INTRODUCCIN

En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista: protozoos,
algas, hongos, bacterias y virus.
Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin, estructura, tamao,
composicin entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscpico el facilita notablemente
la observacin; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan
tambin la observacin de ciertas estructuras celulares.
En este informe vamos a distinguir la estructura intracelular de algunos microorganismos, tal es el caso de la
sarcina, Klecciela, Bacilo Serium entre otros. Desarrollamos los mtodos de tincin y damos a conocer
un anlisis de los resultados obtenidos en la prctica.
DESARROLLO:
Mecanismos de Coloracin:
La coloracin celular y tejidos son una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos de absorcin: los
fenmenos fsicos de absorcin, capilaridad y smosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes
bsicos por los tejidos cidos y viceversa indican que hay reaccin qumica.
Los Colorantes:
Son compuestos, orgnicos que contienen radicales cromforos esto es que producen color y grupo de
anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromforos. Los radicales hidroxilo
(-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromforos imparten la propiedad cromgena al colorante
y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.
Preparacin de Frotis Bacteriano para Coloracin:
Entes de la tincin las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro lquido en un porta objeto limpio y son
extendido en una pelcula uniforme y delgada. Se deja que la pelcula seque en el aire y los microorganismos
son fijados por sustancias qumicas o por el calor moderado.
Tinciones:
Es un mtodo utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas tinciones se observa morfologa,
estructura y agrupamientos de microorganismos.
Tipos de Tincin:
Tincin Simple: utiliza un solo colorante.
Tincin de Gram:
Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg)
Tincin cido Resistente:
Una vez teidos, conservan su color resistiendo al lavado con cido mineral reducido. En esta tincin las
bacterias cido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los dems microorganismos son
decolorados por el cido y toman el color azul.
Tincin de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para
observar materias ncleos de la clulas.
Tincin de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
Tincin de Cpsula:
Colorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados creando resistencias.
Tincin de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo.
Endsporas:
Son unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la clula los cuales contienen los
componentes necesarios para conservar la vida.
Las esporas pueden situarse en el centro de la clula o en situaciones excntricas cerca de un extremo de la
misma.
Levaduras:
Son esfricas, elpticas y cilndricos, su tamao vara notablemente. Son hongos cuya forma corriente y
dominante de crecimiento es unicelular.
Las Cpsulas:
Son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las clulas de algunas especies.
Sarcina:
Son anaerobios obligados y son extremadamente cido tolerantes que pueden fermentar azcares y crecer
a pH inferior a 2.
Este gnero comprende 2 especies de bacterias que se dividen en tres planos perpendiculares para producir
paquetes de 8 en una clula.
Bacillus Cereus:
La mayora se encuentra en el suelo o en partculas de polvo en suspensin y son uno de los organismos del
gnero Bacillus que pueden ser aislados fcilmente.
Puesto que los formadores de esporas pueden aislarse selectivamente a partir del suelo, alimentos o de otro
material dejando las muestras a 80 C durante 10 minutos.
Los bcillus suelen crecer en medios sistemticos que contengan azcares, cidos orgnicos, alcoholes, etc,
como nica fuente de carbono y amonaco como nica fuente de nitrgeno.
Anlisis de Resultados:
Existe varios tipos de tinciones de loas cuales estudiamos:
Tincin de Gram
Tincin simple
Tincin de esporas
Tincin de Gram:
Dividida en gram positivo y gram negativo, en el caso de los gram (+) la muestra fue sarcina, puesto que una
tonalidad violeta fijada en su estructura determina la presencia de la misma puesto que fij en su estructura el
cristal violeta.
Y en el gran (-) utilizamos salmonella identificada por la presencia de muchas estructura un poco triangulares
de color rojo.
En la muestra de la prctica anterior 3 eran gran positivo por su coloracin morada.
Tincin Simple:
Estudia levaduras, en este experimento se usa un solo colorante que fue azul de metileno, donde observamos
que las levaduras tenan cocos. Estas clulas bacterianas difieren desde el punto de vista qumico de su
medio exterior y por eso se tien contrastando con su alrededor.
Tincin de Esporas:
La bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo, por medio de esta tincin pudimos observar la
estructura interna de la clula bacteriana, particularmente las endosporas, en este experimento se utiliza una
tincin simple debido a que la misma permite que se coloree toda la clula excepto la espora que se observa
de un tamao bien aceptable.



Tcnicas de tincin. Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la
rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la
fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el
protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin,
por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera
que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha
precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por
los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de
colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes
son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los
colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente;
un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y
lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante
simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan
intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin
teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta
china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de
cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que
pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Preparacin de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir
(si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha
tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para
inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea
cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en
una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata
de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla
delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable
del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse
con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias
veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente
que moleste al tacto pero no queme.



Examen de muestras al microscopio
Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que
empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.
Examen microscpico directo de las muestras
clnicas Sin Tincin
No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las
muestras se extienden directamente sobre la superficie de un
portaobjetos para su observacin. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus
elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina
fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales
como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos
adultos,Trichomonas, hifas de hongos, etc
En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.
Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas
Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras
celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los
componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped,
pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares
de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),
sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece
como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.
Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Tincin
Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras
celulares se diferencian en funcin de los diferentes
colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin
qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-
Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

microfotografa: Daniel Val



Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las
referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se
basan justamente en la tincin de GRAM
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta
Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina
(color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans
Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram,
las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana
sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as
como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la
clula gram-negativa es peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la
pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y
las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente
activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y
forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla
de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula
(y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada
capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se
decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared
celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el
de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la
decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo
tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas
grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.
El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos
son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces
grampositivos y otras gramnegativos.

Morfologa ultramicroscpica de las bacterias:
estructuras internas
Pared celular
Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en
la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se
encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes
celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.
Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares, azcares y
grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el
polmero complejo que forma la pared celular.
Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-
positivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho
ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como
explicacin del mecanismo de la reaccin al gram (ver las dos imgenes juntas).
Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos
clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en
la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y
unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la
pared que est en la superficie y se une slo a la capa de
peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del
determinante antignico del organismo.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina)
unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y
lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de
lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O
polisacrido est en la superficie. El lpido se llama
Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se
llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros
llamado Porines para el transporte de substancias de
peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y
la pared celular hay un espacio periplsmico con
enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de
antibiticos y protenas de transporte.
Tambin existen diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas
especies.
Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica)
Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se
denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido
integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin
funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que
controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de
desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la
membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma.
Citoplasma
El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes,
regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o cromatnica,
que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA,
combinado con protenas, forma partculas o corpsculos macromoleculares, de unos 200 A de
dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de
RNA-protena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas,
o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales.
Estructuras Citoplasmticas
Nucleoide (cuerpo cromatnico)
Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y
animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como
una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio,
es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo discreto, se ha
sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides,
equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el mtodo de tincin
de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es
menos densa que el citoplasma cincundante.
Ribosomas
Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo 70S).
Plsmidos
Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros
factores.
Endosporas
Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas
celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen
intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan,
en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de
bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden
crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin
embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce,
dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana
Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin
"taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las
clulas bacterianas.
En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos
irregulares, a veces de gran tamao





forma
esfric
a: se
llama
Coco
Divisin a lo largo del mismo plano,
formando cadenas cortas
Divisin a lo largo
de 2 planos
diferentes:
Ttradas
Divisin a lo largo de 3 planos
2 cocos
juntos:
Diplococos
4 - 20 en cadenas:
Estreptococos
regularmente:
Sarcinas
irregularmente:
Estafilococos
Bacilos
grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos




Forma de vara:
se llaman Bacilos
Dos bacilos juntos:
Diplobacilos
Cadenas de bacilos:
Estreptobacilos
Empalizadas, Bacilos
lado con lado o en
figuras en X, V o Y
Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se
llama: Espirilo
Si la espiral es flexible y ondulada se
llama: Espiroqueta
Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una
misma especie.



Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos
Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp,
como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp,
como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C.
perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica
de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm



Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N.
meningitidis
Tambin Moraxella sp y Acinetobacter
sp aparecen con morfologa de diplococos.
Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces
aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp,
que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y,
a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae,
como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp,
como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V.
cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual
de Fusobacterium sp

grficos obytenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm



Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-
alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos
pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la
diferenciacin morfolgica.
NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si
est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen
viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido
ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin
de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la
deteccin inicial de hemocultivos positivos.
ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos)
de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se
denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y
los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-
alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las
especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen
cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no
cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar
pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se
denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60
seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar
BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage
y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los
materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos
morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha suplantado al azul
de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde
manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.



TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen
en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones
ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones,
compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso
de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es
favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el
hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua,
y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.
REALIZACIN
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan
las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados
satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
1. Preparar los frotis
bacterianos indicados.
2. Teir con verde
malaquita. Con unas pinzas de madera
colocar la muestra encima de la llama
del mechero de forma que el colorante
humee durante 5 min.
Nota: evitar que la
muestra hierva. Aadir ms colorante
si ste se evapora; es importante que la
muestra no se seque.
3. Lavar con abundante
agua el exceso de colorante.
4. Teir con safranina 1
min.
5. Lavar con abundante
agua el exceso de colorante.
6. Secar la preparacin.
7. Observar la
preparacin al microscopio. Anotar la
disposicin y la morfologa de las tres
especies del gnero Bacillus.


INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un
carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.



Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin
y morfologa de las endosporas. B. sphaericus posee una endospora
esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa,
por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B.
thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la
clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico
denominado "en huso". B. subtilis forma una espora cilndrica subterminal
no deformante.




Bibliografa:

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html


CLASIFICACIONES DE TINCIONES


IMAGENES DE TINCION
TINCION DE GRAM MORADO
TINCION ROSA
TINCION ZIEHL NEELSEN













TINCION :consiste en la preparacion organicas de colorantes y grupos que proporciona
una variedad de colores en los microorganismos u otras sustancias inportantes
biologicas como los colorantes de materiales biologicos

TINCION DIRECTA:
como indicadores de oxidaciones de cambios PH en los medios de cultivo como
indicadoresde oxidacion para demostrar la presencia o la ausencia de condiciones
anaerobias o para demostrar la funcion fsiologicas de los microorganismos
utilizando las tecnicas denominadas supravitales.

TINCION INDIRECTA:
se hace inteacciones en primer lugar a un lugar a una sustancia quimica denominada
merdientea en el sustrato , lo cual prmitela posterior coloacion del colorante.
el colorante no tiene por si mismo si no que hay que tratar
con un mordiente.


por azul de metileno o cristal o violeta

La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincion diferenciar empleado
en microbiologia para la visualizacin debacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su
nombre albacteriologo,danes cristian gram, que desarroll la tcnica en 1884 Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de
color rosa.
Tincion rosa:
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los
representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En
realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-ros anilina
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida
a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de
lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Tincion de ZIEHL NEELSON
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida
a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de
lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
ste mtodo se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos
grasos (por ejemplo, el cido miclico) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con
colorantes bsicos. Por esto se denominan bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR. TINCIO


IPOS DE COLORANTES
Catinicos. Son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
cidos nucleicos ylos polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Aninicos. Molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con
losconstituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.
Liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinancon los materiales lipdicos de la
clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Examentintoriales (muestras teidas)


2.1. Tincin simple: Se utiliza solo un colorante (cristal violeta, azul metileno, etc..)
2.2. Tincin diferencial: tincin de un colorante para diferenciar tiposbacterianos,
estructuras externas, etc.
2.3. Tincin especifica: Para teir estructuras bacterianas (flagelos, esporas)
2.4. Tencin fluorescente: Para detectar anticuerpos fijados a microorganismos.
Lasbacterias se observan a mas de mil aumentos (con el objetivo de inmersion en aceite)
Tincin:

a) Tincin de Gram: permite diferenciar las bacterias en 2 grupos segn su cubierta
externa(pared celular) :
-Bacterias Gram positivas (se tien de azul)
- Bacterias Gram negativas (se tien de rojo)
Cristal violeta
Lugol
Alcohol
Safranina

Ejemplos
Streptococcus aureus (Gram positivo)Streptococcuspyogenes(Gram negativa)
Streptococcus pneumonie (Gram positiva) Escherichia coli (Gram negativa)
* Se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para decolorar
la placa. Esposiblemente ste reactivo el que produce mayores problemas ya sea por
decoloracin excesiva o por dbil decoloracin de los microorganismos. Es tambin la
etapa de la Tincin de Gram en la que el tiempo de... [continu





ebe su nombre al Bacteriologo Dans Christian Gram que la desarrollo en 1844.
Es una tincin diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y Gram -, de
acuerdo a las propiedades de su pared celular:

Los pasos ha seguir para realizar la tincin son los siguientes:
1 Fijamos la muestra mediante calor.
2 Violeta cristal (Tie todas las bateras, gram + y -) 1.
3 Fijamos con Lugol, 1.
4 Decoloremos con una mezcla alcohol-cetona (los gram - se decoloren).
5 Safranina (colorante de contraste, tie a los gram -), 1.
Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo. En la tincin se
observarn de color azul-violeta las gram + y de color rosa las gram -.

Fotografa tomada a partir de M. O. Digital, se observan estreptococos gram + y
bacilos gram -.
Ejemplos de algunos grupos de bateras que no se tien con esta tcnica, por lo
que podemos usar:
Gnero Legionella: uso de tincin de Diertele, Gimenez o Fluorescencia.
Gnero Treponema: tincin argntica o de Fontana-Tribondeau
Gnero Mycoplasma: tincin de Giensa.
Gnero Mycobacterium: tincin Zeil-Nilsen.