3

. lGeueralAspects of DNA Isolation and Purification 3

ware, plastic pipettes tips, centrifuge tubes, and buffers should be sterilized.
The method of cell breaage used should a!oid strong forces that shear the
DNA" DNA, in solution, should alwa#s be pipetted slowl# with wide$bore
PlPettes %about 3 to & mm orifice diameter'. The tip of the pipette should
alwa#s be immersed in the li(uid when pipetting DNA. The DNA solution
should ne!er be allowed to run down the side of a tube nor should it be
!igorousl# shaen or !orte)ed. The use of molecular biolog# grade or ultra*
pure chemical reagents is strongl# recommended.
+ach DNA purification tas should begin with careful planning of the
amount of DNA needed, the purit# re(uired and an estimation of the size of
DNA molecules needed. Preparation of a genomic librar# re(uires l,fi to
3,,mg of large molecular weight DNA %more than -..... hp long', essen*
tia/# de!oid of protein contamination. 0outhern blot anal#sis o a single
coP# gene re(uires 1 to -. mg of euar#otic, genomic DNA per single gel
lane. The purit# and the size of this DNA is not as critical as it i for geomioc
libra preparation. DNA of 1. mo to -.. ... bp is sumcient for ost ap*
Plications purl achie!ed b# standard DNA isolation meo A s
e P23 reaction re(uires o# a !e sma/ amount of DNA %1. to 1.. ng'
and can tolerate a considerable ount of ,ntinating proteins, Indee
It I0 possible to achie!e P23 amplification of DNA from a single l#sed cell.
/owe!er, care must be ten to remo!e e)cess A from e DNA prepa*
hon, beuse a large ount of A se!erel# ibit e p23 ea/on.
+)Pected DNA #ields from large scale DNA puriflcationflroceduresof different
- - ra p obntamcdc 4- Iclu 5,' m t* canon
%mg' %mg' %mg' %mg DNA6
mg sample'
. .$ 7
8acteria 9.1 )i,lo -9.$9.. -:.$-;. ;.$<. 3.*&. 1*:
Animal cells 1.,)i,= 91.$&.. 9..$3.. 1.$;. 1..-.. 3.>=
Animal tissue 1.,?I,; 91..$&... -...$9... 91$1. 1...-... I*&
Plant tissue 1.,)l,= 3..$39.. :.$;.. 9.$3. :..$&... ..-*-.. $ 5 5 $
*****************************************************
a$Appro)imate total cell number used in purification procedures.
5
3
pipetas puntas de plstico, tubos de centrifugacin y tampones deben ser esterilizados.
El mtodo de la rotura celular utilizada debe evitar fuerzas fuertes que la cizalladura del
ADN. ADN, en solucin, siempre se debe pipetea lentamente con pipetas de dimetro
anco !alrededor de " a # mm de dimetro de orificio$. %a punta de la pipeta debe estar
siempre sumergida en el l&quido al pipetear ADN. %a solucin de ADN no se debe permitir a
correr por el lado de un tubo ni debe ser sacudido o vorte' vigorosamente. (e recomienda
encarecidamente el uso de grado biolog&a molecular o reactivos qu&micos ultrapura.
)ada tarea de purificacin de ADN debe comenzar con una planificacin cuidadosa de la
cantidad de ADN es necesario, la pureza requerida y una estimacin del tama*o de
molculas de ADN necesarios. +reparacin de una biblioteca genmica requiere ,-- a "--
mg de ADN de alto peso molecular !ms de ,-- --- pb de longitud$, esencialmente
desprovista de la contaminacin de prote&nas. Anlisis de transferencia (outern de un
gen de copia .nica requiere / a ,- mg de eucariota, el ADN genmico por un solo carril de
gel. %a pureza y el tama*o de este ADN no es tan cr&tica como lo es para la preparacin de
la biblioteca genmica. ADN de /- --- a ,-- --- pb es suficiente para la mayor&a de
aplicaciones con pureza logrados por mtodos de aislamiento de ADN estndar. 0na sola
reaccin de +)1 requiere slo una cantidad muy peque*a de ADN !/- a /-- ng$ y puede
tolerar una cantidad considerable de prote&nas contaminantes. De eco, es posible lograr
la amplificacin por +)1 de ADN de una sola clula lisada.(in embargo, se debe tener
cuidado para eliminar el e'ceso de A1N de la preparacin de ADN, porque una gran
cantidad de A1N pueden inibir seriamente la reaccin de +)1.
2abla 3. espera que los rendimientos de ADN de procedimientos de purificacin de ADN a
gran escala de diferentes tipos de clulas
tipo de clula 4 el n.mero de clulas
a
4 ADN presente!5g$
b
4 ADN obtenido!5g$
c
4 1endimiento6 4 !5g$ +eso de la muestra
d
4 rendimiento de la purificacin !5g ADN 7 mg de la muestra$

8acteria 9.1)-.
-.
-9.$9.. -:.$-;. ;.$<. 3.$&. 1$:
2@lula Animal 1)-.
=
91.$&.. 9..$3.. 1.$;. 1.$-.. 3$=
Tejido animal 1)-.
;
91..$&... -...$9... 91$1. 1..$-... -$&
TeAido de la planta 1)-.
=
3..$39.. :.$;.. 9.$3. :..$&... ..-$-..
a.- nmero total de clulas aproximado que se utiliza en procedimientos de purifcacin
b.- cantidad total aproximada de ADN presente en el nmero indicado de las clulas
c.- cantidad total aproximada de ADN permite aislar de la muestra celular
d.- peso aproximado de la muestra de clulas a utilizar para la purifcacin de ADN