PRACTICA N1: FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE, COLORACION GRAM Y

LA GALERIA BIOQUIMICA OxNiGLUMoCISKAD

I. INTRODUCCIN.
Existen un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del
intestino del hombre y de los animales representados por bacilos Gram negativo
no esporulado que se encuentran tambin en excretas, aguas, pastos, suelos,
alimentos y vegetales al estado y en descomposicin.
Nos estamos refiriendo a los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo
conocimiento racional y orgnico permite establecer el diagnstico inmediato de
las enfermedades entricas, dictar las medidas de orden epidemiolgico y
establecer las causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman un
extenso captulo de la patogenia infecciosa del pas.
El conocimiento de estos seres vivos, es obligatoria en los estudios
microbiolgicos, no slo porque algunos gneros y especies ocupan destacada
posicin en la patogenia entrica de origen humano animal, sino porque tambin
es una base fundamental en la sanidad pblica y en el diagnstico bacteriolgico
en general. Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora
microbiana del intestino del que se encuentran tambin en la excretas, aguas,
pastos, suelos, -alimentos y vegetales al estado.
Caractersticas de las Enterobacteriaceae
En la definicin clsica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios bsicos,
adicional a la aparicin de nuevos mtodos taxonmicos para incluir a ciertos
gneros que no cumplen con todos los siguientes criterios, pero que forman parte
de esta familia:
Son bacterias Gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos
y otros pleomrficos.
No son exigentes, son de fcil cultivo.
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa
positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Son anaerbicos facultativos.
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con
o sin la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa),
y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones
aerbicas.

II. REVISION BIBLIOGRAFICA
A las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo
esporulados, mviles o inmviles, provistos de flagelos en pertrico, que
adoptan la forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patolgicamente
como huspedes en el intestino del hombre y de los animales, se les halla en
los alimentos en descomposicin, excretas de origen humano y animal, en las
aguas del albaal y emuntorios en general viven saprofticamente en las
materias orgnicas en descomposicin. Gran nmero de especies que integran
esta familia son patgenas pura el hombre y los animales; produciendo
infecciones graves en forma individual, endmica y epidmica (Guia de
microbiologa agroindustrial).
CLASIFICACION DE LA ENTEROBACTERIAS
Escherichia coli es un habitante intestinal. No es con mucho el ms
abundante numricamente, sino que est por detrs de Bacteroides y
Bifidobacteriurn. No obstante, E. coli se mantiene viable un cierto tiempo
fuera del intestino y es fcilmente demostrable. Por ello es apropiado
utilizarla como demostracin de contaminacin fecal en las aguas de
bebida.
Proteus vulgaris pertenece tambin a la flora intestinal normal pero
asimismo est ampliamente distribuido en el suelo y en las aguas. Esta
bacteria es conocida debido a su tendencia a la modificacin de forma
(nombre), su intensa actividad y la tendencia a diseminarse sobre las
superficies de agar y cubrir toda la superficie.
Enterobacter aerogenes es en cierto modo el hermano gemelo de E. coli;
ambos se designan como "Coliformes". Es muy abundante en los suelos.
Tal como indica su nombre, esta bacteria forma mucho gas. Se diferencia
de E. coli tan s610 par unas pocas caractersticas bioqumicas.
Serratia marcescens (anteriormente Bacterium prodigiosum u "hongo de
las hostias") puede ser considerada como una variante pigmentada de
Enterobacter. Al gnero Erwinia pertenecen algunas especies pat6genas
de vegetales, que afectan a los vstagos, las hojas y las races y que
desencadenan enfermedades debido a la excreci6n de pectinasas.
Klebsiella pneumoniae se diferencia de Enterobacter exclusivamente para
la formaci6n de una capsula gruesa y por su falta de motilidad. Se presenta
en algunas formas muy peligrosas de inflamaci6n de los pulmones.
Salmonella typhimurium es la bacteria ms extendida de entre aqueas
que provocan una gastroenteritis, la Hamada "intoxicacin por productos
alimentarios". Esta intoxicaci6n se debe a la liberaci6n de lipopolisacaridos
que desencadena una irritaci6n de las mucosas; no se da ninguna invasi6n
del sistema sanguneo. S. typhi es el causante del tifus epidmico.

Shigella dysenteriae y cepas relacionadas son los causantes de la
disentera y las diarreas.
Vibrio cholerae es el causante del colera, una enfermedad epidmica. Este
agente causal no pertenece al grupo de las Enterobacteriaceae, pero desde
el punto de vista metabolico y fisiol6gico es muy pr6ximo. V. cholerae se
reproduce en el intestino. Se fija sobre el epitelio intestinal, pero no penetra
en las clulas. La enterotoxina del co1era es una protena, que se fija a las
clulas del epitelio intestinal (unos receptores especficos) y que determina
la salida de iones sodio, bicarbonato y cloruro, as! como de agua a la luz
intestinal.
Yersinia pestis es el causante de la peste. Yersinia no pertenece al grupo
taxonmico de las Enterobacteriaceae, pero es muy pr6ximo desde el punto
de vista de su modo de vida facultativamente anaer6bico y de su tipo de
fermentaci6n. EI reservorio natural del causante de la peste son los
roedores salvajes, sobre todo ratas. Las bacterias son transmitidas par
pulgas infectadas 0 por otros ectoparsitos hasta el hombre y conducen a la
peste bub6nica o a la peste pulmonar. Mediante una multiplicaci6n rpida y
la producci6n de una fuerte toxina conducen rpidamente a la muerte.
(Microbiologa General Hans. Scheler nueva edicin).

III. OBJETIVO
-Hacer que el alumno recuerde las tcnicas y procedimientos bsicos de
microbiologa general, para poderlos aplicar posteriormente en el control
microbiolgico de los alimentos.
IV. MATERIALES Y METODOS
A) Coloracin Gram a partir de una cepa marcada
- Desengrasar un porta-objeto con alcohol-acetona y algodn.
- Descolgar una gota de agua estril, suspender en ella una pequea cantidad de
cepa problema y homogenizar.
- Dejar secar y flamear suavemente la extensin para fijarla.
- Cubrir con una solucin del colorante primario. Cristal violeta u otro similar y
dejar en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de cao.
- Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar.
- Decolorar con la solucin de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.
- Cubrir con solucin de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto por
30 segundos. Lavar.
- Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersin y observar al
microscopio. Anotar los resultados.
B) Galera Bioqumica de OxNiGLUMoCISKAD para Enterobacteriaceaes
A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioqumicas:
- Reaccin de la Oxidasa (Ox)
- Reduccin de los Nitratos (Ni)
- Fermentacin de la Glucosa (G)
- Fermentacin de la Lactosa (L)
- Hidrlisis de la Urea (U)
- Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)
- Asimilacin del Citrato (C)
- Formacin del Indol (I)
- Formacin del cido Sulfhdrico (S)
- Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K)
- Transformacin de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirvico APP (A).
C) Fundamento v procedimiento de las pruebas bioqumicas
para la familia Enterobacteriaceae
Constituida por grmenes de bastn Gram negativo mviles (flagelos en
peritrico) e inmviles, Oxidasa negativos. Nitratos son reducidos a nitritos. Todas
fermentan la glucosa con o sin produccin de gas, la diferencia de estas bacterias
se basan en el comportamiento bioqumico, tratamiento recomendado por
MOSSEL-QUEVEDO y llamado: Ox Ni G L U Mo C I S K A D
Oxidasa (Ox)
Llamada tambin Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que
la: poseen, oxidan al tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).
Prueba: En una placa petri colocar un papel de nitro, humedecer este con el
reactivo de Kovacs (solucin de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua
destilada). Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se
oxida con el aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estra de cultivo joven
(18 a 24 horas de incubacin) de ms o menos 5 mm de longitud considerar la
prueba como positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las
enterobacterias no deben dar esta reaccin.
Reduccin de Nitratos (Ni)
Las bacterias que poseen las enzimas nitrato-reductasa, tienen la propiedad de
reducir los nitratos a nitritos.
Prueba: Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga
adems 1/1000 de Nitrato de Potasio. Despus de incubar a 37/24 horas, aadir
gotas de solucin A y de solucin B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo
slido formado por cido sulfanlico, cido tartrico, y alfa-naftil -amina.
La prueba es positiva s aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha
coloracin agregar sobre el cultivo que contiene e! reactivo, Zn o Mg en polvo;
observar despus de 10 minutos si la coloracin es rojiza, considerarla como
negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen el que se ha reducido
en nitratos.
Fermentacin de Glucosa, Lactosa y Produccin de H S(GLS)
El H
;
S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desanimacin de
aminocidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos), En el medio, el H
2
S formado,
reacciona con la sal de Fe contenido en l y da sulfuro de fierro (FeS) de color
negro. La prueba en condiciones aerobias, es reversible.
Prueba y lectura: Se puede realizar en un slo medio: Kligler (Hierro dos
azcares), en el cual la siembra se realiza por picadura profunda, y una estra en
la superficie. Incubar a 37C, por 18 a 24 Horas.
Parte inferior amarilla: Fermentacin de Glucosa.
Parte superior amarilla: Fermentacin de Lactosa.
Ruptura del medio: Produccin gas (Glucosa)
Ennegrecimiento en la puntura de inoculacin: H2S positivo, indicador del medio:
Rojo de fenol
Hidrlisis de Ia.Urea (U)
Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea,
alcalinizando en esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de
fenol, indicador de este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva).
Medio de cultivo: Caldo rea


Prueba: Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-slido (agar nitratado que
lleva 3% de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura,
introduciendo la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, slo en una de las ramas.
Lectura
Despus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un
enturbiamiento
Se ertienJe desde la rama cultivada a la otra.
KNO
3
: Fuente de Oxgeno, necesaria para la movilidad de! germen aerobio.
Asimilacin del Citrato (C)
Las enterobitcterias que utilizan el Citrato de Sodio como nica fuente de Carbono,
alculinizun el medio agar Citrato de Simona, haciendo virar el indicador azul de
bromo timol, del verde al azul intenso. Para esta prueba hay que tener las
siguientes precauciones:
-Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir
all los posibles restos de materia orgnica que pudiera contener.
- Realizar siempre la siembra a partir de un medio slido porque con medio
lquido se arrastrara restos de materia orgnica.
- Realizar la siembra en pequea cantidad y trazando slo una lnea a lo largo
de la superficie de inclinacin.
Produccin de Indol(I)
Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminocido triptofano.
Uno de los productos finales de esta degradacin es el Indol.
Prueba: Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptona do,
adicionar el reactivo de Kovacs pura Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la
superficie.




Tolerancia al Cianuro de Potasio (K)
Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente al
OTK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le ha
colocado previamente 0.1 mi. De un solucin al 0.5%. Se usan tubos de 8 x 160
mm-, y se siembran tres usadas de ms o menos 6 mm. De dimetro, a partir de
un cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37C por 18 a 24 horas como mximo.
Lectura:
Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.
Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie
completamente
Transparente, o ausencia total de desarrollo.
Prueba de cido Phenil Pir vico (A)
La fenilalanina, es un aminocido que determinadas enterobacterias pueden
transformar en cido phenil pirvico.
Prueba: Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estras) aminocido
en estudio. Despus de la incubacin a 37C por 24 horas, investigar en el medio
la presencia de cido fenil pirvico, adicionando unas gotas de sal frrica (Cl2 Fe).
Prueba positiva: Aparicin inmediata de color verde.
Descarboxilacion de la lisina (D)

Ciertas enterobacterias pueden transformar por desearboxilacin la lisina en
Cadaverina, que por desanimacin libera grupos amino (NH
3
), bajo la forma de
NH, alcalinizando e! medio de cultivo.

Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y
prpura de bromocresol como indicador del medio.

Lectura. Despus de incubar a 37C por 24 horas, considerar la prueba como
positiva si el Violeta vara al color prpura.
Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentacin de la glucosa.
Prueb
a
Medio de
cultivo
Temperatura e
incubacin
Reactivo a
aadirse
Prueba
positiva
Prueba
negativa
Ox --- ---- Tetrametil
parafenil
endiamina
Sin
coloracin
Color azul
Ni Caldo
nitrato
31C x 24 H Reactivo
grices
Color rojizo Despus
de agregar
Zn sigue
rojizo
G Agar
glucosa
31C x 24 H Color
amarillo
Sin
coloracin
L Agar
lactosa
31C x 24 H Color
amarillo
Sin
coloracin
U Caldo urea 31C x 24H Grosella
intenso
Rojo de
fenol
Mo Agar
movilidad
31C x 24 H Turbidez Sin color
C Agar citrato
de
Simmons
31C x 24 H Color azul Color verde
I Caldo
peptonado
31C x 24H Reactivo de
kovacs
Anillo
grosella
Sin
presencia
de anillo
S Agar kligler 31C x 24 Coloracin
negra
Sin
coloracin


V. RESULTADOS
Los resultados estn basados en las caractersticas que presento cada caso en
el tratamiento recomendado por Mossel Quevedo y son las siguientes:
Tratamiento Resultado
Ox -
Ni +
G -
L +
U -
Mo -
C -
I -
S -

VI. DISCUCIONES
-Los resultados que se obtuvieron fueron positivos debido a la coincidencia
exacta de los datos en cuanto a respuesta del microorganismo, la shygela que
es el microorganismo con los datos ms coincidentes a los resultados es una
enterobacteria gram positiva y se pudo encontrar en la mayora de las
muestras.
-En la prueba de coloracin Gram los resultados son correctos ya que la familia
de las Enterobacterias son gran negativos, nos esporulado y de forma bacilar.






VII. CONCLUSIONES
- En la prctica se pudo comprobar, de acuerdo a los procedimientos realizados la
presencia de shygela en las muestras debido a la coincidencia de los datos
obtenidos con los de la tabla de diferenciacin que nos sirve para la comparacin
de los resultados.
VIII. BIBLIOGRAFIA
-http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae
-http://dianayjulian.galeon.com/enterobacte.htm
-http://www.slideshare.net/miranda_col/eta-causadas-por-enterobacterias
-EPIFANIO MARTINEZ MENA 2000. Manual de Practicas de Microbiologa
Aplicada.Primera reimpresin Tarapoto-Per


IX. ANEXOS
Cuestionario
1) Por qu las bacterias Gram negativas retienen el colorante de
contraste, durante la coloracin Gram?
La razn por la cual se da esta caracterstica es porque el yodo forma con el cristal
una molcula soluble por lo que se da una fijacin a las bacterias gram negativas
por la permeabilidad de la membrana celular y debido al punto isoelctrico menos
acido por lo que se demuestra la poca afinidad con los colorantes bsicos.




2) Mencione diferencias entre bacterias Gram negativas y bacterias gram
positivas.

Gram negativas:

- Retiene el colorante de contraste
-Su coloracin es roja
-Sus protenas tienen un punto
isoelctrico menos acido
-Complejo CVI se forma dentro de las
bacterias y permanecen violetas
-Presenta capa lipdica
Gram positivas

-Complejo CVI se forman dentro de
las bacterias y estas permanecen
violetas
-Sus protenas presentan un punto
isoelctrico ms cido
-No presentan capa lipdica

3) Describa a las bacterias entricas y nombre a los gneros ms
representativos, dando caractersticas de cada uno de ellos.

Son parsitos de animales y de algunas plantas que son gram negativos y todas
las especies atacan a los carbohidratos ya que en su mayora reducen nitrato o
nitrito.
Echerichia: Se encuentra en el tracto intestinal de los mamferos y utiliza como
nica fuente de carbono el cido ctrico. Las especies de Escherichia coli
oportunistas producen infecciones slo si abandonan el colon. Otros grupos
producen hasta el 90% de las diarreas infantiles y la denominada diarrea del
viajero. Se desarrollan entre 15C y 45C pero optima de 22C con un pH ptimo
de 1, son gram negativos y suelen morir a 60C en 30 minutos




4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos gneros de la familia
Enterobacteriaceae.

Salmonella: Gastro enteritis por salmonella ms conocida como
salmonelosis.

Salmonella thipy: Produce la fiebre tifoidea.


Shigella: Produce disentera que es una enfermedad aguda o crnica del
intestino grueso del humano.

Vibrio Cholerae: Produce clera.


Echerichia coli: Produce gastro enteritis.











AO DE LA INVERSION PARA EL
DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD
ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN

FACULTAD: Ingeniera Agroindustrial
ESCUELA ACADMICA: Ingeniera Agroindustrial
ASIGNATURA: Microbiologa Agroindustrial
PRCTICA N1: Familia enterobacteriaceae, coloracin gram y la galera bioqumica
OxNiGLUMoCISKAD
DOCENTE: Ing. Nelson Garca Garay
ESTUDIANTE: Diego Ramrez Fatama
CICLO: IV
FECHA DE PRESENTACIN: 29/10/2013

MORALES 2013