puede obtener el lpido A monofosforilado, compuesto que retiene la actividad
adyuvante pero muestra una menor letalidad y pirogenicidad que el lpido A.
Otros compuestos derivados de bacterias son los dimicolatos de trehalosa (TDM, por
sus siglas en ingls). Procedentes de la pared celular, son insolubles en agua, de
naturaleza anfiptica, y capaces de potenciar la actividad presentadora de antgenos por

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mediacin de respuestas DTH, y un incremento en los ttulos de anticuerpos especficos
contra el antgeno coinoculado.
(), se demostr el efecto adyuvante del ADN micobacteriano compuesto presente
en el lisado de micobacterias mezclado con aceite de parafina que Freund ensay hace
60 aos. Se demostr que la actividad adyuvante estaba relacionada a la existencia de
motivos CpG en el ADN presente en las bacterias. Este efecto inmunoestimulatorio slo
era desarrollado por el ADN bacteriano y no por el de vertebrados, hecho que se
relacion con la baja metilacin de aqul. En los ltimos aos, se ha incrementado la
cantidad de datos referidos al efecto inmunoestimulatorio del ADN bacteriano y de los
oligodesoxinucletidos que contienen dichas secuencias inmunoestimuladoras. Ambos
han demostrado que pueden inducir la proliferacin de clulas B y la produccin de
inmunoglobulinas. Adems, estimulan la secrecin de IL-6, IFN-g, IL-12 e IL-18, que a
su vez induce la produccin de IFN-g por las clulas asesinas profesionales (NK, por
sus siglas en ingls).
Se ha reportado que los oligodesoxinucletidos sintticos que contienen motivos CpG
en los que se ha introducido un tomo de azufre en el enlace fosfodister, muestran una
actividad inmunoestimulatoria mucho mayor que los naturales.
Vehculos y materiales de liberacin lenta.
Emulsiones
Se encuentran en esta categora las emulsiones de aceite como el AIF, Montanide,
Adyuvante 65 y Lipovant. El mecanismo de accin del AIF se atribuye a la formacin
de un depsito en el sitio de inyeccin que posibilita la liberacin lenta del antgeno,
con lo que se estimulan las clulas productoras de anticuerpos. Este adyuvante no se

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emplea actualmente en humanos debido a que ocasiona reacciones locales colaterales
como la formacin de granulomas e inflamacin local. Se han evaluado varios tipos de
emulsiones con diferentes tipos de aceite, con el propsito de encontrar un adyuvante
mejor, estable y no txico. Una alternativa es el Adyuvante 65, que, a diferencia del
aceite mineral del ACF y el AIF, tiene un componente aceitoso que es metabolizado por
el organismo y ha demostrado ser seguro y potente en humanos. Tambin se han
probado emulsiones diferentes como aceite en agua y agua en aceite. Esta ltima es tan
potente como el AIF, menos viscosa, ms estable, fcil de administrar, y produce menos
ndulos en el sitio de inyeccin.
La familia de adyuvantes oleosos conocida como Montanide, ha probado ser potente en
numerosas vacunas experimentales en ratones, ratas, gatos, perros y cerdos, tanto con
pptidos sintticos como con antgenos virales. Se han conducido algunos estudios
preliminares con Montanide ISA 720, con la finalidad de disear vacunas en humanos
contra el VIH y la malaria.
Liposomas
Los liposomas son glbulos sintticos formados por capas de lpidos que encapsulan las
sustancias teraputicas, y constituyen uno de los vehculos ms utilizados para las
investigaciones en vacunas. Ya se ha descrito su uso en formulaciones vacunales
complejas como vehculo de otros adyuvantes e inmunomoduladores (vea los
subacpites Formulaciones adyuvantes, Derivados de bacterias y Sistemas sintticos o
inactivados de envo de antgenos). Su adyuvanticidad depende del nmero de capas, la
carga, la composicin y el mtodo de preparacin. Su uso potencia tanto la inmunidad
humoral como la mediada por clulas para antgenos de naturaleza proteca y
polisacardica. El tiempo de vida medio de los antgenos incorporados en liposomas en

17

la sangre es notablemente prolongado, lo que asegura una mayor exposicin de antgeno
a las CPA luego de su inyeccin.
Microesferas copolimricas
Entre la multitud de sistemas particulados y polimricos que se han desarrollado, el de
las microesferas copolimricas de cido lctico y gliclico (DL-PLG) es uno de los que
ms se destaca. Estas microesferas son partculas biocompatibles y biodegradables
capaces de incorporar en su seno diferentes antgenos, entre ellos protenas. Con el
empleo de por cientos adecuados de sus componentes, es posible controlar el tiempo de
liberacin de los antgenos atrapados. Su uso abarca tanto rutas sistmicas como
mucosales.
Citocinas. Como regla general, en las clasificaciones ms recientes de adyuvantes se
incluyen las citocinas. El IFN-g es una citocina pleiotrpica que puede potenciar
respuestas inmunes mediadas por clulas T a travs de la regulacin positiva de la
expresin de los determinantes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC,
por sus siglas en ingls). Esta citocina incrementa la liberacin de IL-1 y la expresin
del MHC clase II en la superficie de las CPA, propiedades que pueden explicar su
actividad adyuvante.
El factor estimulante de la formacin de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-
CSF, por sus siglas en ingls), potencia respuestas inmunes primarias mediante la
activacin o reclutamiento de CPA profesionales. Sin embargo, la aplicacin prctica de
las citocinas como adyuvantes presenta varias dificultades, ya que es posible que se
requieran mltiples dosis, y si se usa una citocina de una especie diferente, sta puede
ser inmunognica en la especie "blanco".

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Carbohidratos como adyuvantes. Muchos carbohidratos complejos de origen natural
estimulan las clulas de los sistemas inmune y reticuloendotelial. Entre ellos se
encuentran los polmeros de plantas y hongos como los glucanos, las dextranas y los
lentinanos todos ellos polmeros de glucosa, y los mananos, entre los que se
encuentran los glucomananos y los galactomananos. Los levanos y los xilanos tambin
han evidenciado actividad potenciadora. La actividad de muchos de estos poliglicanos
sobre los macrfagos que tienen receptores de glucanos y mananos, incluye la
induccin de fagocitosis y la secrecin de citocinas, leucotrienos y prostaglandinas. El
lentinano, glucano comn de las setas, estimula la respuesta celular y de anticuerpos
contra eritrocitos de carnero, aumenta la resistencia del husped a varios tipos de
infecciones bacterianas, virales y parasticas, y ha restaurado la disfuncin
inmunolgica en pacientes con neoplasias.
Distintas pruebas in vitro indican que los mananos activan los monocitos y los
macrfagos, con lo que inducen la produccin de IFN-g, factor de necrosis tumoral-a,
factor estimulante de la formacin de colonias de monocitos y granulocitos, IL-1b e IL-
6. El acemanano es un polisacrido compuesto mayoritariamente por manosas con O-
acetilaciones en aproximadamente 8 de cada 10 residuos. Se extrae como componente
mayoritario de la sustancia mucilaginosa o gel de la hoja de Aloe barbadensis Miller,
planta medicinal usada desde la antigedad. Este polisacrido potencia la generacin de
linfocitos CTL, la actividad citotxica de clulas NK y tambin, modestamente, la
alorrespuesta humana in vitro.
Recientemente, se ha demostrado la actividad adyuvante del acemanano sobre el
antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) por va mucosal, al generarse
no slo niveles de anticuerpos en suero de similar intensidad que los obtenidos con

19

almina como adyuvante, sino con la induccin de adems respuestas intensas de IgA
secretoria en mucosas adyacentes y remotas, lo cual no ocurre en las vacunas inoculadas
por va parenteral. Estos resultados, as como la reconocida inocuidad del acemanano,
avalan al ensayo clnico de una formulacin nasal del HBsAg mezclado con el
acemanano por va intranasal, ().
Formulaciones adyuvantes. Las formulaciones adyuvantes han surgido como resultado
del desarrollo en el conocimiento de los mecanismos de accin de estos compuestos. En
ellas se combinan varios adyuvantes que, por lo general, poseen diferentes mecanismos
de accin, con el propsito de aumentar la potencia y la calidad de la respuesta inmune
contra los antgenos de inters.
Entre las formulaciones adyuvantes que tienen como base los compuestos de aluminio,
Cooper y colaboradores han combinado el hidrxido de aluminio con g-inulina
polisacrido procedente de algas en un nuevo adyuvante denominado algamulina.
Diversos antgenos comerciales han sido potenciados por la algamulina, entre los que se
encuentran los toxoides diftrico y tetnico, el virus sincitial respiratorio, la protena E7
del papilomavirus humano, la glicoprotena D del virus herpes tipo 2, el HBsAg, el
virus completo de la influenza, Haemophilus influenzae, el conjugado peptdico del
antgeno 2 de superficie de merozotos de Plasmodium falciparum, el extracto de
esperma de ratn (vacuna anticonceptiva), y membranas de micoplasma porcino.
Las saponinas tambin han sido utilizadas como parte de formulaciones adyuvantes en
los complejos inmunoestimulantes (ISCOM, por sus siglas en ingls), y se ha
demostrado la eficacia de combinaciones de aqullas con microesferas, liposomas e
hidrxido de aluminio.

20

Los ISCOM son partculas relativamente estables de 30-40 nm de dimetro y estructura
dodecahdrica, compuestos por Quil A, lpidos y antgenos anfipticos. Se disearon
para combinar la presentacin fsica ptima, desde el punto de vista inmunognico, de
los antgenos en una forma multimrica particulada submicroscpica con un adyuvante
incorporado. Una amplia variedad de protenas de parsitos, bacterias y virus han sido
formuladas en ISCOM. Tambin se han unido protenas no anfipticas y pptidos
mediante enlaces covalentes, lo que ha generado una respuesta intensa de anticuerpos
contra estos antgenos que son poco inmunognicos en solucin. Estas estructuras han
posibilitado una presentacin ptima del antgeno con retencin de la actividad
adyuvante y una disminucin de los efectos colaterales de Quil A. Los ISCOM han sido
utilizados en modelos animales y han inducido inmunidad, tanto sistmica como local,
cuando se administran por las vas oral, respiratoria y vaginal.
En todos los casos evaluados, los antgenos formulados en ISCOM muestran un
incremento en la respuesta de anticuerpos y en la respuesta mediada por clulas, en
comparacin con los antgenos no incorporados. En experimentos de reto antignico, las
inmunizaciones con ISCOM han protegido varias especies contra numerosos virus
envueltos, incluidos los retrovirus, las bacterias y los parsitos. Se ha reportado que los
ISCOM modulan la expresin de molculas del MHC clase II y podran actuar
induciendo la liberacin de IFN-g. Tambin se ha establecido que son capaces de
estimular las clulas T CD8+ restringidas a molculas del MHC clase I.
Otro ejemplo de formulacin es el ACF, mezcla de agua, aceite y micobacterias muertas
capaz de generar uno de los mayores efectos inmunopotenciadores. Sin embargo, su uso
est restringido al trabajo de laboratorio por su toxicidad.

21

Se ha demostrado que las formulaciones de vehculos como los liposomas, a los que se
les adiciona o incorpora los MDP o monofosforil lpido A (MPL, segn las siglas en
ingls), pueden incrementar la respuesta inmune especfica, tanto por vas mucosales
como parenterales.
Adyuvantes mucosales
El desarrollo de los adyuvantes para uso mucosal constituye actualmente una necesidad
en el campo de las vacunas. El progreso en el conocimiento de la fisiologa de las
mucosas y del modo de accin de los adyuvantes, puede ayudar en el desarrollo de
vacunas mucosales ms efectivas. Aunque los adyuvantes mucosales se pueden
clasificar dentro de los grupos anteriormente expuestos, en nuestra opinin merecen ser
considerados de forma independiente. La actividad inmunopotenciadora del adyuvante o
sistema de envo de antgenos a mucosas, debe tener en cuenta, en primer lugar, la
penetracin de los antgenos por esa va y posteriormente, la potenciacin de la
inmunogenicidad de los antgenos por diferentes mecanismos que pudieran ser similares
o no a los sistmicos. Se han obtenido resultados diferentes cuando se usa un mismo
adyuvante, tanto por va sistmica como mucosal. La almina adyuvante sistmico
ms universalmente utilizado no ha sido efectivo por va oral y nasal con antgenos
que tradicionalmente son inyectados con este adyuvante, como el toxoide tetnico.
Es bueno destacar que el antgeno per se puede poseer caractersticas que lo hagan
"penetrante", como es el caso de determinados antgenos particulados y de otros que,
aunque no lo sean, tengan la capacidad de adherirse a receptores especficos, o de
establecer otro tipo de interaccin con clulas o componentes mucosales. Estas
caractersticas conducen a una correcta asimilacin del antgeno por vas que favorecen
las respuestas mucosal y sistmica.

22

Se ha demostrado que las mucosas son puertas de entrada muy eficaces para ciertos
patgenos. Aunque es muy difcil lograr una inmunidad de mucosa efectiva a partir de
la inmunizacin sistmica, por la va mucosal se logra inmunidad de mucosas y
sistmica. Tambin se ha demostrado que para los patgenos que permanecen en las
superficies mucosales o tienen en ellas una puerta de entrada, la proteccin se relaciona
mejor con una respuesta local fuerte.
La estrategia de adyuvacin por la va mucosal, de acuerdo con las caractersticas del
antgeno, exige procedimientos de unin o recubrimiento con ligandos especficos que
enven el antgeno a clulas especializadas del epitelio mucosal simple (clulas M).
Adems, para que el antgeno pueda cruzar las barreras que la ruta impone, se
manipulan caractersticas propias del antgeno como tamao, presencia de ligandos
mucosales, carga elctrica y lipofilicidad, as como el uso de sistemas de envo de
antgenos que favorezcan dichas caractersticas. Una vez asimilado el antgeno, el
adyuvante puede favorecer la respuesta por cualquiera de los mecanismos conocidos:
adsorcin del antgeno, efecto de depsito, induccin de citocinas, activacin del
sistema del complemento, reclutamiento de distintas poblaciones de clulas del sistema
inmunolgico, envo del antgeno a diferentes clulas presentadoras de antgenos,
regulacin de la expresin va MHC clase I o clase II, y estimulacin de la produccin
de diferentes subclases de anticuerpos, en dependencia de la estrategia de adyuvacin
utilizada.
Derivados de bacterias. Algunos de los inmunoestimulantes conocidos, como el MDP,
el MPL, la amina lipoidal Avridina y las conocidas toxinas de Vibrio cholerae (CT) y
de Escherichia coli (HLT), son adyuvantes reconocidos para antgenos administrados
por va de mucosas.

23

Aunque el MDP y el MPL han sido evaluados en formulaciones liposomales con fines
teraputicos y profilcticos, las toxinas o sus subunidades (en especial CT y CTB), son
los adyuvantes mucosales ms estudiados. La capacidad de CT de actuar como
adyuvante oral ha sido confirmada por un gran nmero de investigadores. La toxina del
clera no cumple con la definicin clsica de un adyuvante porque estimula una
respuesta inmune contra ella misma y su actividad adyuvante es dependiente de su
inmunogenicidad. Los efectos de CT y HLT que explican su fuerte actividad adyuvante,
incluyen el incremento de la presentacin de antgenos por varios tipos de clulas B, el
incremento en la diferenciacin de clulas B a clulas secretoras de IgA, la interaccin
con clulas T y la produccin de citocinas.
Desde el punto de vista prctico, el uso de la holotoxina en humanos no es factible
debido a su toxicidad. Una estrategia acertada es la destoxificacin de CT por escisin
de la subunidad A o por mutacin del gen que la codifica. Tanto CT como CTB
subunidad no txica pueden potenciar la respuesta inmune contra varios antgenos
acoplados covalentemente, debido a las interacciones especficas que se establecen con
las clulas M.
Sistemas de envo de antgenos a mucosas. Los sistemas de envo de antgenos, del
ingls antigen delivery systems, han alcanzado un nivel de desarrollo suficiente que
avala su introduccin en la prctica de la inmunizacin. Se espera que los sistemas
particulados slidos, tanto para administracin parenteral como no parenteral, se
encuentren dentro de los primeros productos a licenciar.
Por las posibilidades que brindan los sistemas de envo de antgenos en la particulacin
de antgenos solubles, y aprovechando las caractersticas fisiolgicas de la va mucosal,

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estos sistemas han sido ensayados y han mostrado actividad adyuvante. En la literatura
se han clasificado como: a) sintticos o inactivados, y b) vivos.
Sistemas sintticos o inactivados de envo de antgenos
Se han obtenido diferentes resultados a partir del estudio de las partculas polimricas
artificiales. Estas partculas comprenden las microesferas DL-PLG, los polmeros
alternativos como polifosfacenos, los polmeros de acetato de celulosa, los
iminocarbonatos, los polmeros de etilenvinilacetatos, las microesferas proteinoides, los
polianhdridos y las nanosferas de dextranas, las partculas producidas a partir de
materiales naturales (alginatos, gelatina y semillas de plantas), y los liposomas y sus
variantes (proteoliposomas, virosomas e ISCOM).
El tamao de las partculas es uno de los factores importantes para el envo de
antgenos. Para el caso de la va mucosal de inmunizacin, se ha informado que las
partculas de dimetro mayor de 10 mm no son absorbidas. En experimentos en ratas se
ha observado, luego de la administracin oral, que slo las partculas de 5 mm penetran
profundo en las placas de Peyer y las de 1 mm penetran a los linfonodos y al hgado, y
pasan a la circulacin sangunea. La extrapolacin de estos resultados a humanos an no
est definida y a veces la absorcin por el tracto gastrointestinal no es un requisito del
poder adyuvante. Aunque se ha comprobado que se potencie la respuesta inmune con la
adsorcin del toxoide diftrico en semillas de plantas de hasta 2 mm de dimetro, la
determinacin de la talla ptima de los sistemas de liberacin controlada para va nasal,
rectal o vaginal es motivo de investigacin en la actualidad.
Otro factor que afecta las partculas es el balance hidrofobicidad-hidrofilicidad, que
puede ser modificado para obtener una modulacin de la respuesta inmune.

25

Los cocleatos proteicos son complejos de liposomas y cationes divalentes
fundamentalmente calcio que, mediante la interaccin calcio-fosfolpido, posibilitan
la formacin de una estructura de liposoma enrollado sobre s mismo, lo que permite la
inmunizacin por diferentes vas. Con esta estructura se estimula tanto la respuesta
inmune de anticuerpos como la respuesta mediada por clulas.
Los liposomas y las micropartculas pueden adherirse a superficies mucosales por
interacciones hidrofbicas, pero la entrada de los antgenos a las clulas M es muy poco
eficiente debido a que son rpidamente atrapados en los geles mucosales y muchos no
llegan a alcanzar la mucosa. Las macromolculas o partculas que se conjugan o
recubren con ligandos como CTB, tienen como factor limitante la accesibilidad a los
receptores.
El uso de ligandos unidos a partculas puede resultar en una adherencia especfica a las
clulas M, pero slo dentro de un rango de tallas restringido por el glicocliz. Las
partculas de 1 mm o mayores requieren ligandos dirigidos especficamente a
componentes de las clulas M, aunque la identificacin de estos componentes an se
encuentra en investigacin.
Sistemas vivos de envo de antgenos
En este grupo se puede apreciar bien que el concepto de adyuvante no se restringe a
compuestos, sino que tambin incluye las estrategias encaminadas a desarrollar una
respuesta inmune aunque no implique la adicin de alguna sustancia.
Un grupo de bacterias patgenas es capaz de superar las dificultades de los sistemas no
vivos al ser asimiladas eficientemente por receptores a nivel de las clulas M. Estas
bacterias utilizan este mecanismo para infectar los tejidos mucosales y diseminarse

26

sistmicamente antes de ser detenidas por el sistema inmune. Los patgenos bacterianos
que se adhieren a la superficie de las clulas M, inician eventos de transduccin de
seales a nivel epitelial que promueven su internalizacin. Teniendo en cuenta esta
propiedad, se han obtenido cepas atenuadas de Salmonella typhi ty21a para la cual se ha
descrito una interaccin de tipo lectina con receptores de naturaleza polisacardica de la
membrana citoplasmtica de las clulas M. Tambin son consideradas seguras y
efectivas las cepas vivas atenuadas de V. cholerae y poliovirus para la inmunizacin
oral. Las cepas manipuladas genticamente de estos microorganismos, comienzan a ser
usadas en humanos como portadoras de antgenos heterlogos.
La biologa de estos vectores vivos introduce nuevos retos. Las cepas vacunales de
V. cholerae que no poseen los genes de la toxina an pueden causar diarreas, al parecer
porque las clulas epiteliales liberan citocinas en respuesta a la adherencia bacteriana.
La estrategia en el uso de las cepas manipuladas genticamente de S. typhi y
S. typhimurium, consiste en lograr una atenuacin suficiente que brinde seguridad a la
vez que conserve la adherencia a las clulas M y la proliferacin en mucosas para
mantener su inmunogenicidad. Las cepas atenuadas de Shigella tambin son
internalizadas por las clulas M, pero no son capaces de diseminarse de una clula a la
otra. Este fenmeno es la base de la atenuacin, pero an hay una liberacin local de
citocinas y factores quimiotcticos que puede producir la prdida de la funcin normal
de la barrera epitelial.
Los virus se encuentran tambin en estudio. El hecho de que el poliovirus tipo 1 y la
cepa atenuada de Sabin utilicen el transporte a travs de las clulas M para cruzar la
barrera epitelial, los convierte en candidatos importantes de vacunacin oral para el
envo de antgenos forneos en humanos. El virus vaccinia y otros poxvirus son

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asimilados por las superficies mucosales, pero su interaccin con las clulas M no ha
sido documentada.
Nuevas tendencias en el desarrollo de adyuvantes
Adyuvantes para la inmunizacin con ADN
A principios de la dcada de 1990, se pens que las vacunas basadas en ADN desnudo,
como su nombre lo indica, no tendran ningn componente adyuvante ni ninguna
estrategia de adyuvacin. Esta creencia se generaliz teniendo en cuenta los resultados
iniciales que demostraron que es posible generar respuestas inmunes potentes cuando
determinadas protenas codificadas por vectores plasmdicos eran inoculadas en
distintos modelos animales.
El aumento del nmero de antgenos evaluados con esta tecnologa, permiti comprobar
que no todos los antgenos tienen el mismo comportamiento y que compuestos que se
usan rutinariamente en ensayos en modelos murinos como los agentes necrosantes,
no pueden ser extrapolados a humanos por motivos obvios de reactogenicidad. En la
actualidad, existe un nmero creciente de reportes en los que se utilizan nuevos
elementos o estrategias para inmunopotenciar los candidatos vacunales basados en
ADN.
Coinoculacin de plsmidos que codifican inmunopotenciadores. Aunque los
mecanismos involucrados en la induccin y el mantenimiento de la respuesta inmune
an no estn claros, se ha utilizado con xito la estrategia de coinocular plsmidos que
codifican citocinas y factores coestimuladores, con el objetivo de potenciar la respuesta
inmune generada por el plsmido vacunal. Recientemente, se ha reportado que la
inoculacin, en un mismo adenovirus, de genes que codifican el HBsAg y el factor

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coestimulador B7-1, induce una respuesta citotxica especfica mayor contra el antgeno
viral con respecto a la generada por el gen de este antgeno solo. Tambin se ha
demostrado que la coinoculacin del plsmido de expresin de B7-2 junto al ADN
vacunal del VIH-1, incrementa la respuesta celular especfica contra el virus,
comparado con la inoculacin del ADN del VIH-1 solo. Adems, se encontr que esta
potenciacin de la inmunidad celular por B7-2 es dependiente de IFN-g. Otros autores
han obtenido resultados similares que demuestran la potenciacin de la respuesta
citotxica de linfocitos CD8+ restringidos al MHC clase I. Actualmente, se conoce que
los miocitos, a pesar de expresar pobremente las molculas del MHC, tienen la
capacidad de presentar antgenos asociados al MHC clase I. Con el uso de plsmidos
que codifican las molculas coestimuladoras B7-1 y B7-2, se puede expresar una fuerte
seal coestimuladora en los miocitos que no se puede generar de otro modo, y que
induce niveles mayores de proliferacin y activacin de clulas T especficas para el
antgeno introducido.
ADYUVANTES INMUNOLGICOS
Se ha precisado (MORRIS et al., 1999) que:
Las sustancias inmunomoduladoras constituyen una familia muy heterognea si se
toman en consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgica especfca.
Dentro de ellas ocupan un lugar muy importante los agentes inmunopotenciadores, a los
cuales se les atribuyen 2 funciones fundamentales: la estimulacin de la resistencia no
especfica del husped contra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra parte,
la potenciacin de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de
los animales de laboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la
produccin de antisueros. Los avances experimentados en la ltima dcada en la sntesis
de pptidos, la secuenciacin de nucletidos y la ingeniera gentica han posibilitado el

29

desarrollo de las denominadas "vacunas de nueva generacin"; sin embargo, la
utilizacin exitosa de estas nuevas tecnologas requiere de un esfuerzo investigativo
sostenido para hallar sustancias con actividad inmunopotenciadora (adyuvantes),
eficaces en la estimulacin de la respuesta inmune y desprovistas de propiedades
biolgicas adversas. Los adyuvantes son sustancias o preparados qumicos que,
incorporados al antgeno o inyectados simultneamente con l, hacen ms efectiva la
respuesta inmune.
Con su empleo se logra una economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor
nivel de anticuerpos especficos.
El mecanismo de accin de estas sustancias ha sido objeto de numerosos estudios y, al
parecer, existen diversos factores que explican su modo de accin. El antgeno libre
normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de
inoculacin, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depsito del
antgeno de larga vida. Las investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente
todos los adyuvantes activan o estimulan los macrfagos; stos cuando son activados
estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antgeno expresado
en la membrana celular y de la eficiencia de su presentacin a los linfocitos. El
macrfago tambin libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferacin
de los linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar
especficamente sobre los linfocitos; pero, en general, stas funcionan mejor si facilitan
la liberacin simultnea del antgeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido
linfoide.
En el nivel internacional, la lista de productos naturales y derivados de la sntesis
qumica, con propiedades adyuvantes/inmunopotenciadoras, es cada vez mayor; sin
embargo, slo un reducido nmero se utiliza en la formulacin de vacunas veterinarias y

30

humanas, existiendo una tendencia relacionada con la evaluacin de nuevas sustancias
con esta finalidad. En funcin del campo de aplicacin y de la relacin
eficiencia/seguridad se pueden reconocer diferentes categoras de adyuvantes, que sern
examinadas a continuacin con ms detenimiento.

SELECCIN DE UN ADYUVANTE CON FINES INVESTIGATIVOS
Con fines investigativos, las exigencias ms importantes se relacionan con una elevada
eficacia, un amplio espectro de aplicacin, una fcil manipulacin y, por supuesto, la
disponibilidad comercial.
El adyuvante completo de Freud (FCA) ha sido utilizado durante ms de 50 aos en la
produccin de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone
de cantidades limitadas de antgenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. La
gravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por
encontrar opciones igualmente efectivas y menos txicas no han resultado del todo
exitosos. Con los avances alcanzados en numerosas reas de las ciencias biolgicas y el
creciente inters por el bienestar de los animales de experimentacin, existe una
considerable presin para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la
actualidad con alternativas definitorias para este adyuvante, en diferentes estudios
comparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor nmero
de efectos adversos y mayor facilidad en la manipulacin.
En la investigacin pueden utilizarse, adems, los compuestos de aluminio, la
formulacin "Syntex-1" (SAF-1) que contiene el treonil anlogo del dipptido
murmico, polmeros no inicos en bloque (NBP), saponinas, bromuro de dimetil
dioctadecil amonio (DDA), lipopptidos, etc.


31

SELECCIN DE UN ADYUVANTE EN EL CAMPO DE LA SALUD
VETERINARIA
En este campo, la eficacia es un elemento de gran importancia y se toleran ciertos
niveles de efectos colaterales. Los adyuvantes ms ampliamente utilizados en las
vacunas veterinarias son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua
en aceite) y los adsorbentes (hidrxido y fosfato de aluminio). En algunos casos, se
emplean liposomas, saponinas, vitamina E, complejos inmunoestimulantes (ISCOMs),
as como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal. Las emulsiones de
aceite mineral, especialmente las del tipo agua en aceite, si bien inducen una fuerte
respuesta inmune, pueden provocar riesgos y efectos no deseados, a causa posiblemente
de su limitada biodegradabilidad y biocompatibilidad.
Por tal razn, se han realizado numerosos intentos para desarrollar adyuvantes eficaces
y a la vez seguros. Ejemplo de ello es la formulacin compuesta por
sulfolipopolisacridos sintticos, con caractersticas hidrofbicas, incorporados a una
emulsin de escualeno en agua, desarrollada por la compaa belga Solvay SA. Este
adyuvante ha sido validado exitosamente en animales de laboratorio con antgenos
proteicos y virales, y resulta, al menos, tan efectivo como los adyuvantes basados en
aceite mineral, empleados hoy da en diversas vacunas veterinarias.

ADYUVANTES PARA VACUNAS HUMANAS
El criterio ms importante, sin lugar a dudas, para la seleccin de un adyuvante
destinado a vacunas humanas es la bioseguridad y, en la prctica, los compuestos de
aluminio son los nicos adyuvantes licenciados para uso humano.
El hidrxido de aluminio tiene un punto isoelctrico de 11,1 y, por tanto, est cargado
positivamente en las condiciones biolgicas, por lo que puede adsorber protenas

32

cargadas negativamente y adsorber dbilmente las protenas bsicas. El grado de
adsorcin depende de la naturaleza y concentracin del antgeno, de la presencia de
sales e iones bufferantes y del pH de la mezcla resultante. Las fuerzas de atraccin
electrostticas y las interacciones hidrofbicas son las responsables de la adsorcin de
los antgenos a los adyuvantes que contienen aluminio, pero probablemente las fuerzas
de Van der Waals y los enlaces de hidrgenos tambin contribuyan a la adsorcin en
estos sistemas; sin embargo, se ha sealado que el alumbre puede inducir anticuerpos de
la clase IgE, as como reacciones alrgicas. Segn las regulaciones de la FDA, son
permisibles cantidades no mayores de 0,85 mg de aluminio por dosis de vacuna.
Las nuevas vacunas recombinantes y sintticas poseen una baja inmunogenicidad en
comparacin con las vacunas tradicionales, consistentes en los microorganismos
intactos, atenuados o inactivados por el calor; de ah el inters por la bsqueda de
diferentes inmunoadyuvantes para incrementar la efectividad de estas nuevas vacunas
para uso humano. En este sentido, Tamura y otros, notifican en estudios realizados en
ratones, la utilidad de 2 derivados del dipptido murmico como adyuvantes para la
vacuna recombinante de la hepatitis B, primera de esta categora en ser licenciada para
uso en humanos y disponible comercialmente en forma adsorbida al alumbre. La
respuesta de anticuerpos obtenida con los derivados del MDP result similar a la
inducida por la vacuna adsorbida en alumbre y se discute, por los autores, el posible
papel de estos compuestos como su sustituto.

SAPONINAS
Los vegetales que contienen saponinas (Evans, 1989), hetersidos llamados saponinas
(del latn sapo, jabn), se han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por
sus propiedades detergentes.

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Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser agitada con agua o disuelta en
alcohol. Las contienen plantas muy diversas (Evans, 1989), entre ellas la acacia, la
saponaria o jabonera, el castao de indias y muchas otras. Las saponinas se han
utilizado mucho, y an se utilizan en ocasiones, como agentes limpiadores de la
contaminacin producida por vertidos txicos. Algunas presentan propiedades
hipocolesterolmicas.
Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes cantidades de saponinas, una
de stas es Sapindaceas con la especie Sapindus saponaria. Las saponinas son
glicsidos resultante de la unin de la sapogenina (aglicn) con uno o ms azcares. Las
Saponinas aisladas (Tsuzuki et al., 2007) de Sapindus saponaria son las L-Hederina
(sapindussaponinas): two pure triterpene acetylated saponins: 3-O-(4-acetyl--D-
xylopyranosyl)-(13)--Lrhamnopyranosyl-(12)--L-arabinopyranosyl-hederagenin
(1) and 3-O-(3,4-di-acetyl--D-xylopyranosyl)-(13)--L-rhamnopyranosyl-(12)--
L-arabynopyranosyl-hederagenin (2), la sapogenina es la L-Hederagenina y los
azcares: rhamnosa y arabinosa.

En nuestro pas, tenemos la especie Sapindus saponaria L. (choloque o boliche),
de la que desde pocas precolombinas (Almenara, 1984) se ha utilizado el pericarpio del
fruto maduro por su alto contenido de saponinas. Motivo por el cual los seis ltimos
aos se ha trabajado en nuestros laboratorios con la cscara del fruto maduro, para
desarrollar una tecnologa de obtencin de un extracto concentrado de saponinas. Ahora
es necesario encontrar aplicaciones cientfico-tecnolgicas que a futuro demanden la
produccin industrial y la industrializacin del producto.
Se ha reportado (Bonnin y Llorens, 2011) que del Castao de indias (Aesculus
hippocastanum L.), se usan las hojas y la corteza porque contienen escina, mezcla de

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saponinas triterpnicas, que le confieren propiedades como venotnico y vitamnico P.
En forma de cpsulas en mezcla con extractos de otras plantas se usa en la terapia de la
lipoesclerosis.
En Colombia estn formulando productos cosmticos que incluyen extracto de
saponinas de Ruscus (Pizano, 2009) para estimular el metabolismo celular, la
multiplicacin celular y micro circulacin cutnea.
Investigadores del Centro de Investigaciones de Energa Solar en Santiago de Cuba
(Morris et al., 1999), destacan las amplias posibilidades que ofrecen los productos
naturales, especialmente polisacridos de diversas fuentes, en la tamizacin de
sustancias con propiedades inmunoestimulantes y reportan que las saponinas estn
siendo utilizadas como adyuvantes inmunolgicos en el campo de la salud veterinaria.
En ciudad de La Habana, Cuba; luego de una evaluacin cientfica de plantas
medicinales con accin antileishmanial, se ha reportado (Monzote, n.d.) que la saponina
hederacolchisida A, purificada de Hedera colchica, ha mostrado una potente actividad
in vitro frente a promastigotes (IC50=1.2 M) y amastigotes (IC50=0.053 M) de L.
infantum. Otras dos saponinas purificadas de Hedera helix, y -Hederina; tambin
han mostrado una actividad significativa contra esta misma especie de Leishmania,
mostrando una inhibicin media del crecimiento menor de 14 M frente a
promastigotes y menor de 0.4 M frente a amastigotes. Yuccasaponina MC3, saponina
purificada de Yucca filamentosa 5 g/mL, ha mostrado un 100% de inhibicin del
crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana amazonensis. Experimentos
llevados a cabo por citometra de flujo, revelan que estos compuestos actan sobre el
parsito mediante una unin inespecfica con la membrana que provoca la muerte
celular. Segn datos anteriores, las saponinas interactan con el ergosterol presente en

35

las membranas, induciendo prdida de su integridad o alteracin en la porcin
hidrocarbonada cargada negativamente.
En la Pontificia Universidad Catlica de Chile, en 2002 se anunci (Rosso, 2002) la
creacin de una industria para la extraccin y comercializacin de saponinas, que en la
actualidad muestra interesantes perspectivas de desarrollo por su aplicacin en el
proceso de refinacin del cobre.
La oferta de productos para la firma del Tratado de Libre Comercio (TLC Per
EEUU); entre tantos otros productos naturales, incluye saponinas. As tambin, en la
Lista Arancelaria de Colombia para el TPD (Colombia-USA), estn las saponinas.
En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer
como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria
L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las
saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque
cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo.
Adyuvante es una sustancia distinta de un antgeno que potencia la activacin de los
linfocitos T al favorecer la acumulacin y activacin de otros leucocitos (Abbas et al.,
2004), denominados clulas accesorias, en el lugar de exposicin al antgeno. En las
clulas accesorias, los adyuvantes aumentan la expresin de coestimulantes y citocinas
que activan a los linfocitos T y pueden prolongar tambin la expresin de complejos
pptido-CPH en la superficie de las CPA.
En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer
como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria
L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las
saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque
cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo.

36

En tal perspectiva se plante el problema Cul es el efecto adyuvante de las saponinas
de Sapindus saponaria L. para antgenos de Leishmania braziliensis en msculo
estriado de Rattus rattus var albinus?
La hiptesis de trabajo fue: Las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como
adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la
acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las
respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis.
Dado que en nuestro pas subsiste el problema de la leishmaniasis estos resultados
pueden representar una esperanza para desarrollar una vacuna para L. braziliensis que
permita solucionar en parte la urgencia de atencin de salud en las zonas endmicas
como los valles interandinos occidentales y la selva peruanos.



37

II. MATERIAL Y MTODO

Material de estudio
Rattus rattus var albinus: 20 especmenes machos con peso entre 300 400 g;
divididos al azar en cuatro grupos, un testigo y tres grupos ensayo de 5 especmenes
cada uno.
Materiales de prueba: Concentrado de Saponinas de Sapindus saponaria L. purificadas
en el laboratorio de Anlisis Instrumental, suspensin de fracciones antignicas aisladas
de Leishmania braziliensis preparada en el laboratorio de Toxicologa, suero
fisiolgico, reactivos para microscopia ptica.
Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio.
Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma, espectrofotmetro UV/Vis HP
8452A, microscopio ptico binocular, balanza analtica.

Mtodos y tcnicas
Diseo experimental: Diseo clsico
Los grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimentales, fueron inyectados va
intramuscular con suero fisiolgico (grupo T), suspensin de antgenos de Leishmania
braziliensis en solucin salina fisiolgica (grupo A), saponinas en solucin salina
fisiolgica (grupo B) y saponinas - suspensin de fracciones antignicas solucin salina
fisiolgica (grupo C). Se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los
especmenes de cada grupo, a las 48 y 192 horas.

Extraccin de saponinas por maceracin.

38

Cada vez se seleccion una muestra 25 frutos secos de Sapindus saponaria L. Se cort
la cscara por el dimetro peciolar, se registr el peso de cscaras en balanza sensible al
0,01 g. Se macer las cscaras en 250 mL de agua por 24 horas. Se filtr el extracto a
travs de torunda de algodn. El filtrado acuoso se deposit en el baln del Equipo de
fraccionamiento de espuma con 70 cm de columna, a velocidad mnima. Se realiz el
fraccionamiento de espuma hasta completar 100 mL de escurrido, el que fue sometido a
ebullicin por 5 minutos. Se determin la concentracin de las saponinas mediante la
ecuacin de la curva de calibracin respectiva.

Preparacin de los antgenos de Leishmania braziliensis
El cultivo de Leishmania braziliensis se realiz en frascos Roux con medio BHI agar
enriquecidos con sangre total de conejo, con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100
UI/mL, solucin salina fisiolgica. Se sembr e incub por 15 das a 20 C, se cosech
con solucin salina fisiolgica estril, se centrifug durante 10 minutos a 3000 rpm. Se
desech el sobrenadante, se resuspendi el precipitado en solucin salina fenolada
0,25% y nuevamente se centrifug. Se elimin el sobrenadante y se agreg solucin
salina fisiolgica fenolada; se esteriliz a 121 C por 15 minutos a 15 atmsferas de
presin y se conserv a -20 C.

Ensayo inflamatorio
Un estudio comparativo en ratas se llev a cabo para investigar las reacciones locales y
los cambios hematolgicos despus de la inyeccin de una dosis intramuscular de
sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna de L. braziliensis sapindussaponina (19,59
mg 0,25 mL suspensin). Los efectos fueron comparados con los causados por suero
fisiolgico y por la vacuna de L. braziliensis (0,25 mL suspensin). Grupos de cinco

39

ratas machos fueron inyectados en el msculo del muslo izquierdo con 0.25 mL de la
solucin de prueba a 0 das. A las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre
perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepar los frotis y se realiz el
conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin.

Anlisis estadstico
Se realiz el ANOVA (Walpole et al., 1999) con las prueba de MSD y Dunnett para
determinar si existe o no diferencia significativa entre las respuestas grupo experimental
y testigo, mediante el software (Prez, 2001) SPSS v 16.


40

III. RESULTADOS

Los resultados se presentan en los siguientes TABLAS
TABLA 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinus
PORCENTAJE DE CLULAS
Grupo Horas
Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfocitos Monocitos
Testigo 48
32 5 1 58 4
Testigo 48
32 6 1 56 5
Testigo 48
34 4 1 56 5
Testigo 48
33 3 1 58 5
Testigo 48
35 6 1 55 3
A 48
32 6 0 58 4
A 48
33 5 0 58 4
A 48
32 5 1 58 4
A 48
34 3 1 57 5
A 48
32 4 1 58 5
B 48
44 4 0 45 7
B 48
43 3 0 47 7
B 48
45 3 1 44 7
B 48
46 2 0 46 6
B 48
44 4 0 46 6
C 48
42 3 1 48 6
C 48
42 2 1 49 6
C 48
43 2 1 48 6
C 48
42 3 0 48 7
C 48
44 2 0 47 7
Testigo 192
33 6 1 55 5
Testigo 192
32 4 1 58 5
Testigo 192
34 5 1 55 5
Testigo 192
32 4 1 59 4
Testigo 192
33 6 1 56 4
A 192
33 6 1 56 4
A 192
31 5 1 59 4
A 192
32 4 1 59 4
A 192
34 6 1 54 5
A 192
32 6 1 56 5
B 192
35 3 1 57 4
B 192
36 3 1 56 4
B 192
36 2 1 57 4
B 192
35 2 1 58 4
B 192
34 3 1 57 5

41

C 192
35 3 1 57 4
C 192
34 3 1 57 5
C 192
36 2 1 56 5
C 192
35 2 1 58 4
C 192
34 2 1 59 4

TABLA 2. FORMULA LEUCOCITARIA Rattus rattus var albinus
Anlisis de varianza ANOVA de un factor

Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
neu
1
Between Groups 794,000 7 113,429 113,429 0,000
Within Groups 32,000 32 1,000
Total 826,000 39
eos
1
Between Groups 56,800 7 8,114 10,143 0,000
Within Groups 25,600 32 0,800
Total 82,400 39
bas
1
Between Groups 3,200 7 0,457 4,571 0,001
Within Groups 3,200 32 0,100
Total 6,400 39
lin
1
Between Groups 805,575 7 115,082 67,695 0,000
Within Groups 54,400 32 1,700
Total 859,975 39
mon
1
Between Groups 33,575 7 4,796 13,704 0,000
Within Groups 11,200 32 0,350
Total 44,775 39

1; neu, neutrfio; eos, eosinfilo; bas, basfilo; lin, linfocito; mon, monocito

42

IV. DISCUSIN
La hiptesis de trabajo planteaba que las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando
como adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la
acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las
respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis. Se pas
entonces a tomar las muestras de sangre para evaluar los cambios hematolgicos
mediante el conteo de clulas blancas (frmula leucocitaria).
Luego de la inyeccin de saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L.
braziliensis, el porcentaje de neutrfilos se incrementa a las 48 horas y disminuye muy
poco a las 192 horas; las pruebas estadsticas indican con 95% de seguridad que tal
variacin es significativa. No hay variacin estadsticamente significativa por inyeccin
de las fracciones antignicas de L. braziliensis.
Se conoce que en los seres humanos (Rodrguez et al., 1993), un aumento del porcentaje
de neutrfilos puede deberse a inflamaciones y ciertas enfermedades infecciosas agudas.
A las 48 horas hay una disminucin estadsticamente significativa de eosinfilos en los
grupos que recibieron saponinas y saponinas ms fracciones antignicas de L.
braziliensis; esta condicin se mantiene a las 192 horas.
Cuando la persona tiene ciertas reacciones alrgicas, infecciones u otras afecciones
mdicas (Gersten et al., n.d.), los eosinfilos se vuelven activos. Estas clulas
conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas blancas, pero
son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina
y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la respuesta
inmunitaria es activada.

43

A las 192 horas se registra una disminucin estadsticamente significativa de basfilos
en los grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas
de L. braziliensis.
Los basfilos conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas
blancas (Dugdale et al. n.d.); pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria
del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los
vasos sanguneos cuando la respuesta inmunitaria es activada. El basfilo es una clula
preponderantemente sangunea (Bords, n.d.), acude a los tejidos durante el proceso
inflamatorio y supone un refuerzo en la liberacin de mediadores ya que se activa por
los mismos mecanismos que el mastocito y libera mediadores equivalentes a los de esta
clula.
El porcentaje de linfocitos disminuye a las 48 horas en los grupos que recibieron
saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis. A las 192
horas la diferencia no es estadsticamente significativa.
A las 48 horas los grupos que recibieron saponinas y la combinacin saponinas
antgenos de L. braziliensis experimenta una disminucin estadsticamente significativa
en el porcentaje de monocitos; pero a las 192 horas el porcentaje tiende a su valor
normal. Los monocitos colaboran con otros glbulos blancos en la eliminacin de
tejidos muertos o daados, en la destruccin de clulas cancerosas y en la regulacin de
la inmunidad contra las sustancias extraas. Al igual que otros glbulos blancos, los
monocitos se originan en la mdula sea y luego entran en el flujo sanguneo. En unas
horas, emigran a los tejidos donde se convierten en macrfagos, y constituyen las
clulas defensivas (fagocitos) del sistema inmunitario.
Estos hechos pueden ser explicados en parte por la dinmica del proceso inflamatorio
presentado por Bords (n.d.). La inflamacin es un proceso tisular constituido por una

44

serie de fenmenos moleculares, celulares y vasculares de finalidad defensiva frente a
agresiones fsicas, qumicas o biolgicas. Los aspectos bsicos que se destacan en el
proceso inflamatorio son en primer lugar, la focalizacin de la respuesta, que tiende a
circunscribir la zona de lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la respuesta
inflamatoria es inmediata, de urgencia y por tanto, preponderantemente inespecfica,
aunque puede favorecer el desarrollo posterior de una respuesta especfica. En tercer
lugar, el foco inflamatorio atrae a las clulas inmunes de los tejidos cercanos. Las
alteraciones vasculares van a permitir, adems, la llegada desde la sangre de molculas
inmunes.
Esquemticamente la inflamacin tiene cinco etapas:
1. Liberacin de mediadores. Son molculas, la mayor parte de ellas, de estructura
elemental que son liberadas o sintetizadas por el mastocito bajo la actuacin de
determinados estmulos.
2. Efecto de los mediadores. Una vez liberadas, estas molculas producen alteraciones
vasculares y efectos quimiotcticos que favorecen la llegada de molculas y clulas
inmunes al foco inflamatorio.
3. Llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio. Proceden en su mayor
parte de la sangre, pero tambin de las zonas circundantes al foco.
4. Regulacin del proceso inflamatorio. Como la mayor parte de las respuestas
inmunes, el fenmeno inflamatorio tambin integra una serie de mecanismos
inhibidores tendentes a finalizar o equilibrar el proceso.
5. Reparacin. Fase constituida por fenmenos que van a determinar la reparacin total
o parcial de los tejidos daados por el agente agresor o por la propia respuesta
inflamatoria.
Es muy importante la Fase tarda. Llegada de clulas

45

1. Basfilo. Contribuye, junto con el mastocito, a la liberacin de mediadores.
2. Neutrfilo. Es de las primeras clulas en llegar al foco inflamatorio. Elimina al
germen mediante fagocitosis o liberando factores txicos que contiene en sus
grnulos citoplasmticos y producindole, as, una muerte extracelular.
3. Monocito/Macrfago. Procedente de la sangre el monocito, y de los tejidos cercanos
el macrfago, llegan al foco ms tardamente. El monocito, en los tejidos, se
diferencia en macrfago. Esta clula presenta idnticas funciones a las sealadas
para el neutrfilo. Acta adems, como clula presentadora del antgeno a las
clulas especficas T y B, iniciando, de esta forma, la respuesta especfica.
El macrfago sintetiza un pptido inespecfico, la interleucina 1 (IL-1), que es
una autntica hormona del Sistema Inmune, ya que pasando a la sangre produce
efectos sobre distintas partes del organismo. Determina la aparicin de fiebre,
probablemente induciendo la sntesis de PGE en las clulas endoteliales que revisten
los vasos sanguneos del hipotlamo; a su vez la PGE acta sobre el centro
termorregulador. Sobre la mdula sea favorece la produccin y liberacin de
neutrfilos, con la consiguiente neutrofilia. En el hgado incrementa la sntesis de
protenas de la fase aguda.
A nivel local, la IL-1 activa la proliferacin y diferenciacin de las clulas T y B
contribuyendo, as a la respuesta especfica. Tambin activa la proliferacin de
fibroblastos y produccin de colgeno, fenmenos incluidos en la fase de reparacin
de la inflamacin.
4. Linfocitos T y B. Potenciados por el macrfago inician la respuesta especfica. Las
clulas B procedentes de los tejidos linfoides asociados a tejidos o mucosas
sintetizan IgE, que unidas al mastocito o basfilo pueden potenciar la inflamacin.

46

Por otra parte, las clulas T comienzan a producir linfoquinas que prolongan la
inflamacin en una respuesta inmune ms elaborada.
5. Eosinfilo. Aunque es una clula citotxica en las infecciones parasitarias, parece
adems tener en la inflamacin una funcin reguladora, por lo que ser estudiada en
el siguiente apartado.

Pero tambin la REGULACIN DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA
Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio se
encuentra estrechamente regulado, evitando, as una respuesta exagerada o perjudicial.
Algunos de los mediadores que producen activacin, al variar su concentracin o actuar
sobre distintos receptores, van a producir inhibicin, consiguiendo, de esta forma, un
equilibrio o modulacin de la respuesta inflamatoria. Los siguientes factores intervienen
en esta regulacin:
1. Histamina. Actuando sobre receptores H2, induce en el mastocito y basfilo una
inhibicin de la liberacin de mediadores, inhibe la actividad del neutrfilo, inhibe
la quimiotaxis y activa las clulas T supresoras.
2. PGE. Produce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de
mediadores y sobre los linfocitos una inhibicin de la proliferacin y diferenciacin.
3. Agonistas autonmicos. El mastocito y basfilo parecen presentar receptores y -
adrenrgicos y -colinrgicos que sugieren que la liberacin de mediadores podra
estar sometida a una regulacin autonmica. La activacin del receptor -
adrenrgico produce una inhibicin, mientras que la activacin del -adrenrgico y
-colinrgico inducen la estimulacin
4. Heparina. Inhibe la coagulacin y la activacin de los factores del complemento.

47

5. Eosinfilo. Esta clula, atrada por el ECF-A, acude al foco inflamatorio donde
libera una serie de enzimas que degradan determinados mediadores potenciadores de
la inflamacin. La histaminasa acta sobre la histamina, la arilsulfatasa sobre los
leucotrienos y la fosfolipasa sobre el PAF.


48

V. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados se concluye:
1. La inyeccin de saponinas y saponinas - antgenos de L. braziliensis provoca
cambios en la frmula leucocitaria.
2. las variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y
monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas
fracciones antignicas de L. braziliensis.

49

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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52





ANEXOS


53


Anexo 1. Corte pelo del muslo izquierdo para inyectar


Anexo 2. Inyeccin en el msculo del muslo izquierdo

54




Anexo 3. Grupo testigo T. Recibi Solucin Salina Fisiogica

Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibi Asociacin Saponinas Antgenos de L.
braziliensis

55



Anexo 4. Obtencin de Sangre Perifrica (cola)



M.Sc. Q.F. Segundo M. Miranda Leyva


VB _____________________________
Dr. Ramn Piminchumo Carranza