AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL Y EL RECONOCIMIENTO DE

NUESTRA DIVERSIDAD
Universidad Nacional
Hermilio Valdizn

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
E.A.P. AGRONOMA



















DOCENTE : Ing. MARIA GUTIEREZ SOLORZANO
CURSO : MICROBIOLOGIA Y NEMATOLGIA AGRICOLA
INTEGRANTES:
DURAN VILLANUEVA JORGE LUIS
HUARAUYA GERONIMO ADRIANO EDGAR
ESPINOZA FIRMA BEATRIZ
RODRIGUEZ ARTETA JAUN

AO/ SEMESTRE : tercero - VI
HUNUCO PER
2013-I
INFORME DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

MEDIOS DE CULTIVO
1. DEFINICIONES
(Eduardo y Teddy 1980: 33) sostienen las siguientes
definiciones:
MEDIOS DE CULTIVO
Son soluciones estriles que tienen macro y
micronutrientes, sustancias que permiten el crecimiento
de organismos.
Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin
de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para
realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de
cultivo elegido las muestras en las que los
microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar
colonias
LOS MICROORGANISMOS
Son los seres ms abundantes de la tierra, pueden
vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y
tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad
de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms
importantes para su desarrollo estn el carbono, el
oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno.
Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra
de factores de crecimiento especficos en forma de
suero, sangre y extracto de levadura entre otros.
CULTIVO
Es el producto del crecimiento de organismos o
grupos de organismos, establecidos con fines
experimentales o industriales.
CULTIVO PURO
Es la presencia de una sola especie de
microrganismo libre de todo contaminante, a esto que
tambin se le denomina AXENICO.

OBJETIVO
Aprender la clasificacin y uso de los medios de
cultivo.
Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente
la autoclave.
PROCEDIMIENTO
1) Sacar las proporciones.
2) Pesar sustancias.
3) Medir el agua destilada y trasvasarlo a matraz de
Erlenmeyer.
4) Homogenizar las sustancias ms el agua
5) Hervir, este proceso se realiza de acuerdo a que medio
se va a preparar.
6) Aadir y homogenizar las sustancias, hasta disolver las
sustancias.
7) Trasvasar a la botella.
8) Acondicionar el medio.
9) Rotular
10) Esterilizar (autoclave)
11) usar el medio de cultivo.



AGENTES SOLIDIFICANTES
1. AGAR-AGAR

(Eduardo y Teddy 1980: 34) refiere que el agar
agar es una gelatina vegetal, un polisacrido que se
extrae de las algas por medio del cido sulfrico
diluido a una temperatura de 80 C. La especie de
produccin comercial se extrae de las siguientes
especies: Gelidium corneum; gracillaria; gigartina y
pterocladia.

PROPIEDADES

(Eduardo y Teddy 1980: 35) indica las propiedades
del agar agar:

Se derrite a 80 -100 C. Tolera altas temperaturas
de esterilizacin sin descomponerse.
Se solidifica a 35 50 C.
Adquiere firmeza en medios de cultivos a
concentraciones de 1,5 a 2,0 %.
Se hidroliza a pH de 2 y pH 9. Su valor nutritivo
es casi nulo y contiene algunos factores de
crecimiento.

2. GELATINA
(Eduardo y Teddy 1980: 35) es una sustancia
derivada de huesos, ligamentos y piel de animales, por
ebullicin de cido clorhdrico diluido.




Propiedades
Se derrite a 37 C
Se solidifica a 20 a 25 C, usando 10 a 12 % en
solucin y tambin se derrite a esa temperatura.
Se descompone a 121 C y es digerida por los
microorganismos.
A pH extrema se hidroliza.
A pH cidos no se solidifica.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS
POR SU CONSISTENCIA:
1. Lquidos

(Eduardo y Teddy 1980: 35) indican que los medios
lquidos se usan en principalmente en el incremento de
bacterias, en la determinacin de sus propiedades
fisiolgicas, para el incremento masivo de bacterias y
hongos con fines de experimentales (generalmente bajo
agitacin) y para estudios de crecimiento de
microorganismos. Industrialmente tienen uso en la
preparacin de productos accesorios al crecimiento los
microorganismos, (cidos orgnicos, antibiticos,
etc.).

2. Slidos
(Eduardo y Teddy 1980: 35) tambin sostiene que el
uso de principal de medios solidos es para el aislamiento
de hongos y bacterias, y para su mantenimiento. Se prepara
en frascos, placas Petri y tubos de prueba.

SEGN SUS PROPIEDADES NUTRITIVAS
(Eduardo y Teddy 1980: 35) indican las siguientes
propiedades:
A. CARENTES DE NUTRIENTES
Agua
El agua es para el mantenimiento de bacterias en
estado latente e inmutable, o clamidosporas de fusarium
(el agua destilada en destiladores metlicos es a veces
toxico y letal para las bacterias; es preferible usar
agua desmineralizada o agua potable no clorinada).
Sustancias que son carentes de nutrientes:
Laboratorio
Cao
Destilatorio
Dicionizada
Agar agua (sustancia solida)
Nitrgeno lquido: componente para mantener y
preservar sustancias como semen de animales.

B. NUTRITIVAS

1. NATURALES
Constituyen nicamente de material vegetal natuarl

2. SEMISINTETICOS COMPLEJOS
El componente posee 50 % natural y 50 % de
sustancias qumicas.


3. SINTTICOS DEFINIDOS
Es qumicamente definido.

PROCEDIMIENTO EN LA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS
Se realiza el clculo de la proporciones para 500
ml de preparado del medio del cultivo, utilizando 1
litro de agua destilada.
1. Sacar las proporciones

A. PDA (PAPA AGAR DEXTROSA)
PAPA: 200 gramos.
DEXTROSA: 10 gramos.
AGAR - AGAR: 15-18 gramos.
EXTRACTO DE CARNE: 5 gramos.
AGUA DESTILADA: 1000 ml/ 1lt.

500 ml de preparado
Proporciones para preparado de 1 litro de medio
del cultivo
PAPA:

= .
DEXTROSA:

= .

AGAR - AGAR:

= . .


EXTARCTO DE CARNE:

= . .

PREPARADO DEL MEDIO DE CULTIVO

I. PDA (AGAR PAPA DEXTROSA).
PROCEDIMIENTO
1. proporciones para preparado de 115 ml.


PAPA:

= .
DEXTROSA:

= . .

AGAR AGAR:

= . .

EXTARCTO DE CARNE:

= . .



2. LAVADO, PELADO Y PICADO DE PAPA
FIGURA 1
FIGURA 2

3. PESADO DE SUSTANCIAS

FIGURA 3








4. MEDIR AGUA DESTILADA
FIGURA 4








5. HOMOGENIZAR EL AGUA MS LA PAPA
FIGURA 5













6. HERVIR: durante 30 minutos
FIGURA 6












7. COLAR: con gaza o tamiz ( si hubiera)
FIGURA 7













8. HOMOGENIZAR LA SOLUCIN DE PAPA MS OTROS COMPONENTES
QUMICOS, HASTA DISOLVER LAS PARTCULAS.

FIGURA 8


9. TRASVASAR: se transfiere del matraz a la botella antes
que se enfri el medio.

FIGURA 9










10. ACONDICIONAR: (con una torunda de algodn y sobre
ello sellarlo con parafilm)

11. ROTULAR












12. USAR




II. OMA (OAL MEAL AGAR)
(Sifuentes 1990: 9) es medio de cultivo adecuado
para Pythium sp, Phytophthora sp, Fusarium sp., Phoma
sp, y otros patgenos.
Ingredientes
Quaker: 20 60 g.
Dextrosa: 10 g.
Agar: 15 18 g.
Agua destilada: 1000 ml.

Para preparado de 100 ml.

1. CALCULO DE PROPORCIONES

Quaker: 20 1000
2

100
2

= 200 .

Dextrosa: 10 1000
2

100
2

1 .

Agar - Agar: 15 1000
2

100
2

15 .






2. PESO DE SUSTANCIAS
FIGURA 1


3. MEDIR AGUA DESTILADA







4. Medir el agua destilada






5. HOMOGENIZAR













6. HERVIR: este proceso tiene una duracin de 30 a
45 minutos, removiendo constantemente, para
evitar la ebullicin.


7. HOMOGENIZAR HASTA DISOLVER LAS OTRAS
PARTICULAS.


8. HOMOGENIZAR LA SOLUCIN DE PAPA MS OTROS
COMPONENTES QUMICOS, HASTA DISOLVER LAS
PARTCULAS.














9. TRASVASAR














13. ACONDICIONAR (con una torunda de algodn y sobre
ello sellarlo con parafilm).






14. ROTULAR



15. USAR













III. AGAR HARINA DE MAZ (AHM)
(Eduardo y Teddy 1980: 38) menciona que es til
para el aislamiento y esporulacin de algunas especies
de Phytophthora.

PROCEDIMIENTO
1) CALCULO DE PROPORCIONES

Harina de maz:
1000 20.
600
= .

Para dextrosa:
1000. 10.
600.
=

Para agar:
1000. 15.
600.
=

2) PESAR 2.6GR DE MAZ, 1.3GR DE DEXTROSA Y 1.95GR DE AGAR.
FIGURA 1





3) LUEGO EN UN ERLENMEYER ADICIONAR 130ML. DE AGUA
DESTILADA CON LA AYUDA DE LA PROBETA.







4) HOMOGENIZAR AGUA MS HARINA DE MAZ


5) HERVIR


6) ADICIONAR LA DEXTROSA Y AGAR.











7) HOMOGENIZAR HASTA QUE QUEDE UNIFORME.















8) TRASVASAR















9. ACONDICIONAR CON UNA TORUNDA DE ALGODN Y PARAFIL










10. ROTULAR









11. USAR




















IV. SABOURAUD
(Caedo 2004: 21) sostiene que es el medio de
cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales.
Sirve para el aislamiento y mantenimiento de hongos en
tubo inclinado. Debido a su composicin, los hongos
crecen exageradamente y esporulan bien.
Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse
otros agentes selectivos de crecimiento.
FORMULACION

CUADRO N 01: Frmula gramos por litro
PEPTONA 5,0
TRIPTEINA 5,0
GLUCOSA 40,O
CLORANFENICOL 0,05
AGAR - AGAR 15,0
pH Final : 5,6 0,2
Fuente: Laboratorios Britnicos S.A. 2001

USO
Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y
conservacin de hongos patgenos y saprfitos.
Tambin es til para el cultivo de levaduras.
CARACTERISITCAS DEL CULTIVO

Medio de cultivo deshidratado: color beige claro,
homogneo, libre deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color mbar claro,
ligeramente opalescente sin precipitado.

RESULTADOS
En el siguiente cuadro se muestran las
caractersticas que tiene el medio de cultivo para el
crecimiento adecuado de los microorganismos.
Cuadro N 02: Crecimiento de los Microrganismos.
Microorganismos Crecimiento
Saccharomyces cerevisiae Bueno
Aspergillus niger Bueno
Candida albicans Bueno
Fuente: Laboratorios Britnicos s.a. 2001.

NOTA: mantener en lugar fresco, pues la exposicin
al calor aumenta la hidrlisis de los componentes.



PROCEDIMIENTO PARA EL PREPARADO ADECUADO DEL
MEDIO.


1. Calculo de proporciones
Para un
litro de agua
47 .

150


47 1000
2
0
150
2
0
= 7,05
2. Pesar sustancias








3. En un Erlenmeyer adicionar 150 ml de agua destilada.











4. Homogenizar el sabouraud ms agua destilada














5. Calentar hasta desaparecer las partculas








6. Trasvasar el contenido a una botella.












7. Acondicionar







8. Rotular


















CONCLUSIONES:
Al concluir la prctica se concluy en lo
siguiente:
Se logr conocer los diferentes medios de cultivos
para sembrar microorganismos.
Aprendimos los pasos para elaborar un medio de
cultivo, sus clculos respectivos de las cantidades
necesarias para su preparacin.
Se determin la importancia que tiene los medios
de cultivo en una investigacin en el campo agrcola
como en la medicina, industria alimentaria ya que
gracias a ello se puede hacer el aislamiento de
microorganismos tanto patgenos como benficos y as
identificarlos para su posterior uso.
Como estudiantes de agronoma gracias a la
prctica en el laboratorio de microbiologa
desarrollamos nuestros conocimientos en lo que respecta
a medios de cultivo y as poder aplicar en nuestra vida
profesional.








AISLAMIENTO DIRECTO
Objetivo general
Purificar hongos y bacterias.
Objetivos especficos
Aprender las tcnicas generales para separar a los
Hongos de los dems microorganismos.
Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.

Equipos
Cmara microboy
Cmara de incubacin
Horno microondas
Materiales
Muestra: Hoja
Medio de cultivo PDA
Mechero alcohol
Placa Petri
Vaso de precipitados
Matraz de Erlenmeyer
Alcohol de 96
Bistur
Pinza
Algodn
Papel toalla
Papel aluminio
Parafilm
Lapicero de tinta indeleble



EQUIPOS Y MATERIALES UTILIZADOS.
EQUIPOS:




MATERIALES:













CAMARA
MICROBOY
INCUBADOR
A
HORNO
MICROOND
AS
ALCOHOL
96
PLUMON
INDELEBLE
NEGRO
MECHERO
PDA PLACAS
PETRI
VASO
PRECIPITA
DO

PDA




NOTA: Cuando una enfermedad causada por hongos no
puede ser identificada fcilmente a travs de la
consulta bibliogrfica, o la produccin de signo en
cmara hmeda es necesario proceder al AISLAMIENTO.












BISTURI Y PINZA
HOJA DE ROSA
PAPEL
TOALLA
PROCEDIMIENTO
1. licuar el medio de cultivo (PDA) en el horno microondas
hasta que se disuelva, posteriormente se hace el proceso
de plaqueado.


2. Luego se procede a desinfectar la cmara microboy (parte
interna y externa), utilizando alcohol, para evitar la
contaminacin de los medios de cultivo durante el
aislamiento.









1 2
3. Lavar el material vegetal (hoja) con agua de cao.







4. En un vaso precipitado con contenido de alcohol
introducimos el material enfermo por 2 segundos.



5. Luego esterilizar el material vegetal enfermo con una
solucin de Hipoclorito de sodio por un espacio de dos
minutos.

4
6. Plaquear, se procede la siguiente manera: El matraz de
Erlenmeyer se destapa cerca del mechero, se flamea el
extremo del matraz por la llama y se vierte el medio de
cultivo a un medio estril, se vuelve a flamear el
extremo del matraz y se lo tapa nuevamente.


7. Realizar pequeos cortes de la zona de avance de la
infeccin, donde el patgeno est en activo desarrollo.












8. 4 pedacitos de igual tamao ms o menos de 1 cm deben
ser colocados en una placa Petri contenida con PDA en
forma de un cuadrado.









9. Acondicionarlo y utilizando un lapicero de tinta
indeleble se procede a la rotulacin.


10. Para concluir la prctica, incubar la placa de
Petri a 25C, aproximadamente de 4 a 5 das.




RESULTADOS:
11. A la semana siguiente a partir de los trozos
sembrados se observ la formacin de los micelios del
hongo, en funcin de los tipos de micelio desarrollados
ser el nmero de repiques a realizar para llegar a
obtener un cultivo puro.

























AISLAMIENTOS POR ESTRAS
Fundamento
(Garca y paredes 1994:78) sostiene que se
practica para obtener cultivos puros de muestras que
contienen flora polimicrobiana; es tambin til para
estudiar la morfologa y propiedades hemolticas de las
colonias asociadas.
Preparar el medio de cultivo ya sea: OMA; PDA;
BAUVERIA.

Esterilizar el anza de pt


Inocular Beauveria al medio de cultivo en forma de
estras, zig-zag

Esterilizar otra vez el anza de pt





Rotular

Sellar


Colocar las placas en bolsa de propileno




Acondicionar en la incubadora.


AISLAMIENTO CON LA ESPTULA DE DRIGASKY
Se realiza el mismo procedimiento del aislamiento
por estras solo que es con la esptula de drigalsky.
Preparar el medio de cultivo







Esterilizar la esptula de drigalsky

Inocular Beauveria al medio de cultivo en forma de
zig-zag


Esterilizar otra vez la esptula de drigalsky


Rotular
Sellar
Colocar las placas en la bolsa de propileno
Acondicionar en el autoclave















CONCLUSIONES
Una de las actividades ms apasionante del trabajo
con hongos es el aislamiento de hongos. Entre las miles
de especies que existen en la naturaleza el miclogo o
el cultivador necesita aislar una para poder trabajar
con ella.
Para el que se inicia en esta actividad es bueno conocer
las tcnicas ms usuales que le ayuden rpidamente a
desarrollar su intuicin y su habilidad. El aislamiento
de hongos de la naturaleza es uno de los primeros
aprendizajes que debe adquirir quin desee trabajar con
hongos.





















AISLAMIENTO POR SERIES DE DILUCION O DILUCIONES
SUCECIVAS
Se aprovecha la propiedad que tienen los medios de
cultivo con agar (medios slidos), de permanecer
lquidos a temperatura relativamente baja, lo que
permite la incorporacin de la mezcla microbiana, o
bien se realizan diluciones en solucin fisiolgica del
inoculo primario se vuelcan en cajas de Petri estriles,
se les agrega el medio de cultivo fundido a baja
temperatura.
El material incorporado se disemina por toda la
masa del medio de cultivo y una vez solidificado, quedan
los microorganismos inmovilizados y separados uno de
otro, originando colonias que se pueden contar.
Siembra por diluciones seriadas este mtodo
consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra
con el objeto de sembrar despus cantidades conocidas
de esas diluciones en capsulas de Petri.
Este mtodo nos permite conocer el nmero de
microorganismo viable. La viabilidad en microorganismo
se define como la capacidad del microorganismo para
multiplicarse en un medio de cultivo.
Dado es muy pequea una probabilidad de orden 0.05
cuando se siembra un gran nmero de tubos con un inoculo
de esta dimensin puede calcularse mediante la teora
de probabilidades que la fraccin que el tubo recibe el
organismo es 0.048: la fraccin que recibe tres
organismos es 0.00002. Como resultado de ello si un
tubo muestra algo de crecimiento, existe una elevada
probabilidad de que este en crecimiento sea el resultado
de la introduccin de un solo organismo disminuye
rpidamente a medida que aumente el nmero medio de
organismo en el inocuo
Por lo tanto es esencial aislar a partir de una
serie de tubos cuya gran mayora no muestre ningn
crecimiento.
Objetivo.
Que el estudiante conozca el aislamiento por dilucin
y otra forma para aislar microorganismos de tejido
vegetal enfermo, particularmente bacteria.
El mtodo de dilucin para el caso de bacterias ofrece
mayor sencillez y menor cantidad de contaminantes y es
uno de las maneras ms comunes en el aislamiento de
este tipo de microorganismos
Es inocular una serie de tubos con una suspensin
microbiana tan diluida que la probabilidad de
introducir siquiera un solo individuo dentro de un tubo
Materiales:
Matraz.
Erlenmeyer.
Tubos de ensayo.
Mechero de bunsen
Placa Petri.
Hipoclorito de sodio 1%Agua destilada
Esterilizada.
Pipeta.
Tubo de ensaye.
plstico adherente.
Material vegetal enfermo
Cmara de aislamiento.
Gradilla.
Cinta.
Tubos con caldo y agar Nutritivo
PROCEDIMIENTO
Limpieza (desinfeccin, del material)






Factores de inoculacin.
Temperatura.
Densidad de siembra.
Luz.
Nutricin.
Uniformizacin de inocuo(cantidad calidad)
Por diluciones sucesivas consiste en hacer
diluciones seriadas de la muestra o del inculo, sta
se utiliza cuando se tienen muestras lquidas agua, se
realiza haciendo diluciones a las muestras: 1:100, 1:1
000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilucin en
placas de Petri con medios de cultivo.

Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder
al examen macroscpico: morfologa de las colonias,
actividades bioqumicas o caractersticas.

METODOLOGA:
Manejo del asa bacteriolgica o de siembra:
30 Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2
edicin
Tcnica de siembra por diluciones sucesivas


ANEXO






BIBLIOGRAFA
Eduardo R, French y Teddy t Heber. 1980 Mtodos De
Investigacin Fitopatolgica. COSTA RICA.
Pedro Garca Y Fernando Paredes 1994.Microbiologia
Clnica (Practica) 2 Edicin. UNIVERSIDAD DE CADIZ.
Practica De Patologa Vegetal 1990. Universidad De
Murcia.
Vernica Caedo Teresa Ames Cip 2004. Manual De
Laboratorio Para Manejo De Hongos Entomopatgenos. Lima
Per.