Livro Crom 9

Alexandre Schuler
C
CCR
RRO
OOM
MMA
AAT
TTO
OOG
GGR
RRA
AAF
FFI
IIA
AA
A
AA G
GG
S
SS E
EE A
AA L
LL
Q
QQU
UUI
IID
DDO
OO

(detetores, aquisio de dados, validao e avaliao estatstica)

Nona Edio

2005

Alexandre Schuler
Professor Adjunto 4
Departamento de Engenharia Qumica
Universidade Federal de Pernambuco

C
CCR
RRO
OOM
MMA
AAT
TTO
OOG
GGR
RRA
AAF
FFI
IIA
AA
A
AA G
GG
S
SS E
EE A
AA L
LL
Q
QQU
UUI
IID
DDO
OO

(detetores, aquisio de dados, validao e avaliao estatstica)

Nona Edio

2005
Alexandre Schuler - Cromatografia
SUMRIO

1 - Introduo, 1

1.1. Histrico, 1
1.2. Classificao, 1

2 - Tipos de Processos Cromatogrficos, 3

2.1. Cromatografia de adsoro, 3
2.2. Cromatografia de partio, 4
2.3. Distribuio em contracorrente, 6
2.4. Cromatografia em fase lquida, 7
2.5. Fatores que influem na separao, 8
2.6. Cromatografia em fase gasosa, 12

3 - Tratamento terico da Cromatografia, 16

3.1. A equao de Van Deemter, 16
3.2. Fase estacionria, 16
3.3. Suporte, 17
3.4. Coluna, 18
3.5. Fase mvel, 18

4 - O Cromatgrafo, 20

4.1. O Cromatgrafo a Gs, 20
4.2. O Cromatgrafo a Lquido, 23
4.3. Detetores, 24

5 - Anlise Qualitativa, 32

6 - Anlise Quantitativa, 33

6.1. Introduo, 33
6.2. Medio de rea, 33
6.3. Mtodos de clculo, 35
6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo, 40

7. Otimizao do processo analtico, 41

7.1. Parmetros analticos, 41
7.2. Projetando um mtodo analtico, 43
Alexandre Schuler - Cromatografia 2
7.3. Validao de um mtodo analtico, 45

8. Tcnicas adicionais de identificao, 52

8.1 Tempo de reteno e reteno relativa, 52
8.2. ndice de reteno, 52
8.3. Equivalncia entre fases estacionrias, 53

Bibliografia, 54

Apndice 1 (Tnel do Tempo), 55

Apndice 2 (Caractersticas Bsicas dos Detetores), 59

A2.1. Sensibilidade, 59
A2.2. Nvel de rudo, 59
A2.3. Limite de Deteco, 59
A2.4. Faixa de Linearidade Dinmica, 60

Apndice 3 (Tcnicas de introduo da amostra), 61

Apndice 4 (Sistemas de aquisio de dados), 63

Apndice 5 (O desenvolvimento cromatogrfico), 64

Apndice 6 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 66

Apndice 7 (Estatstica), 70
Alexandre Schuler - Cromatografia
1 - INTRODUO

1.1. Histrico
1

Cromatografia um termo genrico, aplicado a um processo de separao fsico-
qumico, o qual baseado nos fenmenos de adsoro e partio. Este termo foi escolhido porque as
primeiras separaes foram realizadas com substncias coloridas. Entretanto, o processo
cromatogrfico no restrito a essa classe de substncias, constituindo-se na atualidade no mtodo
mais eficiente de separao, com aplicaes na Qumica Analtica Qualitativa e Quantitativa, para
compostos orgnicos e inorgnicos, independentemente de seu estado fsico.

1.2. Classificao

Um processo cromatogrfico envolve uma fase mvel e uma fase estacionria.
A fase estacionria um slido ou um lquido (Figura 1.1). No segundo caso, este fica
impregnado em um slido (suporte) e o fenmeno mais atuante a partio. No primeiro caso,
tem predominncia a adsoro. Assim, pode-se classificar a Cromatografia em dois tipos gerais:
Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.

Figura 1.1 - O Processo Cromatogrfico. A Fase Mvel transporta a amostra atravs da Fase
Estacionria. A velocidade mdia das partculas da amostra depende da sua natureza. Desse
modo, cada componente atingir o final da coluna em um instante diferente.

A fase mvel pode ser um lquido ou um gs. No primeiro caso, denomina-se o
processo de Cromatografia em Fase Lquida e no segundo caso de Cromatografia em Fase
Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Lquido e Cromatografia a Gs.

A Cromatografia pode ainda ser classificada em funo da tcnica empregada:

Cromatografia em Papel
Cromatografia em Camada Delgada
Cromatografia em Coluna Clssica

1
sugerida a leitura do Apndice 1 (Tnel do Tempo), para um breve histrico do desenvolvimento da Cromatografia.
Cromatografia em Fase Gasosa
Cromatografia em Fase Lquida de Alto Desempenho

Esta ltima mais conhecida pelas iniciais de seu nome em ingls (High
Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as seguintes
tcnicas:
Cromatografia de Permeao
em Gel (GPC)
Cromatografia de Troca Inica (IEC)

GPC (do ingls Gel Permeation Chromatography) empregada na anlise de
polmeros, enquanto a IEC (do ingls Ion Exchange Chromatography) empregada na anlise
de ons (ctions e nions).

Na realidade, este termo empregado quando a fase mvel um solvente orgnico. Quando a fase mvel gua ou
soluo aquosa, emprega-se o termo Cromatografia de Filtrao em Gel. O termo Cromatografia por Excluso de
Tamanho (em ingls Size Exclusion Chromatography) mais genrico e abrange as duas tcnicas.
2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRFICOS

2.1. Cromatografia de Adsoro

Adsoro um fenmeno fsico-qumico atravs do qual um slido
(adsorvente) fixa em sua superfcie um lquido ou um gs, por meio de interaes semelhantes s
foras de Van Der Waals. Chama-se coeficiente de adsoro relao

k
N
N
a
a
n
=

onde N
a
e N
n
so respectivamente o nmero de moles adsorvidos e no adsorvidos de uma
determinada substncia. Compostos diferentes possuem diferentes valores de k
a
, estes variando
com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vrios componentes
forada a passar atravs de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatogrfica), cada
componente necessitar de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse
intervalo de tempo denominado tempo de reteno (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de
Cromatografia por Adsoro. A substncia mais fortemente adsorvida mais dificilmente
arrastada pela Fase Mvel.

a) Cromatografia de Adsoro b) Cromatografia de Partio

Figura 2.1 - Diferena entre Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio.

2.2. Cromatografia de Partio

Se uma substncia adicionada a um recipiente contendo dois lquidos no
miscveis, ela se dissolver parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relao C
1
/ C
2
, onde C
1
e C
2
so as concentraes da substncia em cada um dos dois lquidos. Denomina-
se coeficiente de partio relao

k
C
C
p =
1
2

Se M
0
a massa total da substncia e M
1
a massa dissolvida no solvente 1,
podemos escrever
k
M
V
M M
V
M
V
V
M M
p =
1
1
0 1
2
1
1
2
0 1
( )

logo,
1 2
1
0 1 .
V k V
V k
M M
p
p
+
= (eq. 1)

Se a substncia estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M
1
a massa que
permanece neste solvente aps adio do solvente 2, o qual extraiu a massa (M
0
- M
1
). Se as duas fases
forem separadas (com auxlio de um funil de separao, por exemplo), a adio de outra quantidade do
solvente 2 vai extrair a massa (M
1
- M
2
), onde

M M
k V
V k V
p
p
2 1
1
2 1
=
+
. (eq. 2)

Substituindo na eq. 2 o valor de M
1
(eq. 1), fica

M
2
= M
o
[k
p
V
1
/(V
2
+ k
p
V
1
)]
2
(eq. 3)

possvel generalizar a eq. 3 para

M
n
= M
o
[k
p
V
1
/(V
2
+ k
p
V
1
)]
n
(eq. 4)

que d a massa M
n
que permanece no solvente 1 aps n extraes com o solvente 2. D-se ao processo
agora descrito o nome de extrao. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por exemplo, 2
componentes, com k k p p
'
, um dos componentes ficar preferencialmente no solvente 1 e o outro
no solvente 2. Assim sendo, medida que n cresce, cada fase ficar mais rica (mais pura) em um dos
componentes. No caso anterior (extrao), a poro de lquido 1 era sempre a mesma,
renovando-se apenas o lquido 2. Agora, ambos so renovados. O Esquema 2.1, onde o lquido 1
o superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado a nvel molecular na Figura 2.1.b. Sejam
duas substncias A e B, onde k
A
maior que k
B
. Isto significa que o lquido 1 vai se enriquecendo
de A e o lquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a cada etapa do processo. Os nmeros
da esquerda, em cada quadrcula
1
, indicam a frao de A e os da direita indicam a frao de B. Do
mesmo modo, os nmeros superiores indicam a frao de A e de B no lquido 1 e os inferiores
indicam a frao de A e de B no lquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades
iguais de A e de B, cujos coeficientes de partio valem, respectivamente, 3 e 1/3. A partir dos
valores de M
An
e M
Bn
, pode-se calcular a composio da mistura (ou o grau de pureza de cada
componente) em cada solvente, aps n etapas (n parties)
2
.

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

Esquema 2.1 - Distribuio (partio) de duas substncias (A e B), em dois lquidos (1 e 2)
no miscveis. Algumas fraes se juntam por terem mesma composio.

A partio, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo
cromatogrfico. O nmero de equilbrios (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n)
conhecido como o nmero de pratos tericos, prato terico sendo um ponto de equilbrio
(entre uma fase e outra). A distncia entre dois pontos de equilbrio consecutivos chama-se
altura equivalente a um prato terico (H). Os parmetros n e H sero novamente
discutidos mais adiante. Observe-se que se partindo de uma mistura contendo 50% de A e 50%
de B, obtm-se, respectivamente, nas etapas 1, 2 e 3, os seguintes percentuais (em massa) de A,
nas fraes superiores (solvente 1): 75%, 90% e 96,4%. Como o coeficiente de partio de B o
inverso do coeficiente de partio de A, os correspondentes percentuais de B (nas fraes

1
Cada quadrcula corresponde a um frasco de extrao (ex.: funil de separao).
2
No exemplo apresentado no esquema 2.1, as massas correspondentes a A e B, respectivamente, no solvente 1 do frasco
superior da ETAPA 3, so 0,422 g e 0,016 g, que correspondem a 96,35% de A e 3,65% de B.
inferiores, solvente 2) sero exatamente os mesmos. possvel inclusive calcular quantas etapas
sero necessrias para obter-se, por exemplo, uma pureza igual ou maior a 99%, bastando aplicar
a eq. 4. No caso, encontra-se n = 5.

IMPORTANTE ! Se k
B
tambm for maior que a unidade, a perda de B ser muito grande e tambm a
purificao de A ser muito demorada (exigir maior nmero de etapas).

2.3. Distribuio em contracorrente

O procedimento descrito a seguir um exemplo tpico de extrao lquido-
lquido. Na seo anterior foi demonstrado que uma substncia inicialmente dissolvida em um
lquido 1 pode ser extrada por um lquido 2, desde que os dois lquidos sejam imiscveis. Trata-
se de uma operao que feita manualmente, com auxlio de um funil de separao, e que pode
ser repetida at a exausto (literalmente !). O instrumento de Craig (ver Apndice 1),
constitudo de um conjunto de um grande nmero de tubos de distribuio de Craig, cada um
contendo uma certa poro do lquido mais denso (em azul escuro na Figura 2.2), a um nvel tal
que no passe para a cmara D atravs de C. Os diversos tubos so fixados, na mesma posio, a
um eixo (perpendicular ao papel, na figura). Adiciona-se ento a amostra (contendo, por
exemplo, duas substncias, como exemplificado na seo anterior) e o lquido menos denso (em
azul claro) ao primeiro tubo da seqncia (identificado com o n
o
1), estando os tubos na posio
mostrada em (a). Por rotao desse eixo (cerca de 45
o
), num movimento de vai-e-vem, promove-
se agitao da mistura (como se faria com um funil de separao) e em seguida deixa-se em
repouso por alguns instantes, para separarem-se de novo as duas fases. Finalmente, gira-se 90
o
,
de modo a colocar os tubos na posio (b). Nessa posio, o lquido menos denso flui atravs de
C para a cmara D. Aps alguns instantes, retorna-se posio (a), quando ento o lquido
menos denso, atravs de E, passa para B do tubo seguinte, atingindo a cmara A. Ento, comea
outro ciclo. A frao F
m,n
do soluto contido no m-simo tubo depois de n transferncias dada
pela seguinte expanso binomial:

1
2
n
p
m
p
n m,
V
V
1) k (
k
m)! - (n m!
n!
F
+
=

onde k
p
o coeficiente de distribuio, V
1
o volume do lquido menos denso e V
2
o volume
do lquido mais denso.


Figura 2.2 Esquema do Aparelho de Craig para distribuio em contra-corrente.

2.4. Cromatografia em Fase Lquida

O exemplo mais simples de cromatografia a lquido a separao em uma
camada delgada de slica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em Camada
Delgada). A Figura 2.3 ilustra o processo.

O lquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes
de uma mistura binria (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicao). Quando o solvente se
aproxima da outra extremidade da placa (2), esta removida da cuba que contm o solvente e na
qual estava parcialmente mergulhada, na posio vertical e a um nvel abaixo do ponto de
aplicao. As razes de frente, Rf
A
= d
1
/ d
3
e Rf
B
= d
2
/ d
3
so caractersticas de cada substncia,
dependendo da natureza da fase mvel e da fase estacionria. A Cromatografia em Camada
Delgada a mais empregada em Anlise Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da
pequena quantidade de amostra utilizada, menos indicada para fins preparativos, quando ento
se emprega a Cromatografia em Coluna Clssica. Neste segundo tipo de processo, a fase
estacionria colocada em um tubo de vidro (coluna cromatogrfica) colocado na posio
vertical. A coluna dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.4), que utilizada
para controlar a vazo da fase mvel, que desce por gravidade.

Fig. 2.3 - Cromatografia em Camada
Delgada.

Neste exemplo, a amostra contm
dois componentes, A e B, que so
identificados pelos respectivos valores de
Rf, por comparao com padres puros.
A necessidade de se controlar a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna, alm da
impossibilidade (naquela poca - anos 50) de se bombear um lquido com fluxo
constante e contnuo, levaram os projetistas a abandonar essa tcnica, passando a utilizar um gs
como fase mvel (1956).

Figura 2.4

Cromatografia
em Coluna
O ponto A indica o nvel da fase estacionria e o ponto A
indica o nvel da fase mvel. A diferena (A A) deve ser
mnima, para evitar a diluio do material a ser cromatografado, o
que resultaria em zonas (na Fig. 2.4, as faixas 1, 2 e 3) mais
largas. Ao se fazer a eluio (passagem da fase mvel), os
componentes afastam-se do ponto de aplicao (topo da coluna) a
uma distncia d tal que d/l = Rf (l o comprimento da coluna),
obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir da,
continuando-se a eluio, cada componente pode ser coletado
isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se
Volume de Reteno (V
r
) o volume de fase mvel necessrio para
a eluio completa de um componente. Desse modo, tem-se V
r
=
V
1
/ Rf, onde V
1
o volume ocupado pela fase mvel dentro da
coluna. Finalmente, pode ser calculado o volume total de solvente
necessrio para a eluio completa de todos os componentes da
amostra, que essencialmente igual ao V
r
do componente que sai
por ltimo (menor Rf). No Apndice 4, so discutidos mais
detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.

2.5. Fatores que influem na separao

Independentemente do processo envolvido na separao cromatogrfica
(adsoro ou partio), esta funo de uma srie de fatores, a saber:

Natureza da fase estacionria Vazo da fase mvel
Concentrao da fase estacionria Temperatura
Natureza da fase mvel Granulometria e geometria do suporte

A polaridade da fase estacionria um fator importante a se considerar. Em
princpio, quando se tem uma fase estacionria no polar, os diversos componentes da
amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de ebulio (Figura 2.5) e o processo
assemelha-se bastante a uma destilao. Quando a fase estacionria apresenta alguma
polaridade, essa ordem de eluio em funo do ponto de ebulio fica alterada (Figura
2.6) e s obedecida quando os componentes apresentam polaridade de mesma ordem de
grandeza (componentes A-C e D-G da Figura 2.7). Em alguns casos, a diferena de
polaridade pode ser equilibrada com a diferena de ponto de ebulio, fazendo com que
dois componentes distintos eluam juntos (Figura 2.8). Nesses casos, outros fatores podem
auxiliar na separao, como a ponte de hidrognio entre os componentes D-G da Figura 2.7.

FE: Esqualano (hidrocarboneto de baixssima polaridade)

FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)


A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2
o
C)

B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0
o
C)
Figura 2.5 Separao em funo da diferena
no ponto de ebulio
Figura 2.6 - Efeito da polaridade sobre a
separao cromatogrfica

A concentrao da fase estacionria lquida tambm influi na separao, como
pode ser observado na Figura 2.9. Alis, com o uso, normal diminuir a concentrao, por
arraste pela fase mvel, mesmo temperatura ambiente, de modo que colunas com fase
estacionria lquida possuem um tempo de vida til finito, que pode ser bastante curto, na
medida em que a temperatura da anlise se aproxima da temperatura limite, que por definio
situa-se 150
o
C abaixo da temperatura de ebulio da fase estacionria. Essa perda de fase
estacionria tambm acontece em HPLC, apesar de quase nunca se aquecer a coluna, porque a
imiscibilidade entre fase estacionria e fase mvel (agora um lquido) no infinita. Atualmente,
tm sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seo 3.2 - Fase Estacionria; p. 16).

Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros

A) n-nonano (154
o
C)
B) n-decano (174
o
C)
C) n-undecano (194
o
C)
D) etanol (78
o
C)
E) n-propanol (94
o
C)
F) n-butanol (118
o
C)
G)n-pentanol (132
o
C)
H) gua (100
o
C)
no polar, no forma ponte polar, ponte de hidrognio
mdia
polar, ponte de hidrognio fortssima

Figura 2.7 Efeito da ponte de hidrognio sobre a separao cromatogrfica

Outro fator importante, principalmente em HPLC, a polaridade da fase
mvel. Alis, esse o principal recurso para implementar uma separao (ver Gradiente de
Polaridade, na Seo 4.2; p. 24). Tambm a vazo da fase mvel muito importante na
separao. A Figura 2.10 ilustra a situao, que foi alvo de um estudo semi-terico realizado por
van Deemter (Captulo 3). A temperatura (a que est submetida a coluna) outro fator
determinante na separao, particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo Figura
2.11. Finalmente, a granulometria da fase estacionria slida (ou do suporte slido da fase
estacionria lquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, tambm influi na separao.

Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte ou da FE slida sobre a separao cromatogrfica

malha/polegada n
mx
H
mn
F
o
(mL/min)
60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
Dimetro externo = 1/8; comprimento = 4 m.

FE: Apiezon (um hidrocarboneto)

A Benzeno (ponto de ebulio = 80,2
o
C)
B ciclo-Hexano (ponto de ebulio = 81,0
o
C)

Figura 2.8 - Uma separao mal-sucedida

Figura 2.9 - Efeito da concentrao da fase estacionria sobre
a separao cromatogrfica.

onde: V
1
< V
2
< V
3
< V
4

Figura 2.10 - Efeito da vazo da fase mvel sobre a separao
cromatogrfica.


Figura 2.11 - Efeito da temperatura sobre a separao cromatogrfica.

O quadro apresentado a seguir sumariza a relao entre o efeito e o tipo de
processo:

TIPO FASE MVEL FASE ESTACIONRIA EFEITO SOBRE T
R
ADSORO G S DIMINUI
L S DIMINUI
PARTIO G L DIMINUI
L L NO ALTERA

2.6. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)

Na Cromatografia a Gs empregam-se colunas bem mais longas que aquelas
usadas em Cromatografia a Lquido. O princpio o mesmo, mas a fora motora a presso do
gs e no a fora da gravidade, de modo que as colunas normalmente so dobradas em espiral, a
fim de ocupar menos espao dentro do cromatgrafo. A Fig. 2.12 esquematiza um cromatgrafo
a gs e a Fig. 2.13 apresenta a fotografia de um cromatgrafo a gs moderno.

A amostra (gs, lquido ou slido em soluo) injetada (ver Apndice 2),
com auxlio de uma microseringa ou vlvula apropriada, no Injetor, que tambm o
Vaporizador (V) e os seus vapores so arrastados para o interior da coluna pela fase mvel
(gs de arraste). Na sada da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
para o Registrador (R). Como ser visto adiante (Detetores, p. 24), este sinal proporcional
quantidade de cada componente, o que permitir uma anlise quantitativa. Vale
acrescentar que a Cromatografia a Gs talvez o mtodo de anlise mais preciso. O sinal
eletrnico captado pelo registrador transformado num movimento da pena do mesmo.
Como o papel de registro est em movimento, obtm-se um grfico (Fig. 2.14) denominado
cromatograma.

Fig. 2.12 Esquema de um cromatgrafo a gs Figura 2.13 Cromatgrafo a gs.

Fig. 2.14 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.

As reas A
1
e A
2
sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.14 so
proporcionais s quantidades dos dois componentes na mistura. Distncia de Reteno (Dr)
a distncia, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeo (Incio) e o ponto
correspondente ao mximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z),
mas o tempo de reteno (Tr = Dr/z) uma caracterstica da substncia que varia com a
vazo da fase mvel, a natureza e a concentrao da fase estacionria e com a temperatura.
Por isso, o cromatgrafo possui controladores de vazo da fase mvel e da temperatura do
forno da coluna. A coluna (e conseqentemente a fase estacionria) pode ser substituda, at
encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Alm disso, existe uma vazo ideal para
cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.15). Assim sendo, a
temperatura da coluna o principal recurso disponvel para obter-se um mximo de separao
entre os diversos componentes da amostra.

Outro parmetro usado em CFG a Reteno Relativa (RR), que tambm
usado na identificao:

RR =
Tr
Tr
=
Vr
Vr
=
Dr
Dr
2
1
2
1
2
1

Essas relaes so equivalentes, desde que Vr
2
= F.Tr e F e z so constantes (F = vazo da fase
mvel).

Fig. 2.15 - Relao entre F e n ou H. F
i
a Vazo Ideal (os parmetros A, B e C so descritos na
Seo 3.1, eq. 6).

Obs.: Experimentalmente determina-se H por medio da distncia de reteno e aplicao das
equaes:

n = (4Dr/L)
2
e H = l/n,

onde l o comprimento da coluna e L a largura do pico na base. A Figura 2.16 ilustra o
procedimento. O parmetro n mede a eficincia de uma coluna cromatogrfica ( ver
Cap t ul o 3) .


Figura 2.16 - Procedimento para determinao
do nmero de pratos tericos.
As duas grandezas devem ser
medidas em milmetros (ou em
minutos ou segundos).

n = (4Dr/L)
2

3 - TRATAMENTO TERICO DA CFG

3.1. a equao de Van Deemter

Van Deemter estabeleceu uma equao emprica (eq. 6) que relaciona as
diversas variveis da Cromatografia a Gs com H (altura equivalente a um prato terico). Como
H igual a l/n e n mede a eficincia do processo, buscam-se condies em que o valor de H
mnimo:

= parmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.
d
p
= dimetro mdio das partculas do suporte.
D
g
= coeficiente de difuso da amostra na fase mvel.
= fator de correo para a tortuosidade dos canais entre partculas.
K = k.N
l
/N
g
; k = coeficiente de partio.
N = frao de fase estacionria (l) ou da fase mvel (g) dentro da coluna.
d
f
= espessura efetiva do filme lquido (pelcula de fase estacionria na superfcie do suporte).
D
l
=
coeficiente de difuso da amostra na fase estacionria.
v = velocidade linear da fase mvel.

A equao de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral

H = A + B/v + C.v (eq. 7)

que a equao de uma hiprbole (Fig. 2.15). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difuso da amostra em cada fase so
fatores que devem ser seriamente considerados, quando projetada uma coluna. Temperatura talvez
o fator mais importante, embora no aparea explicitamente na eq. 6. que K e D so altamente
dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na prtica que esta a varivel que mais influi na
resoluo, em Cromatografia a Gs, variando drasticamente a reteno relativa. De um modo geral,
o tempo de reteno depende da natureza da fase estacionria, da temperatura de operao e da vazo
da fase mvel.

3.2. Fase estacionria

A fase estacionria um slido (Cromatografia de Adsoro) altamente poroso
(mais de 150 m
2
/g), ou, mais comumente, um lquido (Cromatografia de Partio). No segundo caso, o
lquido depositado sobre um slido (suporte), que ser discutido mais adiante.
Interaes entre dipolos, polaridade e pontes de hidrognio so os principais
fatores, na fase estacionria, que determinam a separao cromatogrfica. Esses fatores so

(eq. 6)
dependentes da temperatura, da tambm a necessidade de um controle dessa varivel. Os
Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influncia da polaridade e da ponte de hidrognio sobre
a separao. Em ambos, como so usadas fases estacionrias polares, os picos aparecem na
ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 3.1.b, como a fase
estacionria (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrognio), o tempo de reteno deste
bastante aumentado (ver tambm Seo 2.5; p. 8).

Alto ponto de ebulio e inrcia qumica e cataltica (em relao amostra,
fase mvel e ao material de que constitudo o tubo da coluna) so os principais requisitos para
uma fase estacionria. Em relao a ponto de ebulio (PE) deve ser lembrado que a temperatura
limite para operao com uma dada coluna 150
0
C abaixo do PE da fase estacionria. Acima
dessa temperatura, a perda por volatilizao excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a
FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte mediante uma reao qumica.
As fases estacionrias mais freqentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicaes, so
polmeros derivados de silcio, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo.
Outra fase tambm bastante utilizada o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).

3.3. Suporte

O suporte tem a funo de fixar dentro da coluna a fase estacionria.
necessrio que o suporte seja quimicamente e tambm cataliticamente inerte. O material a ser
empregado tambm no pode exibir rea superficial maior que 50 m
2
/g, alta porosidade, nem
grande poder de adsoro. Centros ativos (cidos ou bsicos) podem provocar modificaes
estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomceas, graas sua baixa
capacidade de adsoro e sua baixa porosidade, so ainda bastante empregadas como suporte.
Um excelente suporte base de diatomcea comercializado com um nome constitudo da
palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, tm sido
desenvolvidos materiais sintticos, copolmeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. Outros
monmeros, como cianovinilbenzeno, tambm so empregados, para modificar a polaridade da FE. A
depender do processo de fabricao, esses polmeros tambm podem ser empregados como fase
estacionria (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom empacotamento, graas
uniformidade na granulometria e na prpria geometria das partculas. Tambm a porosidade
pode ser controlada na fabricao.

Figura 3.1 - Ausncia (a) e presena (b) de ponte de hidrognio entre FE e etanol

3.4. Coluna

O material de que constituda a coluna (tubo) pode ser ao inox 316,
alumnio, nquel, vidro ou teflon. Quando no se conhece o material a ser analisado, d-se
preferncia s colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover centros
cidos de sua superfcie) ou de teflon, sendo que esta ltima tem emprego mais restrito, devido
sensibilidade ao calor e presso. As colunas so classificadas quanto ao dimetro externo:

- Coluna microanaltica (capilar) ............ 0,1 a 0,5 mm
- Coluna analtica .................................. 1/8, 3/16 e 1/4
- Coluna semipreparativa ..................... 3/8, 1/2 e 5/8
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm

As colunas analticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de comprimento,
com 1.000 a 10.000 pratos tericos. Colunas capilares so bem mais longas. As primeiras capilares
fabricadas possuam mais de 100 m. Com o avano da tecnologia, o comprimento atual situa-se entre 20 e
40 m, embora com cerca de 100.000 pratos tericos. Tem-se notcia de uma coluna capilar com cerca de
1600 m de comprimento e 1 milho de pratos tericos.

Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas megabore)
com excelentes resultados. Mais simples de instalar, renem as qualidades das colunas analticas
e das capilares.

As colunas usadas em CLAD (seo 4.2, p. 22) so bem mais curtas (10 a 40 cm) e
os dimetros encontrados mais comumente no comrcio especializado variam entre 3 e 7 mm.

3.5. Fase mvel

Em CFG, a fase mvel um gs inerte, devendo apresentar-se bastante puro,
principalmente quando se tratar da anlise de traos. Os gases mais empregados so H
2
, N
2
, He,
Ar e Ne, podendo tambm serem utilizados outros, em casos especiais.
Na escolha da fase mvel (ou gs de arraste), devem ser considerados os
seguintes fatores:

- Disponibilidade/custo.
- Eficincia na separao.
- Efeito sobre o tempo de anlise.
- Segurana.
- Efeito sobre o sistema de deteco.
OBS.:
1 - A equao de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N
2
e H
2
, apresenta os
seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:

H
a
= 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N
2
)
H
b
= 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H
2
)

Esses dados comprovam a influncia da natureza do gs de arraste sobre a eficincia.

2 - A velocidade relativa de eluio aumenta na ordem H
2
< N
2
< He < Ar, fato que
demonstra a influncia da natureza do gs de arraste sobre o tempo de anlise.

A Tabela 3.1 resume a aplicao dos critrios acima mencionados, para seleo
da fase mvel em funo do detetor empregado.

Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor.

TIPO DE DETETOR GASES MAIS USADOS
(Ordem de prioridade)
Condutividade Trmica H
2
> He >> N
2

Ionizao de Chama N
2
> Ne > He
Captura Eletrnica N
2
> He

Em Cromatografia a Lquido empregam-se como Fase Mvel principalmente
gua deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleo depende do detetor a ser empregado e a
fase mvel deve ser imiscvel com a fase estacionria liquida.
4 - O CROMATGRAFO

4.1. O Cromatgrafo a Gs

A Fig. 2.12 (p. 13) representa esquematicamente um Cromatgrafo a Gs.
possvel agora descrever mais detalhadamente o instrumento.

a) Controles de Temperatura

O cromatgrafo dispe de termostatos para controle independente do
aquecimento dos trs principais setores: cmara de vaporizao ( o prprio injetor), forno
da coluna e bloco do detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistncia
eltrica localizada na base do forno, homogeneizado por um ventilador, que pode
permanecer ligado aps o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse
caso, o compartimento do forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que
possuam dispositivo de resfriamento automtico.

Figura 4.1 - Fluxmetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor

b) Controles Pneumticos

Os cromatgrafos a gs normalmente possuem uma vlvula controladora
de presso e outra para ajuste da vazo da fase mvel. Idnticos sistemas existem para o
controle da vazo dos gases auxiliares (ver seo 4.3.2.b; p. 25). A vazo medida com o
auxlio de um fluxmetro de bolha, ou bolhmetro (Fig. 4.1). A pra (parte inferior)
contm uma soluo de sabo lquido. Comprimindo-se a pra, o nvel do lquido sobe e
o gs forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazo, suficiente
marcar com um cronmetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados,
tornando obsoletos esses acessrios.
c) Coletor de Fraes

O coletor de fraes um acessrio utilizado em Cromatografia preparativa. O
material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de modo que uma
parte desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, condensado. Colunas de
maiores dimenses permitem a injeo de uma maior quantidade de amostra, permitindo assim a
produo de pequenas quantidades de um material com alta pureza (maior que 99,9999%), que
pode ser empregado como padro, por exemplo.

d) Detetores

Por ser necessrio um estudo mais detalhado, sero discutidos mais adiante.

e) Eletrmetro

O eletrmetro um amplificador de sinal. Este mdulo pode ser controlado a
qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado
independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode ser
atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os
Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relao real de reas e outro registro da
mesma amostra, com ampliao do primeiro sinal e atenuao do terceiro, ou mais exatamente,
atenuao menor para o primeiro e atenuao maior para o terceiro, em relao atenuao do
segundo. Logicamente, as reas medidas no segundo cromatograma, multiplicadas pelos
respectivos fatores de atenuao, fornecem os valores reais das reas relativas.

Cromatograma 4.1 - Mesma atenuao Cromatograma 4.2 - Atenuaes diferentes

f) Registrador

O registrador um instrumento acessrio, que transforma o sinal emitido pelo
detetor e amplificado pelo eletrmetro, em um sinal mecnico. Na extremidade do sistema
mecnico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da linha de
base, proporcional quantidade do componente na amostra. Como o papel est em
movimento, obtm-se uma curva (cromatograma), onde a distncia do incio da anlise
(ponto de injeo) ao mximo de cada pico a distncia de reteno (Dr). Dividindo Dr
por z (velocidade do papel), obtm-se o tempo de reteno, Tr. Idealmente, com
separao completa e condies timas (incluindo seleo perfeita da fase estacionria),
obtm-se uma curva simtrica. No Apndice 3 so discutidas outras tcnicas de aquisio
de dados.

g) Programador Linear de Temperatura

Quando a reteno relativa (RR) de alguns componentes prxima
da unidade (baixa resoluo); entretanto a temperatura de ebulio dos componentes
menos volteis muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da
anlise (temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de anlise e
obter um pico mais agudo para os ltimos componentes (o que inclusive diminuiria o
erro na determinao de Dr), acarretaria uma diminuio na j pequena reteno
relativa dos primeiros componentes. Em situaes como essa, pode-se aplicar um
gradiente de temperatura, com o auxlio de um Programador Linear de
Temperatura (PLT). A velocidade de aquecimento pode ser controlada, sendo
possvel tambm promover um aquecimento isotrmico em algumas regies. Em
operaes desse tipo deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (T
i
), a
temperatura final (T
f
), que no deve diferir da temperatura de ebulio da fase
estacionria em menos de 150
0
C, e a velocidade de aquecimento, para que o
cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.4).

Cromatograma 4.3 - Anlise Isotrmica.
Tempos de Reteno: 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3
(1,54 min), 4 (3,2 min) e 5 (4,1 min).
Cromatograma 4.4 - Anlise com PLT.
Tempos de Reteno: 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3
(1,54 min), 4 (2,9 min) e 5 (3,3 min).

4.2. O Cromatgrafo a Lquido

O cromatgrafo a lquido, mais comumente conhecido pela sigla inglesa da
tcnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em portugus: Cromatografia
Lquida de Alto Desempenho), um instrumento mais simples que o cromatgrafo a gs nos
seguintes aspectos (ver Figura 4.3a):

a) s possui um canal analtico, enquanto CGs podem ter at quatro canais;
b) modulado, isto , o sistema de bombeamento e o detetor so independentes, o que
facilita a substituio de detetores;
c) opera geralmente temperatura ambiente;

A Figura 4.3b um diagrama em blocos de um CL tpico. Cada bloco
descrito a seguir:

Figura 4.3a Cromatgrafo a Lquido
(HPLC).
Figura 4.3b - Diagrama em blocos de um HPLC.

a) Reservatrio de Fase Mvel

A Fase Mvel (um lquido puro ou uma mistura de composio definida) deve ser
filtrada em membranas com 0,46 m de dimetro de poros e desgaseificada (ver prximo item).

b) Sistema de desgaseificao

A Fase Mvel deve ser desgaseificada, para evitar a formao de bolhas, as
quais podem provocar cavitao (com conseqente dano bomba) ou gerar picos falsos, ao
passarem pela clula do detetor. So conhecidas vrias tcnicas de desgaseificao:

- aquecimento com agitao;
- borbulhamento de gs hlio;
- ultra-som;
- vcuo
c) Bomba

O bombeamento da Fase Mvel realizado por uma bomba controlada por um
microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de suco (para evitar vaporizao de fase mvel
mais voltil) e a vazo (importante quando a anlise realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo
caso h necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante).

d) Vlvula de injeo

A amostra sempre introduzida com auxlio de uma vlvula, porquanto a
presso de trabalho raramente menor que 50 atmosferas (Apndice 2).

e) Coluna

As colunas empregadas em CL so retas, uma vez que seu comprimento raramente
ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espao no equipamento.

f) Detetor

Os detetores utilizados em CL sero descritos na prxima seo.

g) Sistema de aquisio de dados.

Os sistemas de aquisio de dados empregados em CL so os mesmos
empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores (Apndice 3).

Gradiente de Polaridade

Quando o CL dispe de apenas uma bomba, evidente que a fase mvel tem uma
composio constante, do incio ao fim da anlise. Nessa situao, a polaridade da mesma tambm
constante. Diz-se ento que o processo isocrtico. Quando se dispe de duas bombas (ou mais),
possvel variar a composio da fase mvel, colocando-se em cada reservatrio um lquido de
polaridade diferente. O microprocessador altera a vazo de cada linha de lquido, de modo que a partir
do ponto de confluncia a vazo seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com
gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se utilizar os
Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 22) como ilustrao de um processo isocrtico de um processo com
gradiente de polaridade, respectivamente.

4.3. Detetores

4.3.1. Generalidades

Os detetores mais empregados so do tipo diferencial. A sua resposta (R), dada
pelas reas relativas dos picos, proporcional concentrao de cada componente (detetores de
condutividade trmica) ou velocidade de fluxo de massa do componente (detetores de
ionizao):

R = K .C R = K .
dm
dt
1 2

Dentre os detetores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os
seguintes: detetor de condutividade trmica (DCT), detetor de ionizao de chama (DIC) e detetor de
ndice de refrao (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicao.

A escolha do detetor importante e depende do material a ser analisado. As
principais caractersticas dos detetores, que devem ser consideradas quando da seleo do
detetor mais apropriado, so as seguintes (ver Apndice 1, p 56):

- Sensibilidade
- Nvel de rudo
- Resposta (Sinal)
- Faixa de linearidade dinmica
- Custo/vida til
- Universalidade
- Especificidade / Seletividade
- Limite de Deteco (relao
sinal/rudo).

4.3.2. Detetores empregados em Cromatografia a Gs

a) Detetor de Condutividade Trmica (DCT)

O sistema de deteco por diferena de condutividade trmica consiste de dois
pares filamentos (clulas para amostra e clulas de referncia), os quais fazem parte de uma
ponte de Wheatstone (Figuras 4.4a e 4.4b). O filamento pode ser de platina, nquel, tungstnio
ou ligas de tungstnio, como W/Re, normalmente coberto de ouro, para aumentar a resistncia
corroso. Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gs de arraste. No
momento em que a amostra atingir a clula correspondente, o filamento perder calor para a
soluo (gs de arraste + amostra). Como a soluo possui condutividade trmica diferente da
fase mvel pura, a temperatura do filamento alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistncia
eltrica. Essa variao na resistncia medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a
concentrao do material analisado, maior ser a variao na corrente e portanto maior ser o
sinal (R = K.C).

A sensibilidade de um detetor de condutividade trmica pode ser avaliada pela equao:

S = KI .
( )
. (T - T )
2
g - s
g
f b

(eq. 8)
onde:

S = sensibilidade (mV.cm
3
/mg)
K = constante da clula
g
= condutividade trmica do gs de arraste (cal/cm.s)
s
= condutividade trmica da substncia (cal/cm.s)
I = intensidade de corrente (mA)
R = resistncia do filamento ()
T
f
= temperatura do filamento (
o
C)
T
b
= temperatura do bloco (
o
C)

IMPORTANTE ! Se as clulas do detetor contiverem ar atmosfrico no momento em que o
circuito for energizado ocorrer queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o
gs de arraste.

Figura 4.4.a - Bloco do Detetor de Condutividade Trmica.

b) Detetor de Ionizao de Chama (DIC)

A figura 4.5 representa o circuito eletrnico de um DIC. R
v
uma resistncia
varivel, cujo valor depende do nmero de partculas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao
passar entre os eletrodos, ionizado. Nos DIC, a fonte de ionizao a chama resultante da
combusto de hidrognio com ar (gases auxiliares). A corrente contnua gerada pela fonte
(fonte CC, Fig 4.5.b) transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.5.a) por impurezas
existentes na fase mvel ou por partculas de fase estacionria lquida arrastada pela fase mvel,
por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta varivel e de sentido
contrrio, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da
amostra atinge o detetor, caso possua tomos de carbono e tomos de hidrognio, entrar em
combusto, sendo ionizado. Com a ionizao, aumenta a corrente de sada do coletor, o que ir
gerar uma tenso (V), a qual ampliada pelo amplificador eletromtrico e enviada ao
registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detetor depender da facilidade
relativa de ionizao de cada componente da amostra.


Figura 4.4b- Diagrama Eletrnico do DCT

Fig. 4.5.a- Estrutura fsica de um DIC

c) Detetor de Captura Eletrnica (DCE)

Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrrio
daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (R
v
). Uma
fonte de
3
H
-1
ou de
63
Ni ioniza as molculas do gs de arraste (N
2
), liberando os eltrons
responsveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substncia capaz de absorver esses
eltrons passar pelo detetor, haver uma queda na corrente, resultando num sinal que tambm
ser amplificado e enviado ao registrador.

Aqui, a sensibilidade do detetor depende da capacidade de absoro de
eltrons por parte dos diversos componentes da amostra.


Fig. 4.5.b- Circuito eletrnico de um DIC / DCE

d) Propriedades dos detetores

A Tabela 4.1 auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos detetores,
auxiliando no trabalho de seleo do detetor mais apropriado para uma anlise. O Apndice 5 descreve
outros detetores de uso menos extensivo, como o DNP e o DFC.

Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detetores empregados em CFG.

PROPRIEDADES DCT DIC DNP DCE
Limite de deteco 1 ppm 100 ppb 0,1 ppb 0,1 ppb
Faixa de linearidade 10
4
10
7
10
4
10
2

Vazo da fase mvel 1-10
3

mL/min
1-200
mL/min
10-100 mL/min 10-100 mL/min
Quant. Tpica amostra 1 - 40 L 0,05 - 5 L 1 - 5 L 1 - 5 L
Componentes
Detectados
todos orgnicos nitrogenados e
fosforados
halogenados
reas de aplicao uso geral orgnicos resduos de pesticidas resduos de
pesticidas

4.3.3. Detetores empregados em CLAD

Os detetores mais empregados em Cromatografia a Lquido de Alto
Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detetores so:

a) Detetores de ndice de refrao

semelhana do detetor de condutividade trmica, o detetor de ndice de
refrao o mais antigo, menos sensvel e o nico universal, dentre os detetores empregados em
CLAD. Baseando-se na diferena de ndice de refrao entre a fase mvel e cada componente da
amostra, conhecem-se dois tipos de detetores IR:

Os detetores tipo deflexo utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar
uma corrente contnua cuja intensidade proporcional ao ngulo de incidncia da
luz que atravessa a clula (Figura 4.6). Ao passar pela clula analtica uma substncia
com ndice de refrao diferente daquele da fase mvel, haver uma alterao no
ngulo de incidncia, resultando numa variao na intensidade de corrente, que
proporcional concentrao dessa substncia na clula e conseqentemente tambm
proporcional sua concentrao na amostra.

Figura 4.6 - Detetor de ndice de Refrao tipo deflexo.

Os detetores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado na Fig. 4.7
ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz refletida e a outra parte refratada. De acordo
com a Lei de Fresnel, a relao entre essas duas fraes funo do ndice de refrao. Assim, ao
passar uma substncia (transportada pela fase mvel) pela clula, altera-se o ndice de refrao e
portanto o percentual de luz refratada. Utilizando-se como fotodetetor um diodo sensvel
intensidade de luz, a corrente gerada por este ser alterada de um modo proporcional
concentrao dessa substncia na amostra.

b) Detetores de UV-VIS

Os detetores de ultravioleta-visvel (UV-VIS) baseiam-se na Lei de Lambert-
Beer, que estabelece uma relao linear entre Absorbncia e Concentrao:

A = . l . c

onde l o caminho tico (distncia percorrida pela luz dentro da soluo; espessura da clula).
A constante de proporcionalidade denomina-se absortividade molar. A absorbncia, por sua
vez, proporcional transmitncia, frao de luz transmitida.

Quando o contedo da clula (Fig. 4.8) transparente radiao empregada (UV
ou VIS), a transmitncia 100 % e evidentemente a absorbncia ZERO.

Entretanto, quando chega clula uma substncia que absorva essa luz, o
sistema de deteco mede a diferena em intensidade, gerando o cromatograma correspondente.

Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiao uma
lmpada de mercrio, cuja radiao monocromtica (discreta), com comprimento de onda de 254
nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de onda fixo (e nico). A Fig. 4.8
representa um diagrama esquemtico desse tipo de instrumento. Como a regio til da radiao UV
varia de 190 a 370 nm, de se esperar que mesmos os compostos que absorvem luz UV no venham a
ser detectados em um detetor do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se
conseguir uma varredura em toda a regio UV, primordial, evidentemente, que a fonte de radiao
possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte no monocromtica,
ou contnua). Para tanto, emprega-se a lmpada de deutrio. Nesse caso, o instrumento (UV varivel)
necessita de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a
amostra com uma luz monocromtica. Esse dispositivo chama-se monocromador. A seleo do
comprimento de onda pode ser manual (UV ajustvel). Nesse caso, comporta-se como um UV fixo,
embora possa ser selecionado qualquer comprimento de onda dentro da regio UV. Existe um outro
tipo de equipamento (UV de varredura), no qual a alterao do comprimento de onda automtica,
indo de um ao outro extremo da regio UV, num intervalo de tempo muito menor que o tempo de
residncia da amostra na clula analtica. Com esse equipamento, substncias que absorvam em
comprimentos de onda bem diferentes podem ser detectadas em uma nica corrida. Tambm existem
equipamentos que operam na regio visvel (400-750 nm), que empregam uma lmpada de tungstnio,
cuja radiao tambm contnua. Finalmente, existem equipamentos que operam em ambas as faixas
(UV-VIS).

Figura 4.7 - Detetor de ndice de Refrao tipo Fresnel.

Figura 4.8 - Detetor de Ultravioleta fixo

6 - ANLISE QUALITATIVA

O tempo de reteno (Tr) uma caracterstica fsico-qumica e como tal permite que
se faa anlise qualitativa, desde que se disponha de um padro. Na falta do padro, necessrio
coletar cada componente isoladamente e identific-lo por outros mtodos analticos; espectrometria,
por exemplo. Atualmente, so comercializados cromatgrafos (a gs e a lquido) cujo detetor um
espectrmetro de massas.

Quando uma amostra submetida anlise, preciso fornecer ao analista
alguns dados a respeito da mesma:

- Origem (de sntese, natural, etc ?);
- Componentes provveis (espcie, nmero);
- Composio quantitativa provvel;
- Solubilidade;
- Faixa de ponto de ebulio (amostra lquida);
- Outros dados relacionados com as variveis do processo.

Quanto maior for o nmero de informaes, mais rapidamente o analista
encontrar as condies ideais de anlise.

Como existe apenas uma vazo ideal para cada coluna, resta ao analista
procurar a coluna e a temperatura (ou programao de temperatura) ideais.

Existem outros modos de efetuar a identificao, os quais sero estudados mais
adiante (Captulo 8).
6 - ANLISE QUANTITATIVA

6.1. Introduo

Para se determinar a composio de uma mistura (Anlise Quantitativa) necessrio
medir as reas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem sempre o nmero de picos
igual ao nmero de componentes, pois alm da probabilidade de ocorrer superposio, alguns
componentes podero no ser detectados, o tempo de anlise poder ser inferior ao tempo de reteno
de um componente menos voltil, etc. O uso de uma referncia (padro) permite, contudo, determinar
a percentagem de um dado componente, mesmo que no apaream os picos dos outros componentes.

Antes de se efetuar o clculo da composio, entretanto, preciso fazer as correes
das reas, pois a relao das reas de dois componentes quase sempre diferente da relao entre as
suas massas (composio em massa). Isto porque a sensibilidade (Resposta) de um detetor a duas
diferentes substncias normalmente diferente.

Analisando a eq. 8 (p. 25), observamos que alm de outros fatores, a
sensibilidade dos detetores de condutividade trmica depende da diferena
g
-
s
. Como
s

varia de substncia para substncia, podemos dizer que uma mistura binria qualquer
contendo 50% de cada componente muito provavelmente ter uma relao de reas
diferente da unidade.

Com os detetores de ionizao de chama (e tambm com os de captura de
eltrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar eltrons)
varia de substncia para substncia. Alis, essa afirmao vale para qualquer outro tipo de
detetor, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Lquido.

Assim sendo, vale a pena repetir, necessrio primeiro determinar os fatores
de resposta para as reas e s depois efetuar o clculo da composio.

6.2. Medio de rea

A rea de um pico pode ser medida por vrios mtodos, a saber:

a) Com auxlio de um planmetro.
b) Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balana analtica).
c) Com auxlio de um integrador:

de disco (eletromecnico) ou
eletrnico

d) Determinao grfica:

i) S = h.L (triangulao) ou ii) S = h.L (meia-altura),

onde h a altura do pico, medida desde a linha de base at o pice do mesmo, L a largura na base
(distncia entre os pontos em que a linha de base interceptada pelas tangentes traadas nos dois
ramos da curva) e L a largura do pico na metade de sua altura, como se v na Figura 6.1. A unidade
de medida dessas grandezas deve ser o milmetro.

O planmetro um dispositivo mecnico, articulado. Na medida em
que se percorre o permetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura ao
final do permetro a rea do pico. O traado do integrador de disco mostrado
abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite determinar a rea com um
erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos outros mtodos, em torno de 0,5 - 1%,
bastante aceitvel para a maioria das finalidades. Dado o alto custo dos integradores,
principalmente os eletrnicos, muitos Laboratrios ainda utilizam o mtodo grfico.
Atualmente, encontram-se no mercado vrias verses de softwares (com a respectiva
interface), que substituem com muitas vantagens (inclusive de custo) os integradores
eletrnicos.

A utilizao do planmetro exige habilidade do operador, de modo que
o erro poder ser bem maior que 1% (a preciso normalmente baixa). O mtodo de
pesagem, por sua vez, pouco empregado em virtude de exigir a destruio do
cromatograma. Dentre os mtodos grficos (i e ii), o da meia altura (ii) recomendado
para os picos cuja linha de base no est bem definida e tambm por causa da
impreciso no traado das tangentes. Entretanto, a medio de uma largura L (da
ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma magnitude do erro da medida
de L (triangulao), de modo que os dois mtodos, em geral, podem ser considerados
igualmente precisos (ou imprecisos). A experincia indicar, em cada ocasio, qual
mtodo dever ser empregado.

Se os picos no esto completamente separados, a ponto de no se poder medir
a largura L, utiliza-se o mtodo i (S = h.L), medindo-se L do seguinte modo (Fig. 6.2):

1) Traar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas s as mostradas na fig. 6.2;
2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traar uma vertical at cortar a linha de base;
3) L
1
e L
2
so as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas reas so h
1
L
1
e h
2
L
2
.

Fig. 6.1 - Mtodo grfico para determinao de reas relativas em
cromatografia.

OBS.: Essa tcnica pode ser empregada tambm nos casos em que
A fica abaixo de L e denominada CORREO VERTICAL. Se o primeiro
pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o procedimento exatamente
igual. Por outro lado, na situao inversa, a medio da rea do segundo pico
feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda tcnica chama-se CORREO
TANGENCIAL. Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto
A estiver acima da tangente, procede-se a uma correo vertical entre os dois
pequenos.

Figura 6.2 - Correo vertical Figura 6.3 - Correo vertical Fig. 6.4 - Correo horizontal

6.3. Mtodos de Clculo

Os mtodos de clculo descritos a seguir j incluem a correo da rea.

a) Normalizao de rea

A seguinte relao vlida para um cromatograma dessa mistura:

C
A
A
. 100 i =
i
i
(eq. 9)

onde A
i
a rea do pico de um componente qualquer e A
i
a soma de todas as reas.
Evidentemente, necessrio que todos os componentes sejam detectados. Melhor seria
que suas reas fossem de mesma ordem de grandeza, pois em caso contrrio, pode haver
erro de exatido maior que o aceitvel. Alm disso, essencial que o detetor seja
igualmente sensvel a todos os componentes da amostra, seno haver fatalmente um erro

de exatido proporcional diferena de sensibilidade. Exemplificando: numa amostra
com dois componentes (50% de cada), se o detetor apresentar para o componente A o
dobro da sensibilidade apresentada em relao ao componente B, o resultado, aplicando
a eq. 9, seria: 33,3% de B e 66,7% de A.

Das trs restries apresentadas acima, a mais difcil de ser atendida a
terceira. Assim, a equao 9 deve ser empregada com bastante cautela, ou apenas como
uma primeira aproximao soluo do problema. Em seu lugar, pode ser empregada a
eq. 10, onde F
i
um nmero que gera reas (ditas corrigidas) que seriam obtidas caso o
detetor fosse igualmente sensvel a todos os componentes da amostra.

C =
A
A
. 100 i
c
c
i
i
(eq. 10)

onde A
ci
a rea corrigida de um componente qualquer e calculada com auxlio da eq. 11:

A
ci
= A
i
.F
i
(eq. 11)

e F
i
calculado experimentalmente a partir do cromatograma de uma mistura sinttica (soluo
padro) contendo todos os componentes da amostra real:

F
i
= C
i
/A
i
(eq. 12)

onde C
i
a concentrao de um componente qualquer e A
i
sua respectiva rea.

Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma mesma funo
qumica, os fatores de correo (tambm denominados fatores de converso - pois convertem
a rea em concentrao ou massa - ou fatores de resposta) so praticamente iguais. Assim,
admitindo-se que F
1
= F
2
= ... = F
n
= F, pode-se fazer F = 1 e a equao 10 simplifica-se,
transformando-se na eq. 9.

O caso geral (eq. 10) conhecido como Normalizao de rea com Fator de
Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 9) como Normalizao de rea sem Fator de
Resposta, ou simplesmente rea %.

b) Padronizao Interna

Para a determinao da composio de uma amostra pelo mtodo da
Normalizao de rea, necessrio que todos os seus vrios componentes sejam detectados (a
eq. 10 exige que sejam calculadas todas as reas: A
ci
). Entretanto, no fcil ter certeza
absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Alm disso, se apenas um
nico componente interessa ao analista, a sua determinao a partir de uma amostra com muitos
componentes traria dois outros agravantes:

i) Todo trabalho de medio e clculo dos picos de interesse.

ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de
reteno do componente de interesse.

Para resolver o problema (ii) o analista poderia usar um detetor que se
possvel s detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial ? A
resposta a essas questes est na adio amostra de uma substncia nova, com as seguintes
caractersticas:

- Solvel na amostra.
- Detectvel.
- Possuir Tr diferente de qualquer componente detectvel.
- No reagir com a amostra.

Essa substncia denominada padro interno.

Seja uma soluo padro contendo todas as substncias de interesse e o padro
interno (P
i
), cujas concentraes e reas sejam respectivamente:

A
i
e C
i
- um componente qualquer de interesse.
A
Pi
e C
Pi
- o padro interno.

O procedimento experimental pode ser descrito do seguinte modo:

a) prepara-se uma soluo padro (como no mtodo Norm%), mas contendo apenas os
componentes de interesse (sol. A);
b) em seguida, prepara-se uma outra soluo, onde o soluto ser o padro interno (ou uma
soluo de concentrao conhecida) e o solvente ser a sol. A (sol. B);
c) com cada amostra, segue-se o procedimento do item anterior, substituindo-se a sol.
A pela amostra (sol. C).
d) finalmente, injeta-se igual volume das solues B e C.

Observe-se que a concentrao do padro interno a mesma, nas solues B e
C. Assim, nos dois cromatogramas deve ser encontrada a mesma rea, para o padro interno,
posto que a massa injetada foi a mesma (ver p. 57 Linearidade). Caso essas reas sejam
diferentes, conclui-se de imediato que os volumes injetados no foram exatamente iguais. Como
o operador deve estar operando na regio linear (seno estaria cometendo um erro grosseiro),
vlida a relao:

A
pi
/A
pi
= V/V (eq. 13)

onde A
pi
e Api so, respectivamente, a rea do pico do padro interno na soluo padro (sol.
B) e na amostra (sol. C); V e V so, tambm respectivamente, o volume injetado do padro e da
amostra. A metodologia acima exigia que V e V fossem iguais. Entretanto, pode ter havido
algum erro na medio desses volumes e o que se pretende exatamente elimin-lo. claro que
outras fontes de erro foram introduzidas (preparao das solues B e C). Entretanto, com o uso
de uma boa tcnica de preparao dessas solues, o erro global pode ser bastante diminudo.

As relaes C
i
/A
i
= F
i
e C
Pi
/A
Pi
= F
Pi
do a resposta do detetor para qualquer
componente, inclusive P
i
. Numa mesma soluo, a relao F
i
/ F
Pi
constante. Logo:

(C
i
/A
i
) . (A
pi
/C
pi
) = K (eq. 14)

A adio do padro interno a uma amostra de concentrao desconhecida,
resulta em uma soluo para a qual so vlidas as mesmas relaes acima:

(C
i
/A
i
) . (A
pi
/C
pi
) = K (eq. 15)

Dividindo-se a eq. 15 pela eq. 14 e considerando a eq. 12, obtm-se:

C
i
= A
i
. F
i
. (A
pi
/A
pi
) (eq. 16)

OBS.: A preciso desse mtodo, bem como a do mtodo a, independe do erro de injeo,
mas a preciso de ambos depende do erro na preparao dos padres.

c) Padronizao externa

Mais prtico que o mtodo anterior e no necessitando tambm da deteco de
todos os componentes da amostra, o mtodo do padro externo, entretanto, depende do volume
injetado, de modo que sua preciso influenciada pelo erro de injeo.

Substituindo-se na equao 16 A
pi
/A
pi
por V/V (da eq. 13), tem-se:

C
i
= A
i
. F
i
. (V/V) (eq. 17)

Se o erro do operador na medio do volume injetado (mensurvel) for
considerado aceitvel, pode-se considerar que a relao V/V igual unidade. Nesse caso, a
equao 16 pode ser simplificada, resultando na eq. 18:

C
i
= A
i
. F
i
(eq. 18)

OBS.:
1. Os valores de F
i
, obtidos num determinado laboratrio, podem ser tabelados, ou
fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilizao das
anlises. Devido a alteraes na sensibilidade do detetor (variao na relao de
fluxo dos gases auxiliares no DIC, corroso, decaimento natural na fonte
radioativa do DCE, etc.), os valores de F
i
devem ser recalculados periodicamente.
O analista dever determinar experimentalmente a periodicidade.

2. O mtodo do padro externo (regra de trs simples) uma simplificao do
mtodo do padro interno (regra de trs composta), onde se faz V
ip
= V
ia
, onde
V
ip
o volume injetado de soluo padro e V
ia
o volume injetado da amostra.
Portanto, a preciso deste mtodo de clculo depende da percia do analista na
medio do volume a ser injetado.

d) Tcnica para fechar uma anlise

Muitas vezes necessrio fazer duas injees. Isso acontece quando uma nica
coluna no consegue separar todos os componentes e/ou um nico detetor no detecta todas as
substncias.

Considere-se o mtodo de Normalizao de rea e uma situao em que um
dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injees o volume
no foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas reas dos dois
cromatogramas fossem somadas diretamente.

No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os
componentes (1), (2) e (4) so quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2) aparece
nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas reas, nos dois cromatogramas (A
a2
e A
b2
) seriam
iguais. Na prtica, geralmente encontra-se A A a b 2 2 . Qualquer uma das reas correta, de
modo que A ou B pode ser tomada como referncia, indiferentemente. Tomando o cromatograma A
como referncia, tem-se:

A
A
a
b
2
2
= K (para corrigir as reas no cromatograma B)

A . F + A . F + A . K. F + A . F + A . F . K = A a1 1 a 2 2 b3 3 a 4 4 b5 5 ci
(eq. 20)

onde A
ci
qualquer termo do 1
o
membro da eq. 20 . A concentrao de qualquer componente
calculada a partir dessa equao.

6.4. Seleo do melhor mtodo de clculo

Para se decidir sobre o melhor mtodo de clculo para uma dada amostra, basta
responder s questes apresentadas no Esquema 6.1.

Esquema 6.1 - Critrios para seleo do melhor mtodo de clculo.

7 - OTIMIZAO DO PROCESSO ANALTICO

7.1. Parmetros analticos

Conforme foi visto ao longo dos captulos anteriores, muitos fatores influem no
processo cromatogrfico. Essa influncia no aleatria, podendo portanto ser controlada pelo
operador, com o objetivo de otimizar o processo de separao.

A Tabela 7.1 mostra a importncia do correto dimensionamento de uma coluna
cromatogrfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influncia do volume injetado sobre L
(largura do pico na base; ver Fig. 2.16, p. 15), n e H (ver Fig. 2.15, p. 14). O Grfico 7.1 mostra
a relao entre C e n
max
() e entre C e H
min
(), onde C a concentrao da fase estacionria. O
Grfico 7.2 mostra como esses parmetros (n e H) variam com o comprimento da coluna (l).

A temperatura (T) modifica o tempo de reteno (t
r
). A variao do t
r
com T
no linear. A relao
t
r
/ T

depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o Grfico
7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmaes. Finalmente, a Tabela
7.4 mostra que n
max
, H
min
e F
o
(vazo ideal) dependem inclusive da granulometria do suporte.

Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentrao da FE sobre a eficincia.

Coluna * Vazo Ideal
l (m)
C (%) m (g) F
o
n x 10
-3
H (mm)
(mL/min)
1
2
4
9
16
4
4
4
4
10
10
10
10
10
1
2
5
20
0,13
0,24
0,57
1,24
2,15
0,05
0,12
0,26
1,18
30+5
20+5
28+5
21+5
38+5
18+5
26+5
34+5
37+5
0,8
1,4
4,3
8,0
16,0
1,9
2,0
2,7
3,3
1,25
1,43
0,93
1,13
1,00
2,11
2,00
1,48
1,21

(*) a) Fase estacionria: Apiezon L; DE = 1/8; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh
b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.

Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.

Volume (L) L (mm) n H (mm)
0,5
1,0
1,5
2,0
7
9
11
12
15.800
9760
6800
5270
1,01
1,64
2,35
3,03

Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de reteno

Composto 70
o
C 100
o
C 130
o
C 160
o
C
n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68
n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77
n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35
n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00

A partir dessas informaes possvel estabelecer, por exemplo, para uma
coluna com 1/8 de dimetro externo (coluna analtica), que:

Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, n
max
funo linear de l.
O valor de n
max
aumenta, quando diminui a granulometria do suporte.
O valor de n
max
varia com C, sendo mximo quando C = 12 %, para suporte com faixa de
granulometria de 60-80 mesh ( malhas por polegada linear; equivale a um dimetro de
partcula de 175-230 mm).
A faixa de vazo ideal no varia com a temperatura.
O tempo de reteno diminui de maneira no linear com o aumento da temperatura; a
relao t
r
/ T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura considerado.

7.2. Projetando um mtodo analtico

Para se projetar um novo mtodo analtico por cromatografia, so necessrias
vrias avaliaes, relacionadas a seguir:

Seleo do tipo de cromatgrafo (a gs ou a lquido);
Seleo do detetor, em funo dos compostos a serem analisados e de suas concentraes;
Parmetros de funcionamento do detetor;
Seleo da coluna:

natureza da Fase Estacionria (e sua granulometria, caso seja slida);
dimenses da coluna (comprimento e dimetro);
concentrao da Fase Estacionria (FE), natureza e granulometria do suporte, no caso
de FE lquida;

Seleo da temperatura (ou programao de temperatura) para a coluna, no caso de CFG;
Seleo do Gradiente de Polaridade, se necessrio, no caso de CFL (HPLC);
Determinao do Limite de Deteco (LD) e da Faixa de Linearidade Dinmica (FLD);
Determinao dos Fatores de Resposta;
Determinao das demais condies de anlise: volume injetado, tcnica de injeo,
atenuao (se no dispuser de sistema de integrao), temperatura do vaporizador (em CFG)
e do detetor e vazo da fase mvel (ou gradiente);
Concentrao dos componentes na soluo padro, natureza do solvente empregado e
tcnicas de amostragem e de preparao da amostra e da soluo padro;
Mtodo de clculo utilizado;
Nmero mnimo de determinaes em paralelo e erro mximo (reprodutibilidade);
Avaliao do erro estatstico global, associado s diversas operaes (preparao de
solues, tcnica de amostragem, tcnica de injeo e medio de rea); expresso do
resultado final;

Observaes:

a) na seleo do detetor, verificar se o material a ser analisado detectvel por ele e se o
seu Limite de Deteco compatvel com a faixa de concentrao de interesse (ver, por
exemplo, a Tabela 4.1 na p. 28);
b) na avaliao dos erros estatsticos, considerar todas as operaes envolvidas, tais como pesagem,
medio de volume, diluio, tcnicas de amostragem e de injeo, etc;
c) para clculos estatsticos, utilizar o Apndice 6 (ver Seo 7.3).;

d) em relao aos diversos mtodos de clculo, lembrar que:

Mtodo prep.
Padro
prep.
Amostra
injeo comp. no
detectados
altura
(1)

rea % No No No Sim Sim
Norm % Sim No No Sim Sim
P. Ext. Sim No Sim No No
(2)

P. Int. Sim Sim No No No
(2)

Sim significa fonte de erro; No significa no fonte de erro.
(1) como medida da rea; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentrao.


Tabela 7.4 Efeito da granulometria do suporte sobre a eficincia

Malha/polegada n
mx
H
mn
F
o
(mL/min)
60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
D.E. = 1/8; l = 4 m; C = 10 %

7.3. Validao de um mtodo analtico

7.3.1. Objetivo

A identificao por Cromatografia (a gs ou a lquido) feita por
comparao dos tempos de reteno, para uma dada substncia, entre uma soluo padro e a
amostra. Entretanto, sabido que num determinado sistema cromatogrfico (Fase Mvel,
Fase Estacionria e Detetor), mesmo empregando-se como fluxo da Fase Mvel aquele
considerado ideal (de acordo com os experimentos de van Deemter), no nula a
probabilidade de outro componente da amostra apresentar o mesmo tempo de reteno que o
da substncia de interesse. Validar um mtodo analtico consiste em garantir que nas
condies analticas, a substncia-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de reteno.
Evidentemente um mtodo validado deve ser operacionalizado atravs de um manual
(Norma), o qual determina condies padronizadas que garantam a sua
repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado mtodo analtico
validado para um determinado tipo de amostra no necessariamente vlido para outro tipo
de amostra (ex.: dosagem de um princpio ativo existente em um determinado medicamento
versus a mesma determinao nas vsceras do cadver de uma suposta vtima de
superdosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter outras substncias tambm
passveis de ser detectadas no mesmo tempo de reteno do analito e que no tenham sido
includas na pesquisa de validao.

7.3.2. Conceitos

Com o objetivo de garantir uma correta compreenso deste texto, so apresentados
a seguir os termos tcnicos aqui empregados, com suas respectivas definies.

Nome notao descrio
Analito Substncia-problema.
Amostra Qualquer material, independentemente de
sua origem, que contenha o analito.
Padro O analito, comercializado com alta pureza.
United States Pharmacopea USP Farmacopia Americana. Fonte de consulta.
Concentrao c Concentrao do analito (ou do padro).
Soluo Estoque SE Soluo do padro a alta concentrao
(pode ser guardada por alguns meses,
dependendo da natureza da substncia).
Soluo Intermediria SI Soluo do padro, necessria para se
chegar Soluo de Trabalho.
Soluo de Trabalho ST Soluo do padro com concentrao
semelhante ao que se espera da amostra.
Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentrao em que existe
relao linear com a rea do pico.
Curva de Calibrao Curva construda com os dados da Faixa de
Trabalho.
Coeficiente de Correlao r Parmetro que mede a preciso com que a
Curva de Calibrao relaciona as reas com
as respectivas concentraes. usado para
avaliar o fim da regio linear na construo da
FL.
Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo as
concentraes usuais da amostra.
Limite de Deteco do
Equipamento
LDE Concentrao mnima detectvel do analito
no extrato injetado.
Limite de Deteco da
Amostra
LDA Concentrao mnima detectvel do analito na
amostra.
Limite Efetivo LE Concentrao mnima do analito que
corresponde a um erro mximo aceitvel.
Seletividade

Capacidade de separar a substncia-problema
dos demais componentes da amostra.
Resoluo Rs Mede a seletividade.
Preciso Aval i a a r epet i bi l i dade ou a
reprodutibilidade de um mtodo analtico,
por medida da 1
a
ou da 2
a
estimativa do
desvio-padro (Apndice 6).
Exatido Grau de fidelidade com que o resultado
exprime o valor real da concentrao do
analito. Avaliado com auxlio do teste t
1
(de
Student), por comparao com uma soluo
padro (Apndice 6).
Recuperao Nos casos em que se faz uma extrao,
necessrio determinar o percentual de
extrao e sua repetibilidade. Recomenda-
se que a soluo padro seja submetida
mesma operao.
Repetibilidade Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, num mesmo Laboratrio,
com o mesmo equipamento e mesmo analista.
Ver Preciso.
Reprodutibilidade Mede a disperso dos resultados obtidos por
repetio da anlise, em diferentes Laboratrios,
diferentes equipamentos ou diferentes analistas.
Usa o teste F (Apndice 6).
Consistncia Mede a influncia sobre a repetibilidade, das
diversas operaes constantes do mtodo.
Robustez Mede a influncia sobre a Reprodutibilidade,
das diversas operaes constantes do mtodo.

7.3.3. Procedimento

a) Seletividade / Identificao

A principal fase do trabalho aquela em que testada a confiabilidade da
identificao. Isso inclui a determinao do tempo de reteno de toda e qualquer substncia que
possa eventualmente existir na amostra, quais sejam:

impurezas de sntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poder ser bastante penoso);
impurezas de degradao (essas informaes podem ser obtidas de estudos shelf-life);
excipientes, conservantes, aditivos e outros princpios ativos constantes da formulao (no
caso de associaes);

Deve ser lembrado que a identificao pura e simples por cromatografia (mtodo
no validado) no tem valor cientfico. Assim, o ideal, o recomendado mesmo, associar tcnica
cromatogrfica, a tcnica de Espectrometria de Massas. Essa associao pode ser manual, atravs da
separao fsica, por coleta na sada da coluna, seguida da obteno do espectro de massas. A
identificao pode ser ainda complementada com auxlio de outra tcnica analtica, como a
Espectrometria de Ressonncia Magntica Nuclear, Espectrofotometria no Ultravioleta-Visvel ou a
Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem cromatgrafos (CFG ou HPLC) acoplados
a um espectrmetro de massas, o qual substitui o detetor tradicional do cromatgrafo. Embora os
exemplos aqui apresentados sejam tpicos da indstria farmacutica, os diversos procedimentos
so igualmente aplicveis a qualquer outro tipo de amostra. De um modo geral, produtos de
sntese (de uso farmacutico ou no) podem ter seu mtodo analtico validado sem auxlio da
espectrometria (embora seu emprego d maior credibilidade validao). Por outro lado,
qualquer outro material (inclusive de uso farmacutico) exige a associao de mtodos
espectromtricos. J se sabe que a eficincia (n) de uma coluna diretamente proporcional ao
tempo de reteno. Portanto, quanto maior for o tempo de eluio, maior ser a sua eficincia.
Assim, a seletividade pode ser medida como a razo dos tempos de reteno:

= tr
1
/tr
2

Essa relao tambm denominada reteno relativa (RR; p. 12) ou ainda fator de separao (FS) e
demonstra-se que equivalente s relaes dos coeficientes de partio:

= kp
1
/kp
2

Entretanto, esse critrio algo insatisfatrio, posto que colunas com diferentes eficincias podem
apresentar mesmos fatores de separao, conforme pode ser visto na Figura 7.1.a,b. Por isso, em
vez da seletividade, emprega-se a resoluo (Rs), como medida efetiva da capacidade de
separao:

Rs = 2(tr
2
tr
1
)/(L
1
+ L
2
)

ou seja, a resoluo igual diferena entre os tempos de reteno dividida pela mdia das
larguras na base (Figura 2.14, p. 14). bvio que a resoluo diminui com o alargamento do
pico e evidentemente tambm diminui se a cauda, resultante de uma interao excessiva com a
fase estacionria, bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformao do pico deve ser
considerada quando da seleo da coluna. Chama-se fator de deformao ou fator de assimetria
(TF, do ingls tailing factor) a relao:

TF =
BC
AB

onde a distncia BD igual a 10 % da altura do pico ( DE). Alguns especialistas
1
acreditam que
o TF mximo admissvel 3.

Figura 7.2 Pico com cauda (deformao)

Figura 7.1 Resoluo a) baixa; b) alta

b) Detalhamento da Metodologia

A metodologia analtica inclui todos os parmetros explicitados na Seo 7.2 (p. 43).

c) Avaliao estatstica

Para realizao dos testes estatsticos, sugere-se que qualquer operao
(preparao da soluo padro, tomada de alquotas, etc) seja realizada em triplicata (ou mais) e
que cada soluo obtida seja injetada pelo menos cinco vezes. Nesses casos, deve ser empregada
a 2
a
estimativa do desvio-padro (s
R
; Apndice 6). A 1
a
estimativa (s) s deve ser empregada em
conjuntos de dados com mais de 10 itens.

d) Exemplo

A seguir, apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operao. Para este exemplo,
foi selecionada a aspirina, que comercializada em vrias formas, sendo selecionado como amostra o
comprimido. A aspirina (cido acetilsaliclico) produzida industrialmente a partir do cido saliclico:

1
A Farmacopia Americana (USP) mede o segmento AC a 5% da altura do pico, calcula TF dividindo AC por duas
vezes AB e estabelece 2 como TFmax.

Desse modo, de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante
comum no produto (AAS). Conseqentemente, o AS uma das substncias que devem ter seu
tempo de reteno medido, para verificar se coincide ou no com o do AAS.

Uma vez completada a etapa de identificao (vale repetir: confirmao de que
nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de reteno
do AAS), parte-se para as avaliaes estatsticas.

i. Condies analticas:

Cromatgrafo a lquido modelo CG 480E, com detetor de ultravioleta CG 437B.
Comprimento de onda: 254 nm.
Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 m; temperatura ambiente.
Fase Mvel: H
2
O:Metanol:cido Actico (52,5:46:1,5); 1,5 mL/min (isocrtico).

Preparao das solues padro (para AAS e AS):

A soluo estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais solues foram de 200
mg/100 mL, 100 mg/100 mL, 20 mg/100 mL, 10 mg/100 mL e 5 mg/100 mL.

Preparao da amostra:

A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alquota
pesando 55 mg (10% do peso mdio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da
fase mvel, com auxlio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 m).

Injeo da amostra: vlvula Rheodyne, com loop de 20 L.

ii. Faixa de Linearidade e Limite de Deteco

As solues padro foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluda foi
injetada dez vezes. A partir das mdias das reas obtidas, foram construdas as respectivas Faixas de
Linearidade (Grficos 7.4 e 7.5), onde se evidencia que as massas injetadas conforme prescrito em
Preparao da amostra permanecem dentro da regio linear. O rudo (medido com atenuao
mnima necessria para uma altura no inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por comparao com a
mdia das alturas dos picos das dez injees da soluo mais diluda resultou em um Limite de
Deteco (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.

0 500 1000 1500 2000
0,0
2,0x10
2
4,0x10
2
6,0x10
2
8,0x10
2
r = 0,99996
r
e
a

d
o

p
i
c
o
Concentrao (mg/L)
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
r = 0,99999
r
e
a

d
o

p
i
c
o
Concentrao (mg/L)
Grfico 7.4 FLD do AAS. Grfico 7.5 FLD do AS.

iii. Preciso e expresso dos resultados

A partir dos dados (reas) das dez injees da soluo mais diluda referida no
item ii acima, pode ser calculado o erro analtico (de repetibilidade) e a partir deste (no
exemplo, foi 1,2%), determinar a forma correta de expresso do resultado (forma esta vlida para
ambos os compostos):

Re = X 0,01 mg/L
8 TCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAO

8.1. Tempo de reteno e reteno relativa

A identificao feita tradicionalmente atravs da medio do tempo de
reteno (t
r
). Entretanto, a essa forma de medio est associado um erro, decorrente de uma
natural variao no tempo transcorrido entre a injeo e o acionamento do sistema de registro.
Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relao ao tempo de reteno. pequeno demais, na
maioria das vezes. Mas h casos em que a diferena de t
r
entre dois componentes dessa mesma
ordem de grandeza. Em tais casos recomendvel o emprego da Reteno Relativa (RR). Um
dos componentes tomado como referncia (RR = 1) e as RRs dos demais so calculadas com
auxlio da relao:

RR
b
= t
rb
/t
ra
,

onde t
ra
e t
rb
so, respectivamente, os tempos de reteno da referncia e de outro componente.

8.2. ndice de reteno

Outro parmetro utilizado para identificao, o ndice de Reteno (I
r
)
determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) com
duas parafinas normais com n e m (m = n + 1) tomos de carbono, desde que:

V
rn
< V
ri
<V
rm
onde V
r
= volume de reteno = F.t
r

A relao:
I
ri
= 100 [(Log V
ri
Log V
rn
) (Log V
rm
Log V
rn
)] + 100 n

pode ser substituda por:

I
ri
= (Log D
ri
Log D
rn
) (Log D
rm
Log D
rn
) + 100 n

Nesse sistema, assume-se que:
I
r(H2)
= 0,00 e I
rn
= 100 n

Padres para determinao do I
r
:

a) como visto acima, as parafinas normais so, por definio, padres primrios, com I
r
= 100n.

b) em qualquer srie homloga com mais de 5 tomos de carbono, o I
r
cresce de 100
unidades para cada CH
2
adicional e no influenciado pela temperatura. Esses
compostos podem, portanto, ser utilizados como padres secundrios.
8.3. Equivalncia entre fases estacionrias

conhecida a relao = I I
r
p
r
n
i i
, onde I
r
p
i
e I
r
n
i
so, respectivamente, os
ndices de reteno de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionria no
polar tomada como referncia (geralmente esqualano), medidos a uma mesma temperatura. Essa
relao permite avaliar a influncia, na separao, da fase estacionria e de grupos substituintes
presentes na molcula da substncia considerada.

McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco
compostos como referncia e associou o somatrio dos seus valores de I com a polaridade da
fase estacionria, chegando a classificar centenas de fases estacionrias. A Tabela 8.1 apresenta
alguns exemplos (observe-se que as FEs esto colocadas em ordem crescente de polaridade). Os
valores de I, denominados constantes de McReynolds, foram determinados a 120
o
C. Os valores
de I
r
para os cinco compostos, com a fase estacionria esqualano, so: benzeno, 653; n-butanol,
590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e piridina, 699. Por comparao entre os nmeros
de McReynolds de duas diferentes fases estacionrias, possvel concluir se as mesmas so
equivalentes ou no. possvel tambm prever como melhor uma separao, comparando-se a
natureza de duas substncias-problema com duas das cinco substncias tomadas como
referncia.

Tabela 8.1 Valores do Nmero de McReynolds (I) para algumas fases estacionrias.

FASE VALORES DE I
ESTACIONRIA A B C D E I
Esqualano
(*)
0 0 0 0 0 0
Nujol 9 5 2 6 11 33
Apiezon L 32 22 15 32 42 143
SE-30 15 53 44 64 41 217
SE-52 32 72 65 98 67 334
Hallcomid M-18 OL 89 280 143 239 165 916
QF-1 144 233 355 463 305 1500
Carbowax 20M 322 536 368 572 510 2308
Diglicerol 371 826 560 676 854 3287
DEGS 492 733 581 833 791 3430
TCEP 593 857 752 1028 915 4145

BIBLIOGRAFIA
(*)

1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.
2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gs. Ed. Edgard Blcher Ltda., So Paulo, 1985.
3. Ciola, R. Tpicos em Cromatografia a Lquido. Inst. Cientficos C. G. Ltda., So Paulo, 1984.
4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.
5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.
6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.
7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.
8. Schuler, A. Caderno de Prticas de Cromatografia. Depto. Eng. Qumica/UFPE, 1994.
9. Randerath, K. Thin-Layer Chromatography. Verlag Chemie Academic Press, USA, 1968.
10. Lederer, E. e Lederer, M. Chromatography. Elsevier Publishing Co., London, GB, 1953.
11. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold Co., New York, USA, 1967.
12. Treybal, R. E. Liquid Extraction. McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, USA, 1951.
13. Wilcox, Melissa J., Lab South America, Guide 1999/2000, GB, p. 19-22.

(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaborao deste texto e recomendada
queles que pretendem se aprofundar na matria.
APNDICE 1

Tnel do Tempo

A inteno deste texto apresentar uma seqncia cronolgica dos fatos mais
importantes que marcaram o desenvolvimento da tcnica cromatogrfica, at os tempos atuais.
Mais do que apresentar uma lista exaustiva, pretende-se to somente dar ao leitor uma
compreenso geral da histria da Cromatografia.

Reza a lenda que um pesquisador, trabalhando em seu laboratrio com uma soluo
contendo uma mistura de corantes, acidentalmente molhou sua vestimenta. Para sua surpresa, no
lugar de uma mancha mais ou menos circular e de cor uniforme (igual da soluo), surgiram
crculos concntricos, cada um com uma cor diferente das demais, como na figura abaixo. De
algum modo esse fato teria ficado registrado, tendo servido de sugesto para Tswett (ver adiante)
resolver seu problema analtico. Isso teria acontecido no sculo XIX.

Em 19 de maio de 1872 nasceu em Asti, uma pequena cidade
localizada no norte da Itlia, filho de Simon Tswett (russo) e Marie
Dorroza (italiana), Mikhal Semenovitch Tsvet. Registrado como de
nacionalidade russa, Mikhail Tswett (grafia mais usual na literatura)
mudou-se em 1875 com o pai (a me falecera pouco aps o seu
nascimento) para Lausanne e depois Genebra (Sua), onde passou toda
a sua infncia e juventude, graduando-se em 1893 em botnica pela
Universidade de Genebra, doutorando-se em 1896 na mesma universidade. Nesse mesmo ano mudou-
se para a Rssia, como professor de botnica em escolas privadas na cidade de So Petersburgo
(Leningrado) e em 1901 mudou-se para Varsvia (Polnia), sendo contratado pela Universidade de
Varsvia, onde trabalhou at 1915. Com a invaso alem, durante a 1
a
Guerra Mundial, Tswett fugiu
para a Rssia, refugiando-se em Moscou. Em 1917 tornou-se professor de botnica e Diretor do Jardim
Botnico da Universidade de Jourjeff, em Dorpat (Tartu). No incio de fevereiro os alemes ocuparam
Jourjeff e fecharam a Universidade. Mais uma vez Tswett se mudou, dessa vez
para Voronej, aonde veio a falecer, debilitado pela tuberculose, no dia 26 de
junho de 1919, com 47 anos de idade. Em 1900, Tswett descobrira a razo da
cor verde das plantas, isolando as clorofilas A e B, xantofilas e
carotenides amarelos, entre outros pigmentos, em uma coluna de adsoro
contendo carbonato de clcio. ter de petrleo foi empregado como fase
mvel neste trabalho. Este primeiro trabalho (de uma srie de mais de
cinqenta) foi publicado em 1903, no volume 14 da revista cientfica Proc.
Warsaw Soc. Nat. Sci., Biol. Sec. Sua obra maior foi um livro, publicado
(em russo) em 1906, intitulado "Os cromfilos no mundo animal e vegetal",
no qual ele descreve com detalhes seu mtodo de separao de pigmentos. de Tswett a
seguinte definio: "Cromatografia um mtodo em que os componentes de uma mistura so
separados numa coluna de adsorvente num sistema em fluxo". Ele deu tcnica o nome de
Cromatografia, combinando as palavras gregas Khromatos (cores) e Graphos (descrever). Ele
acreditava que o processo de separao, de algum modo, tinha algo a ver com a cor da
substncia. Segundo suas prprias palavras, "como raios de luz no espectro, os diferentes
componentes de uma mistura de pigmentos, obedecendo a alguma lei, se separam numa coluna
de carbonato de clcio e podem assim ser qualitativamente e quantitativamente determinados. Eu
chamo tal preparao um cromatograma, e o mtodo correspondente o mtodo cromatogrfico".
Mais tarde, antevendo toda a potencialidade de sua inveno, afirmou: "... bastante evidente
que o fenmeno de adsoro descrito no se restringe aos pigmentos vegetais, mas devemos
aceitar que todos os tipos de compostos qumicos, coloridos ou incolores, esto sujeitos s
mesmas leis". Aps sua morte, ningum de imediato empregou a Cromatografia em suas
pesquisas. Um detalhe interessante que o nome tswett, em russo, significa cor. Algum chegou
a sugerir, como uma homenagem pstuma a Tswett, que o nome da tcnica fosse tswettografia.

Linha do Tempo:

1931 Khun e Lederer repetiram o trabalho de Tswett com clorofilas, xantofilas e
carotenos, rompendo o silncio de 22 anos. Logo em seguida, Brockmann,
Karrer, Winterstein e Zechmeister trouxeram suas contribuies.

1938 Reichstein realiza a primeira anlise de uma substncia incolor. Para visualizar as
zonas ocupadas por substncias incolores empregam-se reativos prprios,
designados como reveladores (Figura A1.1).

Figura A1.1 Cromatografia em Camada Delgada (diferentes formas de revelar).

1940 Wilson, Devault, Weiss, Glckauf, Martin e Synge
1
deram incio aos estudos tericos
da Cromatografia.

1
Archer John Porter Martin (19102002) e Richard Laurence Millington Synge (1914-1994).

1941 Martin e Synge introduziram a cromatografia de partio (com slica gel).

1943 Lyman C. Craig desenvolve um aparelho para extrao lquido-lquido, que pode
ser considerado um precursor do cromatgrafo e cujo funcionamento, descrito
adiante, auxilia no entendimento do processo cromatogrfico.

1944 Consden, Gordon e Martin inventaram a cromatografia em papel.

1947 Boyd, Marinsky, Spedding, Tompkins e outros realizaram pesquisas que conduziriam
mais tarde produo industrial de terras raras por cromatografia de troca inica.

1948 Lederer e Linstead aplicaram a cromatografia em papel a compostos inorgnicos.

1951 Kirchner introduziu a cromatografia em camada delgada.

1952 Martin e Synge desenvolvem a cromatografia a gs.

1956 Sober e Peterson prepararam as primeiras celuloses para troca inica e Lathe e
Ruthvan trabalharam com peneiras moleculares (naturais e modificadas) para
medidas de peso molecular.

1964 Moore desenvolveu a cromatografia por permeao em gel.

O aparelho de Craig

Lyman C. Craig (1906-1974), pesquisador da Universidade de
Rockefeller (New York, USA), desenvolveu um equipamento,
denominado Aparato de Craig, que promove a separao de misturas de
substncias atravs da tcnica de extrao lquido-lquido, conforme
descrito na pgina 6. Esse equipamento (Figura A1.2) foi bastante
utilizado em separaes (inclusive preparativas), antes do advento dos
modernos cromatgrafos. Craig inventou tambm um equipamento ainda
bastante empregado em laboratrios, o evaporador rotatrio, tambm
conhecido como rotavapor.


Figura A1.2 Aparato de Craig.
APNDICE 2

Caractersticas bsicas dos detetores

1. Sensibilidade

A sensibilidade de um detetor medida pela sua Resposta, que a magnitude
do sinal recebido pelo Sistema de Aquisio de Dados (Registrador potenciomtrico, Integrador
ou Software), sob a forma de rea do pico. Assim, quanto maior for a rea do pico de uma
mesma amostra, maior ser a sensibilidade do detetor empregado.

2. Nvel de rudo

O rudo uma caracterstica indesejvel dos detetores, ou melhor, de
qualquer dispositivo eletrnico. No caso do cromatgrafo, o rudo devido a um conjunto
de fatores, tais como:

- impurezas dos componentes eletrnicos - mau contato em cabos e conectores
- interferncias na rede eltrica - sangramento da coluna
- defeitos em circuitos eletrnicos - contaminao na vlvula de amostragem
- contaminao no septo da coluna - contaminao no detetor
- vazamento de fase mvel - contaminao na coluna

Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende no s
da qualidade do produto, mas tambm de suas caractersticas prprias. Assim, existe um
nvel mnimo de rudo que no pode ser removido. Evidentemente, um pico com altura
igual do rudo no poder ser reconhecido como tal. O rudo faz com que a linha de base
no seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traado mostrado na Fig. A2.1.

Fig. A2.1. Linha de base com rudo.

3. Limite de Deteco

Limite de Deteco (LD), ou Quantidade Mnima Detectvel (QMD),
como o prprio nome o diz, a massa mnima injetvel que produza um pico que possa ser
identificado como tal. Por definio, LD uma massa cujo pico tenha uma altura igual ao
dobro da altura mdia do rudo (h
r
, Fig. A2.1).
4. Faixa de Linearidade Dinmica
Entende-se por Faixa de Linearidade Dinmica (FLD) o intervalo
compreendido entre a Quantidade Mnima Detectvel (QMD) e a massa mxima injetvel cuja
Resposta ainda seja linear. A Fig. A2.2 ilustra a situao. A linha vermelha compreende a
regio linear. Alguns detetores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto outros apresentam
linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com massas altas (DCT, DIR),
enquanto outros s apresentam linearidade a altas diluies (DCE, DUV). Para se determinar a
FLD de um detetor, em relao a um determinado composto, necessrio preparar solues
dentro do intervalo de interesse e montar um grfico equivalente ao apresentado na Fig. A2.2.
Em seguida, o analista deve calcular o coeficiente de correlao (r; Apndice 6) para todos os
pontos e depois recalcular o coeficiente de correlao aps retirar, sucessivamente, os pontos n,
(n-1), (n-2), etc, at que o valor de r permanea estvel e prximo da unidade. No tendo havido
erro grosseiro na preparao das solues, nas injees, nem nas medies de reas, deve-se
encontrar um valor de r maior ou igual a 0,999.

Figura A2.2 Faixa de Linearidade Dinmica.

APNDICE 3

Tcnicas de introduo da amostra

Tradicionalmente a amostra (slido em soluo, lquido ou gs) introduzida
com auxlio de uma microseringa (Figura A3.1). Em Cromatografia a Gs (CFG), exceto com
colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3 a 5 microlitros (L),
sendo que o erro de medio inversamente proporcional ao volume.

Figura A3.1 Microseringa para amostras lquidas em CFG

Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras tcnicas: seringa
especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminao ou diluio da amostra
com ar), que utilizada quando a amostra no est pressurizada e a vlvula injetora de sete
vias (Figura A3.2).

Em Cromatografia a Lquido (HPLC), a amostra (lquido ou slido em
soluo) introduzida com auxlio de uma seringa numa vlvula equivalente vlvula da
Figura A3.2, sendo do tipo rotativa e resistente alta presso empregada neste tipo de
equipamento. Ambas as vlvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que varia de
umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 2 mL (CFG).

No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume mximo injetvel
muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 L). Alm disso, o dimetro das
mesmas to pequeno ( 0,53 mm) que a injeo no pode ser feita diretamente na coluna, como
acontece com as colunas de maior dimetro (CFG). Nesses casos, necessrio um injetor
especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, dissolvida na fase mvel e esta soluo sofre
uma diviso (divisor pneumtico), de modo que 1/100 ou uma frao ainda menor realmente
enviada para a coluna, enquanto que o restante descartado.


Figura A3.2.a Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio carga)

Figura A3.2.b Vlvula de injeo de amostra gasosa (posio injeo)
APNDICE 4

Sistemas de aquisio de dados

Mesmo na atualidade ainda so empregados registradores para a aquisio
dos dados cromatogrficos. Qualquer que seja o detetor empregado (CFG ou HPLC), o sinal
gerado pelo mesmo uma tenso (corrente contnua). Trabalhando-se com registrador, obtm-se
um grfico (cromatograma), com auxlio do qual so medidos os tempos de reteno e as reas
dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho muito grande e o erro s vezes bastante
expressivo (5 a 10 %).

O integrador eletromecnico realizou uma verdadeira revoluo na
Cromatografia, particularmente em laboratrios de Controle de Qualidade, acelerando e
aumentando bastante a preciso do trabalho analtico (erro da ordem de 0,5 %).

Com o desenvolvimento da eletrnica, alguns registradores passaram a ser
comercializados com um integrador eletrnico cujo registro grfico era igual ao do integrador
eletromecnico, de modo que no houve diminuio visvel no erro de integrao, pois a leitura
continuava sendo analgica. Mas logo em seguida surgiram os verdadeiros integradores
eletrnicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a rea medida. Os clculos eram ainda
realizados pelo analista, embora com uma preciso na integrao (medida da rea) da ordem de
0,001 %. A Segunda gerao de integradores veio complementar o trabalho. Aps a integrao,
o equipamento, utilizando o mtodo de clculo previamente selecionado pelo analista, realizava
a operao final, chegando a imprimir a concentrao na unidade desejada. Esses equipamentos
denominam-se integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o
cromatograma, em tempo real, utilizando os recursos de correo vertical e correo
tangencial e inclusive realizando clculos ps-anlise (geralmente em BASIC), alm de
automatizar o acionamento de vlvulas. Na realidade esses integradores de ltima gerao so
computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnolgica, decretou o fim
desses equipamentos.

Na atualidade, os laboratrios de cromatografia esto substituindo os
integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxlio de um
microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a mesma
eficincia, a um preo bem menor, alm de poderem monitorar at quatro cromatgrafos de um
modo totalmente independente.
APNDICE 5

O desenvolvimento cromatogrfico

As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuio das
partculas slidas (fase estacionria slida ou suporte, no caso da fase estacionria lquida) dentro de
uma coluna empacotada e o processo de separao a nvel molecular (pictoricamente). Na Seo 2.2
(p. 4) dado um pequeno tratamento matemtico ao processo de separao por partio, quando ento
h referncia a etapas ou pontos de equilbrio. Entre as pginas 7 e 8 oferecida uma pequena
discusso a respeito do que acontece numa coluna de cromatografia clssica (fase estacionria slida),
quando se faz referncia a uma coluna desenvolvida. No final da Seo 2.6, ao discutir as Figuras 2.15
(p. 14) e 2.16 (p. 15), feita referncia ao nmero de pratos tericos (n), como medida da eficincia
(capacidade de separao) de uma coluna cromatogrfica. Finalmente, no Captulo 3 (p. 16),
apresentada a equao de van Deemter e seus diversos parmetros so discutidos.

O processo de separao cromatogrfica pode ser analisado, por analogia,
como uma destilao fracionada. No projeto de uma coluna de destilao contnua, o engenheiro
qumico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a retirada de fraes
de diferentes pontos de ebulio. Numa destilao em batelada no existem essas bandejas, mas
evidentemente o clculo o mesmo. Como no existem pontos de remoo ao longo da coluna,
tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto de ebulio. O mesmo acontece com
a cromatografia. A diferena que outros fatores tambm interferem no processo, tornando-o
mais complexo, porm tambm mais completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de
destilao contm cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas
centenas ou mesmo milhares de bandejas (pratos tericos).

Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partio (ou de
adsoro), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase mvel, com uma
velocidade mdia diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionria (ou menor
com a fase mvel), maior ser o coeficiente e portanto maior ser seu tempo de residncia
(tempo de reteno) na coluna, ou seja, menor ser sua velocidade mdia. O material eludo
comporta-se como um pisto mvel, com concentrao mxima nas proximidades da parte
central e distribuio de concentrao quase gaussiana. medida que o tempo passa, a largura
do pisto aumenta (por efeito da difuso), de modo que se o tempo de eluio for muito grande,
os picos coalescem e a separao ser incompleta (ver Figura 2.10, vazo V
1
, na pgina 11). Por
outro lado, se o tempo for muito curto, (vazo V
4
da Figura 2.10), pode ser insuficiente para
permitir separao completa. Esse raciocnio levou elaborao da equao abaixo, para o
clculo da eficincia de uma coluna cromatogrfica (Fig. 2.16, p. 15):

n = (4Dr/L)
2

Pictoricamente, uma mistura de trs componentes apresentaria o
comportamento mostrado na Figura A5.1 e a distribuio de concentrao (ou de massa) de cada
componente mostrada na Figura A5.2. Observe-se que a Figura A5.2 no um cromatograma.
A substncia que sai primeiro da coluna a primeira a atingir o detetor. Do mesmo modo, a
primeira poro de cada componente a atingir o detetor a da extremidade direita (na Figura).
O cromatograma, por outro lado, traado da esquerda para a direita (neste livro). Assim,
enquanto a Figura A5.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma correspondente mostraria
uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada componente.

Figura A5.1 Desenvolvimento cromatogrfico de uma mistura. Figura A5.2 Distribuio de massa.
APNDICE 6

Outros detetores empregados em Cromatografia

1. Detetor de Nitrognio e Fsforo (DNP)

O DNP um detetor utilizado em cromatografia a gs e foi projetado
especificamente para a deteco de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) ao nvel de
traos (concentraes da ordem de ppb). Tambm conhecido como detetor termoinico, o DNP
utiliza uma eletrnica (e o prprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os mesmos
gases (Nitrognio como fase mvel e Hidrognio e Ar Sinttico como gases da chama). O
polarizador contm uma pastilha alcalina e a razo de fluxos dos trs gases (que diferente para
compostos nitrogenados ou fosforados) insuficiente para produzir chama, mas o potencial
eltrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 1
4
-10
5
a sensibilidade
do detetor frente a esses compostos, relativamente a outros compostos. Devido a essas
caractersticas, o DNP dito seletivo para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente
para solues extremamente diludas, sendo portanto ideal para a deteco de traos de
pesticidas organo-nitrogenados e organo-fosforados.

2. Detetor Fotomtrico de Chama (DFC)

O DFC basicamente um detetor de ionizao de chama, no que diz respeito
ao hardware. Entretanto, a deteco baseia-se na absoro da radiao emitida pelo enxofre (e
tambm pelo fsforo e ainda outros elementos) na regio visvel do espectro eletromagntico.
Trata-se portanto de um espectrofotmetro, obedecendo assim Lei de Beer. A radiao emitida
pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de onda desejado (394 nm para
o enxofre e 526 nm para o fsforo). Para compostos contendo um desses elementos, sua
sensibilidade da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo portanto indicado para a deteco
de traos (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados.

3. Detetor de ons

At os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas no era empregada na
anlise de ons (ctions e nions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em paralelo
de um reagente complexante poderia transformar o on em um derivado (na sada da coluna),
colorido, o qual seria detectado num espectrofotmetro (ex.: detetor UV-VIS).

A separao cromatogrfica de ons, no discutida neste livro, ocorre numa
coluna contendo uma resina trocadora de ons apropriada, tratando-se portanto de uma tcnica
bastante antiga, mais largamente empregada na purificao de guas (deionizao). O
equipamento , em ltima anlise, um HPLC tpico.
Para evitar o trabalho de derivao, foi desenvolvido um detetor especfico, o
detetor de ons, que , em ltima anlise, um condutivmetro. Consta de um par de eletrodos
contidos numa clula termostatizada. Aplica-se um campo eltrico entre os eletrodos. O efluente
da coluna passa pela clula, variando a resistncia R entre os eletrodos, de acordo com a Lei de
Ohm. A condutncia (L) inversamente proporcional resistncia e medida em Ohm
-1
. Essa
unidade atualmente denomina-se Siemens (smbolo S). Quando a distncia entre os eletrodos
de 1 cm, tem-se:

k = L/A

onde k a condutncia especfica e A a rea do eletrodo. Por outro lado, a condutncia
equivalente (C
e
) relacionada com a condutncia especfica como:

C
e
= 1000 k/c

onde c a concentrao do on em equivalente-grama/L.

4. Detetor de Fluorescncia

O Detetor de Fluorescncia, utilizado em HPLC, equivalente a um Detetor de
Ultravioleta. A nica diferena consiste na localizao (ortogonal e no linear) em relao ao caminho
tico. Desse modo, captada apenas a radiao proveniente do processo de fluorescncia,
caracterstico de certas classes de compostos. Assim, substncias que no fluorescem podem existir na
amostra sem interferir na deteco. Uma importante aplicao a anlise de aminocidos em materiais
biolgicos (ex.: teste do pezinho). Neste exemplo, os aminocidos so transformados em derivados
fluorescentes com o reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove
aminocidos podem ser analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternrio, com
limite de deteco menor que 10 mg/L.

5. Detetor Eletroqumico

O Detetor Eletroqumico, tambm utilizado em HPLC, basicamente uma clula
eletroqumica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela clula, oxidado (ou reduzido) pelo
potencial aplicado, gerando uma corrente eltrica que proporcional sua concentrao.

Existem dois tipos de detetores:

a) Detetor coulomtrico: a amostra passa atravs da clula. Desse modo, todo o
material oxidado (ou reduzido);
b) Detetor amperomtrico: a amostra passa pela superfcie do eletrodo. Assim,
apenas cerca de 1% a 5% do material realmente oxidado (ou reduzido).
Desenvolvido para detectar traos (ppb a ppt) de ons, este detetor exige alta
pureza de solventes e reagentes. A gua, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em
sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 m (membrana de nylon 66) e sua
resistividade deve ser ao menos 18,2 Mohm.cm. O fabricante inclusive aconselha que ao sair do
sistema Milli-Q a gua passe em coluna com fase mvel C
18
para extrao.

6. Detetor por Espalhamento da Luz com Evaporao

Surgiu recentemente no mercado um detetor para HPLC que se apresenta como
o detetor ideal. Este detetor, denominado Evaporative Light Scattering Detector (ELSD),
emprega o fenmeno de espalhamento (ou disperso) da luz, tambm conhecido como Efeito
Tyndall. Embora conhecido desde 1966, quando foi descrito por pesquisadores da Union
Carbide australiana, apenas em anos recentes comeou a ser comercializado. A grande vantagem
do ELSD sua universalidade (como o DIR) aliada a uma alta sensibilidade (como o DUV),
alm de apresentar resposta proporcional massa, no requerendo portanto a preparao de
soluo padro para calibrao, ou seja, no exige calibrao. Os Cromatogramas abaixo
ilustram bem a importncia desse detetor.

Cromatograma A6.1 Anlise de cidos graxos com: a) Detetor UV (215 nm) e b) ELSD.

O detetor de ndice de Refrao, embora universal, apresenta baixa sensitividade e no
pode trabalhar com gradiente de polaridade. O detetor de Ultravioleta, embora apresente um Limite de
Deteco muito mais baixo, somente detecta substncias que absorvam luz ultravioleta. Observe-se que no
Cromatograma A6.1.a aparece um pico bastante proeminente de uma impureza presente em baixssima
concentrao na amostra. Devido sua alta absortividade molar, a rea do pico bastante grande e alm
disso acarreta um problema de resoluo entre si e o pico do componente 2. No cromatograma A6.1.b,
obtido com um ELSD, esse problema desaparece totalmente, alm de obter-se um sinal mais alto para o
componente 3, de baixa absortividade molar. A literatura j apresenta um grande nmero de mtodos
analticos empregando um ELSD. Pode-se acrescentar que muitas vezes, principalmente devido baixa
sensitividade do DIR, necessrio realizar-se uma derivao na amostra para que a mesma torne-se
detectvel por um DUV ou um detetor de fluorescncia, como por exemplo, no caso de aminocidos. A
derivao sempre um transtorno, por representar um trabalho a mais e uma fonte de erro a mais.

No ELSD (Figura A6.1.) o efluente da coluna sofre trs processos, nessa ordem: a)
nebulizao, por um gs inerte, b) evaporao da fase mvel em uma cmara aquecida e c) deteco da
luz espalhada pelas partculas remanescentes. Por esta descrio torna-se bvia a talvez nica restrio do
ELSD: s detecta substncias de mais alto ponto de ebulio que a fase mvel.

A referncia 13 traz um review sobre ELSD, com 26 referncias cobrindo o perodo de
1966 a 1998.

Figura A6.1 Diagrama esquemtico de um ELSD
APNDICE 7

Estatstica

1. Erro estatstico

Todo trabalho experimental dotado de erro. Trata-se aqui de dois tipos
de erro: a) erro estatstico e b) erro sistemtico.

O erro estatstico possui caractersticas aleatrias. Pode ser avaliado e
minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto , em um certo
nmero de repeties, os valores que mais se afastam da mdia (aritmtica) ocorrem com menor
freqncia e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual freqncia. O
erro sistemtico, por outro lado, um erro determinado, possui sinal ( positivo ou negativo).
Em Cromatografia, o erro sistemtico corrigido automaticamente pelo prprio mtodo de
clculo (Seo 6.3; p. 35).

2. Avaliao do erro estatstico

Uma das maneiras de se medir o grau de disperso de um conjunto de
resultados analticos (repeties) o desvio padro (s), o qual pode ser calculado com auxlio da
equao
s = [ (x
i
- x )
2
/(n 1)]
1/2
(eq. 22)

onde x
i
um resultado qualquer, x a mdia aritmtica e n o nmero de repeties. Esse parmetro
denominado primeira estimativa do desvio padro, j que o verdadeiro desvio padro s pode ser
calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s s pode ser empregado quando n maior que 10.
Como normalmente n muito pequeno (3 a 5 determinao em paralelo), emprega-se em seu lugar a
segunda estimativa do desvio padro (s
R
):

s
R
= K
n
R (eq. 23)

onde R a amplitude, ou seja, a diferena entre o valor (resultado analtico) maior e o valor
menor. O valor de K
n
obtido da Tabela A7.1.

3. Avaliao da exatido

Na realidade, erro de exatido o erro sistemtico, que seria corrigido pelo
prprio mtodo analtico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode cometer erros
operacionais que resultem em erro sistemtico (ex.: uso de solventes contendo impurezas que
interfiram na identificao). O erro sistemtico pode ser avaliado com auxlio do teste t (de
Student), que compara a concentrao real de uma soluo padro, preparada com todo critrio
(por exemplo, preparada por um Laboratrio de Referncia) com a concentrao do padro
empregado na calibrao do equipamento. A equao seguinte aplicada, com auxlio da Tabela
A7.2:

Tabela A7.1 - Valores de K
n
para clculo de s
R
.

n 2 3 4 5 6 7 8 9 10
K
n

0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249

t
X n
s
=

(eq.24)
onde X a mdia aritmtica das n determinaes, a concentrao real, s calculado de
acordo com a eq. 22 (p. 66) e t comparado com o valor tabelado (Tabela A7.2). Se o valor de
t
calc
for menor ou igual ao de t
tab
na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1, o
Laboratrio em avaliao est correto.

Tabela A7.2 - Valores de t para aplicao do teste t.

P (%)
n - 1 90 95 99
1 6,314 12,706 63,657
2 2,920 4,303 9,925
3 2,353 3,182 5,841
4 2,132 2,776 4,608
5 2,015 2,571 4,032
6 1,943 2,447 3,707
7 1,895 2,365 3,499
8 1,860 2,306 3,355
9 1,833 2,262 3,250
10 1,812 2,228 3,169

4. Avaliao da reprodutibilidade

O objetivo comparar a preciso de um Laboratrio, de um analista, de um
equipamento ou de um mtodo (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se o teste
F, que compara a disperso de um conjunto de dados com a de outro. Se as diferenas em
preciso forem estatisticamente significativas, o valor de F
calc
ser maior que o valor de F
tab

(Tabela A7.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padro colocado no numerador, de modo a
ter-se um valor de F maior que 1.
F
s
s
A
2
B
2
= (eq. 25)

Tabela A7.3 - Valores de F para aplicao do teste F

(n -1) (n - 1) PARA O MTODO A
de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 161 200 216 225 230 234 237 239 241 242
2 18,5 19 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4
3 10,1 8,6 9,9 9,1 9,0 8,9 8,8 8,8 8,8 8,8
4 7,7 6,9 6,6 6,4 6,3 6,2 6,1 6,1 6,0 6,0
5 6,6 5,8 5,4 5,2 5,1 5,0 4,9 4,8 4,8 4,8
6 6,0 5,1 4,8 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,1 4,1
7 5,6 4,7 4,4 4,1 4,0 3,9 3,6 3,7 3,6 3,6
8 5,3 4,5 4,1 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,3
9 5,1 4,3 3,9 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3,1
10 5,0 4,1 3,7 3,5 3,3 3,2 3,1 3,1 3,0 3,0

5. Nmero ideal de repeties

O nmero ideal de repeties (em paralelo) calculado com aplicao das eq. 26 e 27:

=
t.s
R
n
(eq. 26) L = 100/ (eq. 27)

Os dados so organizados no Quadro abaixo (os valores so exemplo fictcio),
para facilitar a interpretao. Na ltima coluna indicada a diferena entre o valor de L atual e o
da linha anterior. No momento em que a diferena (vale dizer, a diminuio na disperso dos
valores, ou ainda o aumento na preciso) fica desprezvel, a critrio do analista, este adota o
nmero anterior como sendo o nmero ideal de repeties.

n amostra A: = 1%
L Dif.
2 0,260 26,0 -
3 0,072 7,2 18,8
4 0,046 4,6 2,6
5 0,036 3,6 1,0
6 0,030 3,0 0,6
6. Expresso do resultado final

Para explicitar o grau de confiabilidade em uma anlise, necessrio indicar os
limites de confiana. Na prtica, comum definir os limites a partir da amplitude. Assim, um
resultado Re representado como:

Re = X + R/2

Na realidade, caso o mtodo tenha sido submetido a uma avaliao estatstica
completa, emprega-se a relao:

Re X t. K .
R
n
n = +

7. Clculo do coeficiente de correlao (r)

Na Seo 10.4 (p. 56) foi solicitado o clculo do coeficiente de correlao.
Este clculo realizado com uso da eq. 28:

(eq. 28)

Para ordenar os clculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y so,
respectivamente, concentrao e rea do pico.

Ponto n
o

x y x.y x
2
y
2

1 x
1
y
1
x
1
.y
1
x
1
2
y
1
2

2 x
2
y
2
x
2
.y
2
x
2
2
y
2
2

... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ...
n x
n
y
n
x
n
.y
n
x
n
2
y
n
2

Totais x y x.y x
2
y
2

Livro Crom 9

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Livro Crom 9

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

Alexandre Schuler

Das könnte Ihnen auch gefallen