1.- ENFERMEDADES GENTICAS CAUSADAS POR DEFICIENCIA DE UN SOLO GEN.
2.- TERAPIA GNICA EN PIEL. 3.- TERAPIA GNICA PARA EL SISTEMA NERVIOSO. 4.- TERAPIA GNICA CONTRA EL SIDA. 5.- TERAPIA GNICA CONTRA EL CNCER. 6.- OBTENCIN DE VACUNAS GENTICAS.
Desde 1978, cuando se consigui aislar los primeros genes humanos por medio de tcnicas de ingeniera gentica, se ha logrado caracterizar, gracias a los esfuerzos conjugados de investigadores y mdicos, varias anomalas genticas que causan enfermedad en el hombre. Se trata de anomalas que afectan a un solo gen (mucoviscidosis, corea de Huntington, enfermedad de Gaucher, hemofilias A y B, retinoblastomas, miotona, etc.), de alteraciones de varios genes que participan en la formacin de tumores cancerosos, y tambin de modificaciones ligadas a la insercin en el genoma del material gentico de virus. La Terapia Gnica puede aplicarse a enfermedades causadas por el defecto o deficiencia de un enzima por presentar un nico gen defectuoso y cuya ausencia provoca directamente una enfermedad, como la fibrosis qustica, la distrofia muscular, la deficiencia de desaminasa de adenosina y la hipercolesterolemia familiar, adems de los ya citados anteriormente. Tambin puede aplicarse modificando las clulas precursoras (clulas cepa) de ciertos tejido y rganos, como las del tejido hematopoytico (la mdula sea), la piel (queratinocitos y fibroblastos), los endotelios, el hgado y los msculos (mioblastos). Tambin se pueden tratar por Terapia Gnica aquellos tejidos formados por clulas quiescentes que constituyen parte de los tejidos o que forman aquellos tejidos cuya funcin depende de condiciones mecnicas o arquitectnicas, como el msculo estriado, el msculo cardiaco o los pulmones. Se aplica, por ejemplo, a miopatas, a enfermedades broncopulmonares como la mucoviscidosis, y a enfermedades neuromusculares o neurodegenerativas. Tambin se estn intentando combatir mediante Terapia Gnica distintos cnceres, como tumores cerebrales, cncer de ovario, cncer de mama, cncer colonrectal, etc. Por ltimo, las enfermedades causadas por virus, como el sida, tambin son susceptibles de ser tratadas por Terapia Gnica. La ltima gran aplicacin de la Terapia Gnica consiste en la formacin de vacunas especficas mediante la introduccin en el organismo de fragmentos de ADN que codifican protenas con capacidad antignica.
a) Enfermedades genticas causadas por un solo gen. Las enfermedades que, en principio, pueden ser tratadas por Terapia Gnica son las que tienen su origen en un defecto monogentico, debido a un fallo por mutacin, deleccin o falta de expresin de un nico gen. Hoy en da, estn identificadas como mnimo 4.000 enfermedades por defectos monogenticos, y hay ms de 100 protocolos de tratamiento por Terapia Gnica aprobados en todo el mundo. Entre estas enfermedades monognicas estn la talasemia, la anemia falciforme o drepanocitosis, inmunodeficiencia (SCID), la hemofilia A, la hipercolesterinemia familiar, la fibrosis qustica o mucoviscidosis, la distrofia muscular o miopata de Duchenne, el enfisema hereditario, la enfermedad de Gaucher, la anemia de Fanconi, el sndrome de Hunter, etc. Analizaremos a continuacin algunas de estas enfermedades, sus causas y el mtodo de Terapia Gnica utilizado para solucionarlas.
- Dficit inmunitario combinado severo (DICS). Esta enfermedad se caracteriza por el dficit de una enzima, la adenosin desaminasa (ADA). Este dficit, mortal a corto plazo de no mediar un trasplante de mdula, induce la acumulacin de sustancias txicas en un tipo de glbulos blancos, los linfocitos. Un tratamiento sustitutorio, consistente en inyectar el enzima ADA TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 1 combinada con polietilenglicol (PEG), permite en ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Se trata, sin embargo, de un tratamiento extraordinariamente caro, ininterrumpido y de eficacia inconstante. El ensayo de Terapia Gnica consiste en aplicar una metodologa ex vivo, extrayendo del paciente clulas con genes defectuosos y se les introducen en el laboratorio copias normales del ADN afectado, utilizando para ello un vector retrovrico. Se consiguieron as linfocitos T normales de vida larga que luego son reintroducidos en el paciente. Una vez all, los linfocitos T producen el enzima ADA que logra paliar los efectos de la enfermedad.
- Hipercolesterolemia familiar. Esta enfermedad cardiovascular de origen gentico se caracteriza por un ndice de colesterol extremadamente alto a causa de la ausencia de receptores de lipoprotenas de dbil densidad (LDL) en la superficie de las clulas del hgado. Los investigadores modificaron in vitro una parte de estas clulas, una vez extradas y les transfirieron el gen del receptor LDL. Luego, las inyectaron en un catter conectado a una vena que drena el hgado del paciente. Estas clulas con el receptor para las LDL comenzaron a actuar y consiguieron disminuir el ndice de colesterol hasta en un 17%.
- Drepanocitosis o anemia falciforme. La drepanocitosis, o anemia falciforme, es una enfermedad gentica que afecta a la estructura y a la actividad de la hemoglobina. La drepanocitosis se debe a una mutacin de la globina beta humana (la hemoglobina humana est formada por cuatro cadenas peptdicas: dos alfa globinas y dos beta globinas), que se traduce en cambiar un glutamato por una valina en posicin 6. La hemoglobina mutada, llamada S (HBS), tiene la propiedad de polimerizar cuando se encuentra en concentracin alta en los glbulos rojos y cuando est desoxigenada, polimerizando para originar largas fibras. Estas fibras dan al glbulo rojo su forma caracterstica en hoz (falciforme) y hacen que el interior de la clula sea muy viscoso cuando la concentracin de oxgeno es dbil. Estos fenmenos son reversibles si se produce la reoxigenacin de los glbulos rojos. Pero las clulas falciformes, rgidas, corren el riesgo de quedar bloqueadas en pequeos capilares y de obstruir la microcirculacin. Estas obstrucciones pueden complicarse en trombosis vasculares extendidas, muy dolorosas, que dejan secuelas y, a veces, incluso amenazan la vida. Hasta ahora, los avances en Terapia Gnica para esta enfermedad slo han conseguido crear ratones afectados de drepanocitosis sobre los cuales se intentarn los protocolos de curacin adecuados.
- Miopata de Duchenne. La distrofia muscular o miopata de Duchenne afecta a un nio de cada 3.500 y se caracteriza por una prdida progresiva de la fuerza muscular, perceptible desde la edad de 4 5 aos. Entonces, el nio tiene dificultades para ponerse en pie y para andar a la misma velocidad que los otros. Despus de los 6 aos, inevitablemente, la mayor parte de los msculos se deterioran y a partir de los 11 aos, el nio se ve condenado a permanecer en la silla de ruedas. La muerte por insuficiencia respiratoria o cardiaca sobreviene generalmente antes de los 20 aos, a menos que el enfermo reciba asistencia respiratoria. La distrofia muscular se debe a la alteracin de un gen situado en el cromosoma X que codifica para una protena de un alto peso molecular, la distrofina. En el 55% de los casos de miopata, falta una parte del gen (deleccin), el 40% se debe a mutaciones puntuales, es decir, a la sustitucin de un nucletido por otro; y el 55 de los pacientes tiene una parte del gen anormalmente duplicado. La distrofina es una protena de membrana que contribuye a la estabilidad de las membranas de las clulas musculares. Se han intentado dos mtodos de tratamiento de la miopata de Duchenne mediante Terapia Gnica. Muchos cientficos estiman que la miopata de Duchenne no ser fcil de tratar con estos mtodos, ya que tratarla implicara hacer que un gran nmero de clulas musculares produjeran una gran cantidad de distrofina, al menos el 25% de la tasa normal, pero hasta ahora slo se producen tasas del 10% que no bastan para mejorar la funcin del msculo correspondiente. Adems, existen obstculos tcnicos, a causa del gran tamao del gen DMD y a la relativa inaccesibilidad de las clulas musculares, para hacer llegar el gen a todas las fibras musculares de todos los msculos del cuerpo. El primer mtodo de Terapia Gnica consiste en el trasplante de mioblastos, las clulas precursoras del msculo. Estos mioblastos son tomados TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 2 de un donante sano para, a continuacin, ser inyectadas en uno de los msculos del paciente. El objetivo es que los mioblastos trasplantados participen en la regeneracin de las fibras musculares para que puedan producir distrofina. El problema es que se han de inyectar varios millones de mioblastos. Adems, el sistema inmunitario puede rechazar las clulas extraas. El otro mtodo consiste en inyectar el gen de la distrofina en el tejido muscular sin utilizar vectores vricos, proceso realizado en un ratn. Sin embargo, la poca eficacia de la transferencia del gen (aproximadamente el 1% de las fibras musculares) y el escaso nmero de clulas salvaguardadas suponen un problema grave. Por consiguiente, es demasiado pronto para usar esta tcnica en ensayos en el hombre.
- Mucoviscidosis o fibrosis qustica. Entre las enfermedades debidas a un slo gen defectuoso, la mucoviscidosis es la ms frecuente en las poblaciones europeas y norteamericanas, donde afecta a un nio de cada dos mil. Sus sntomas son principalmente respiratorios. Las secreciones mucosas producidas por el revestimiento de los bronquios y los bronquiolos se hacen demasiado viscosas, se acumulan en estas vas y provocan precozmente una infeccin bacteriana que rpidamente se vuelve crnica. La infeccin y la inflamacin broncopulmonares consiguientes avanzan hasta producir una grave insuficiencia respiratoria que, en la mitad de los casos provoca la muerte antes de los treinta aos. Desde 1989 se sabe que la mucoviscidosis es la consecuencia de la mutaciones que afectan a un gen nico, llamado CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Este gen est localizado en el brazo largo del cromosoma 7. La protena cuya sntesis dirige (protena CFTR) est normalmente localizada en la membrana citoplasmtica del polo apical de las clulas epiteliales de los bronquios. A este nivel, tiene un papel esencial en los intercambios de agua y de iones (cloro y sodio) entre las clulas y el medio que las rodea. De este modo, la protena CFTR regula la viscosidad de las secreciones emitidas por las clulas mucparas y las glndulas seromucosas presentes en el epitelio. Las clulas afectadas de mucoviscidosis se muestran incapaces de secretar agua y cloro y, en cambio, absorben ms cloro y agua. En los ltimos aos se han intentado varios mtodos teraputicos para tratar esta enfermedad. La DNAasa recombinante ataca el ADN, abundante en el mucus infectado, lo que provoca el aumento de la viscosidad. Otras terapias intentan corregir el defecto de secrecin de cloro y de agua o el exceso de absorcin del sodio por las clulas bronquiales. La amilorida es capaz de bloquear la reabsorin de sodio y asociada a nucletidos trifosfato (ATP y UTP) estimula la secrecin de cloro. En ambos casos, se normaliza el equilibrio hidroelctrico en la superficie del epitelio respiratorio. Otro enfoque se basa en la Terapia Gnica. En este caso, el objetivo que se persigue es introducir en las clulas epiteliales de las vas respiratorias un gen CFTR humano normal que produzca la protena ausente o inactiva. Para ello, se utiliza un mtodo in vivo, vehiculando el gen mediante un adenovirus inactivo, aplicado al paciente por medio de aerosoles. Este mtodo es el mejor porque las clulas epiteliales bronquiales no pueden obtenerse, cultivarse in vitro, modificarlas y luego introducirlas en el paciente. Los adenovirus presentan capacidad para infectar clulas que no se dividen y presentan un tropismo natural por las clulas del epitelio respiratorio. Su inocuidad, su tamao genmico y el no introducir su genoma en los cromosomas, les confieren ventajas frente a los retrovirus. Los primeros ensayos de Terapia Gnica para curar la mucoviscidosis fueron puestos en prctica en 1990-1991 al curar ratones enfermos. Los primeros ensayos clnicos en humanos datan de 1994 con resultados alentadores.
- Curar hepatocitos. Se ha utilizado la tcnica de Terapia Gnica in vivo para curar ratones afectados del dficit de un enzima heptico, la ornitina transcarbamilasa (OTC), implicada en el ciclo de la urea. Para ello, se inyectaron en la vena de la cola de estos ratones adenovirus recombinantes portadores de un gen que codifica este enzima. En estos ratones, la deficiencia de OTC, enzima que tiene un papel esencial en la desintoxicacin del amoniaco, conduce a un nivel elevado de esta sustancia en la sangre, lo cual aumenta la cantidad de cido ortico en la orina. Este trastorno provoca un retraso en el crecimiento y un pelaje ralo antes del destete. La inyeccin del virus recombinante provoc una elevacin del nivel de OTC en el hgado de los animales, lo bastante importante en algunos de ellos para reducir el nivel de cido ortico urinario y estimular su crecimiento y su pelaje. TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 3 Siguiendo este protocolo se podran utilizar adenovirus recombinantes para transferir genes exgenos mediante mtodos in vivo a los hepatocitos del hgado adulto, e intentar as corregir alteraciones genticas como las hemofilias, ligadas a la deficiencia en los factores VIII y IX, protenas de la coagulacin cuya fuente principal es el hgado; enfermedades asociadas al metabolismo del ciclo de la urea o de los aminocidos, como el dficit en ornitina descarboxilasa; tambin podra suplirse la deficiencia de alfa-1- antitripsina, una glucoprotena del hgado cuya ausencia o mutacin est en el origen de afecciones pulmonares graves que afectan a uno de cada 4.000 nios.
b) Terapia Gnica en Piel. Entre los tejidos accesibles para la manipulacin gnica, la piel presenta propiedades que la convierten en un sistema muy atractivo, en el cual introducir genes que produzcan protena teraputicas de forma regulada. Las caractersticas que hacen de la epidermis un sistema idneo en Terapia Gnica son: es el ms accesible de todos los tejidos somticos, lo que facilita tanto su manipulacin como la observacin del resultado de sta; se conoce bien la biologa molecular y celular de estas clulas, los queratinocitos pueden cultivarse in vitro, creando una lmina que es fcilmente trasplantable, habiendo suficiente experiencia hospitalaria en el trasplante de piel humana, siendo esta operacin relativamente poco gravosa para el paciente; se pueden cultivar las clulas madre en las cuales una alteracin gentica (al introducirles un gen exgeno utilizando como vector un retrovirus) permanece durante toda la vida; los queratinocitos genticamente alterados son capaces de secretar el producto del gen exgeno en el torrente sanguneo. Adems, los transplantes son fcilmente removibles en caso de complicaciones. Existen muchos ejemplos de potenciales aplicaciones de Terapia Gnica a travs de queratinocitos epidrmicos, como son: - Enfermedades hereditarias de la piel. Los queratinocitos portan versiones corregidas de los genes cuyas mutaciones dan lugar a la enfermedad, como: ictiosis lamelar (dficit en el gen de la transglutaminasa 1), epidermiolisis ampollosas bien intraepidrmica, distrfica o juntural (dficit de los genes de citoqueratinas, colgenos, laminina, componentes hemidesmosmicos, etc.), xeroderma pigmentoso (dficit de los genes de reparacin del ADN). - lceras crnicas, heridas extensas. Los queratinocitos producen factores de crecimiento epitelial o vascular que favorecen la cicatrizacin (EFG, TGF, KGF, VEGF, etc.). - Enfermedades sistmicas. Los queratinocitos hacen de factora secretora del producto teraputico, para su accin local o a travs del sistema circulatorio, como enanismo (hormona del crecimiento), hemofilia (factores de coagulacin), vascularizacin subcutnea (VEGF), isquemia (angiopoyetina), enfermedades vricas (interfern). - Enfermedades metablicas. Los queratinocitos portan genes que les permiten depurar los productos txicos circulantes, como el ADA (adenosin deaminasa) y la fenilcetonuria (fenilalanina desaminasa). Los primeros ensayos de Terapia Gnica en la piel fueron en 1987 cuando se transfirieron queratinocitos en cultivo, ex vivo, con un retrovirus portador del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH) e incapaz de replicarse en la clula diana. La determinacin de hGH en el medio de cultivo de los queratinocitos transducidos, demostr que la hormona se sintetizaba y se secretaba activamente. Al trasplantar lminas de queratinocitos productores de hGH en ratones inmunodeficientes no se detect hGH en sangre. Pero qued demostrado que las clulas epidrmicas pueden secretar protenas como las glndulas endocrinas. Actualmente se ha conseguido mantener la expresin de distintos genes durante, al menos, 40 semanas. Estos resultados, aunque todava en fase de experimentacin en modelos animales, abre las puertas para una nueva alternativa teraputica de reposicin de protenas ausentes o no funcionales debido a alteraciones en sus genes correspondientes. As, un parche de queratinocitos productores- exportadores de cantidades adecuadas de una protena, por ejemplo el factor IX en hemoflicos, reemplazara a los engorrosos tratamientos. Otro frente, en el que la Terapia Gnica con queratinocitos est probablemente ms prxima a los ensayos clnicos con pacientes, es el destinado a corregir enfermedades de origen gentico de la propia piel (genodermatosis). En los ltimos aos se ha progresado enormemente en la TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 4 comprensin de las bases moleculares de diversas enfermedades hereditarias severas, incluyendo varios tipos de epidermolisis ampollosa e ictiosis. La ictiosis lamelar es una enfermedad cutnea grave que provoca la descamacin de los estratos suprabasales de la epidermis. Esta enfermedad es debida a que los queratinocitos carecen de una enzima, la transglutaminasa 1 (Tgasa 1), necesaria para la correcta formacin de la barrera cornificada de la epidermis. La restitucin de la Tgasa 1 en queratinocitos deficientes en dicho gen mediante un vector retroviral llev a la normalizacin completa de la arquitectura y la funcin epidrmica. La epidermolisis ampollosas (tipo simple, distrfica o juntural) se caracterizan por la formacin de ampollas con gran facilidad ante el menor trauma fsico, y en sus formas ms agudas pueden ser letales. Se ha conseguido revertir el fenotipo patolgico de queratinocitos provenientes de un paciente con epidermolisis ampollosa, enfermedad asociada a la ausencia de una protena extracelular sintetizada por los queratinocitos, la laminina 5, a consecuencia de la cual no se forman los hemidesmosomas, estructuras mediante las que la epidermis se une a la membrana basal y a la dermis. Los queratinocitos corregidos recuperaron su propiedad de formar hemidesmosomas, restaurando su capacidad de adhesin perdida. En resumen, los recientes perfeccionamientos en las tcnicas tanto de cultivo de queratinocitos como de generacin de vectores estables y fiables para introducir y expresar informacin gentica en estas clulas unidos a la relativa facilidad con que estos cultivos son trasplantados, hacen suponer que, en los prximos aos, la piel ser uno de los primeros y ms atractivos sistemas para corregir enfermedades mediante Terapia Gnica.
c) Terapia Gnica para el Sistema Nervioso. El sistema nervioso est formado por neuronas, clulas que han perdido la capacidad de dividirse y regenerar el tejido; por ellos, cuando se produce la muerte de las neuronas, el Sistema Nervioso Central va perdiendo facultades y deja de realizar ciertas actividades. Como an no es posible provocar mediante frmacos que las neuronas supervivientes se regeneren y sustituyan a las muertas, se aspira hoy da a sustituir las clulas perdidas del tejido lesionado con neuronas trasplantadas o mediante la liberacin de factores de crecimiento que despierten en las neuronas supervivientes su capacidad de regeneracin latente en las clulas. Aplicada a las neuronas languidecentes, la Terapia Gnica podra suministrarles, en principio, un gen que especificara una protena protectora contra cualquier peligro amenazante. Para crear esos remedios, hay que decidir primero qu protenas seran las ms adecuadas. En algunos casos, se tratara de aumentar la sntesis de una protena cerebral cuya versin natural no cumpla bien con su cometido o bien se produzca en cuanta insuficiente. En otros, podra aadirse una protena nueva, encontrada en un tipo de tejido diferente o incluso en un organismo distinto. Tambin podra limitarse la produccin de una protena que funciona de una manera perjudicial para la salud, para lo cual se utilizara la estrategia antisentido, impidindose as que se exprese el gen que cifra para dicha protena Los mtodos utilizados en la Terapia Gnica del sistema nervioso para introducir genes podran ser de tres tipos: mediante inyeccin directa de ADN (con el gen deseado), pero este mtodo no es eficaz porque las neuronas no son capaces de absorber el ADN desnudo; utilizando liposomas en cuyo interior se alberga el gen, los cuales se fusionan con la membrana desprendiendo el ADN en su interior; mediante vectores vricos atenuados en cuya cpsida albergan el gen y que carecen de capacidad para replicarse, entre los vectores vricos se aconseja los adenovirus por su inocuidad y los herpesvirus gracias a su neurotropismo natural.
- Enfermedad de Parkinson. Esta enfermedad se debe a la degeneracin de la sustancia gris del cerebro, regin que se encarga de regular el control motor. Por culpa de su destruccin, a los pacientes les cuesta mucho iniciar un movimiento o ejecutar movimientos coordinados complejos. La prdida causa tambin el clsico temblor parkinsoniano. La enfermedad de Parkinson sobreviene despus de la muerte de las neuronas de la sustancia gris que segregan el neurotransmisor dopamina. Por TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 5 razones complejas, esas neuronas generan tambin radicales oxgeno que desencadenan reacciones lesivas dentro de la clula, que acaban matndola. Una forma sencilla de corregir tal deficiencia, al menos de manera transitoria, sera aumentar la cantidad de dopamina all donde escasea su suministro. La administracin de un precursor qumico de la dopamina (L-dopa) aumenta los niveles del neurotransmisor, pero el frmaco reacciona por todo el cerebro y acarrea efectos secundarios importantes. El inters de la Terapia Gnica en este contexto reside en que los cambios correctores se desarrollaran dentro mismo de la sustancia gris. La dopamina no es una protena; si los son, en cambio, las enzimas que sintetizan este neurotransmisor. En consecuencia, la intensificacin de la sntesis de una enzima crucial para ese proceso (la hidrolasa de tirosina) debera potenciar la produccin de esta sustancia qumica cerebral tan necesaria, siempre que sobrevivan las clulas secretoras de dopamina de la sustancia gris. Los primeros ensayos para el tratamiento de esta enfermedad fueron llevados a cabo en ratas a las que se les haban inducido los sntomas de la enfermedad de Parkinson. Estos sntomas los corrigieron empleando, por vector gnico, herpesvirus. La aplicacin de la Terapia Gnica aument la produccin de la enzima correctora, elev el nivel de dopamina en las proximidades de las clulas privadas de ese neurotransmisor y elimin en parte los trastornos cinticos de los roedores. Un mtodo ms refinado consiste en trasplantar neuronas fetales pertenecientes a la sustancia gris de ratas, con lo cual tambin se corregan los dficits parkinsonianos inducidos en ratas. En este caso, las clulas jvenes, en pleno vigor, se reprodujeron y sintetizaron dopamina para las clulas necesitadas de las inmediaciones. Sin embargo, estas neuronas injertadas tendan a activar un programa interno de suicidio y moran al poco tiempo. Para prevenir la apoptosis, antes del injerto se modificaron las neuronas fetales por ingeniera gentica, haciendo que estas clulas produjeran grandes cantidades de bcl-2, una protena que bloquea el suicidio celular. Cuatro semanas ms tarde, las ratas con injertos modificados genticamente haban mejorado de forma sustancial. El tratamiento de la enfermedad de Parkinson precisa un periodo de eficacia ms prolongado. Los injertos deberan sobrevivir aos. Se han realizado ya trasplantes de clulas fetales en pacientes en avanzado estado de la enfermedad, con resultados desiguales. Quiz una o dos modificaciones ms de las clulas fetales humanas por ingeniera gentica antes de su trasplante podran mejorar el rendimiento.
- Accidente cerebrovascular. Se confa tambin en la Terapia Gnica para detener la lesin tisular inducida durante crisis neurolgicas agudas del tipo de la sobreestimulacin producida en un episodio de convulsin o la prdida de oxgeno y de nutrientes acaecida en un accidente cardiovascular. Cuando se produce tal percance, las clulas ms vulnerables del cerebro son las neuronas que responden a la presencia de glutamato, un neurotransmisor que induce la captacin de calcio por las neuronas receptoras. Durante las convulsiones o el ictus, las neuronas se ven incapaces de limpiar el glutamato de las sinapsis o de amortiguar la marea de calcio que fluye al interior de muchas neuronas cerebrales. En ese momento, tanto el glutamato como el calcio producen lesiones importantes ya que se derrumba la arquitectura celular de las neuronas afectadas y los radicales de oxgeno generados provocan todava males mayores. Esta destruccin mata directamente las clulas o seala la iniciacin de los programas suicidas internos que causaran la muerte de las neuronas languidecentes. Mediante Terapia Gnica se han expuesto, in vitro en una placa de Petri, neurona de rata a un virus herpes que porta el gen codificante de una protena que acarrea molculas de glucosa a travs de la membrana celular. Estas protenas se expresaron y aumentaron el nivel de glucosa en el interior de las neuronas. En un paciente que sufriera una crisis neurolgica, un tratamiento de este tipo incrementara la absorcin de glucosa, que proporcionara a las neuronas energa extra para el transporte activo del exceso de calcio fuera de las clulas involucradas. Luego se comprob que en el animal (rata) se puede reducir la lesin causada por el accidente cardiovascular inyectando el vector vrico en la regin vulnerable del cerebro antes de que se produjera el percance. No se puede aplicar en el hombre este tratamiento preventivo, ya que se desconoce cundo y dnde se va a producir. Sin embargo, se ha demostrado que tras una TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 6 convulsin hay una ventana de unas pocas horas en la que el tratamiento gnico de las ratas segua protegiendo a las neuronas de una lesin adicional. Esto da pie a pensar que los seres humanos tambin podran beneficiarse de una clase similar de teraputica. Otra estrategia posible de Terapia Gnica del accidente cerebrovascular y el traumatismo se centra en los programas de suicidio. Se han construido vectores herpesvirus que incluan el gen supresor del suicidio bcl-2. La aplicacin de este vector tiende a proteger de la lesin a las clulas cerebrales de las ratas cuando se producen condiciones de crisis, sin que importe que el tratamiento comience despus de la lesin.
- Sndrome de Sly. Se han conseguido tambin avances en el camino de la prevencin de las enfermedades de almacenamiento de lpidos: trastornos genticos que causan defectos en ciertos enzimas y llevan a una acumulacin letal de molculas grasas en el cerebro. Una de estas enfermedades es el sndrome de Sly, causado por una mutacin gnica en el gen que determina el enzima beta-glucuronidasa. Se han trasplantado, en un ratn aquejado de esta enfermedad, neuronas fetales tratadas mediante ingeniera gentica para producir beta-glucuronidasa. Se comprob que los implantes eliminaban por completo del cerebro del animal los lpidos dainos.
- Recuperacin de la memoria. Se han preparado por ingeniera gentica injertos para producir grandes cantidades de un factor de crecimiento nervioso. Se implantaron algunas de estas neuronas as manipuladas en ratas maduras, eligiendo como blanco una regin crucial para el aprendizaje y la memoria; un rea del cerebro que degenera lentamente durante el envejecimiento normal. La importancia de este experimento est en que logr invertir el declive cognitivo de las ratas viejas. Este xito indica que la Terapia Gnica no slo podra servir para domear la enfermedad, sino tambin para mejorar la memoria, la sensacin y la coordinacin de las personas mayores.
A pesar de estas expectativas, la Terapia Gnica del sistema nervioso presenta diversos obstculos. Por ejemplo, los vectores vricos: si a estos se les mutila en exceso su genoma pueden perder la capacidad para infectar las clulas, y si se altera poco el virus podra daar las neuronas husped. Por otra parte, el cerebro se encuentra encerrado en el crneo lo que impide la inyeccin directa del frmaco, para ello habra primero que trepanar el crneo, lo cual conlleva ciertos riesgos. Aunque el vector se introdujese en el paciente por va intravenosa, sera improbable que el virus atravesara la barrera hematoenceflica. Por ltimo, el vector pierde eficacia con el tiempo, persistiendo, a lo sumo, semanas, un periodo demasiado corto para combatir enfermedades degenerativas, lentas e inexorables. Adems, puede que el vector no infecte todas las neuronas daadas. No hay que olvidar tambin que frente a los virus pueden desencadenarse una respuesta inmunitaria que los destruyese, impidindoles llevar a cabo su accin correctora.
d) Terapia Gnica contra el SIDA Ms de la mitad de todos los estudios clnicos de Terapia Gnica se centran en el cncer, pero el siguiente grupo en importancia, alrededor de un 10% tiene como objetivo la infeccin por el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), agente etiolgico del SIDA. Este campo de la Terapia Gnica persigue detener la replicacin del virus en el interior de las clulas ya infectadas e impedir su diseminacin a clulas sanas. El objetivo ltimo de estos experimentos son las clulas madre, de las que derivan las clulas del sistema inmunitario y de la sangre. De esta forma, si se consigue inmunizar a las clulas precursoras, las que de ellas derivan seran resistentes al VIH mucho antes de su maduracin. Por ahora los investigadores han de conformarse con ensayar diferentes estrategias en las clulas sanguneas conocidas como monocitos y con los linfocitos coadyuvantes, o CD4. Este ltimo tipo celular es el que sufre la agresin ms violente por el VIH. No resulta muy complicado aislar de la sangre de un paciente los linfocitos CD4, insertar en ellos un gen teraputico y reimplantarlos en la misma persona o en otro receptor. Algunos investigadores suean con el da en que se pueda administra los genes teraputicos en vivo mediante vectores de transferencia que puedan alcanzar clulas infectadas o expuestas. Actualmente, los vectores con ms TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 7 posibilidades son los virus, adenovirus o retrovirus como el mismo VIH. Estos virus se modifican de forma que no resulten patgenos y conserven su capacidad de transmitir informacin gentica a las clulas humanas. Los VIH modificados, para servir de vectores, presentan la misma afinidad por las clulas CD4 que los patgenos, pero carecen de capacidad para multiplicarse intracelularmente. As, tales vectores pueden llevar los genes teraputicos precisamente a aquellas clulas que ms lo precisan. Se est experimentando con una amplia gama de genes capaces de inactivar el VIH. Un tipo de gen que muestra una mutacin dominante negativa produce versiones inactivas de las protenas que el propio VIH sintetiza en condiciones normales para su replicacin. Cuando se trata con este gen una clula infectada, fabrica variantes anmalas que bloquean a las protenas correctamente sintetizadas segn el patrn del VIH. La inactivacin tiene lugar mediante la unin directa entre ambos tipos de protenas o mediante la sustitucin de las protenas funcionales por sus variantes anmalas en las reacciones moleculares. En 1995 empezaron los ensayos clnicos de una mutacin negativa del gen rev del VIH. Se est tambin sopesando la posibilidad de desarrollar genes que, una vez transcritos a cadenas cortas de ARN, suplantaran a las molculas de ARN vrico de control esenciales. La esperanza se cifra en que tales seuelos de ARN se unan a las protenas reguladoras naturales del VIH y obstaculicen su funcionamiento. Tambin podran detener la replicacin del VIH ciertos genes que, tras su transcripcin a ribozimas (ARN catalticos), degradaran el ARN vrico. Otra idea relacionada con las anteriores propone la colocacin de genes que controlen la formacin de protenas en la clula husped y que interaccionen con el VIH. De esta manera, una forma soluble de la protena CD4 podra unirse al VIH extracelularmente, evitando que se infectaran las clulas que presentan molculas de CD4 en su membrana externa. Los investigadores tambin toman en consideracin tratamientos basados en lo que se conoce como genes suicidas, parecidos a aquellos que se estn estudiando en la terapia contra el cncer. Dado que el gen se insertara en todas las clulas invadidas por el vector, los investigadores quieren asegurarse de que el gen de suicidio slo se expresar en las clulas infectadas por VIH. Se intenta unir estos genes a elementos de control que slo se activen en las clulas que resulten infectadas por el virus. Otra estrategia que se ha tomado prestada de las terapias contra el cncer se base en el refuerzo de la capacidad operativa de los linfocitos T coadyuvantes para que reconozcan las clulas infectadas y organicen la respuesta inmunitaria contra las mismas. Se puede, por ejemplo, combinar un gen que determine la regin del anticuerpo que reconoce y se une a la protena de superficie gp120 del VIH con genes que determinen el receptor o la molcula responsable en los linfocitos CD4 del reconocimiento de las clulas enfermas. Este receptor quimrico reconocera de forma ms eficaz al VIH e inducira, adems, a los linfocitos T a destruir las clulas sidosas. Actualmente est en fase 1 (control de seguridad) un ensayo clnico. Otros genes teraputicos objeto de investigacin dan lugar a fragmentos de anticuerpos que interaccionan con clulas infectadas. La unin de estos anticuerpos intracelulares con las protenas sintetizadas en la clula inhibira el posterior ensamblaje de las partculas vricas. Finalmente, tambin se han aprobado una serie de ensayos clnicos sobre vacunas gnicas que prevengan el sida. Al igual que en otras vacunas gnicas, esta forma de inmunizacin dotara a las clulas del sistema inmunitario de genes que determinan molculas propias del VIH y que lo sealaran como agente invasor. La reaccin del sistema inmunitario frente a estos antgenos sera la produccin de anticuerpos especficos, listos para atacar a cualquier clula que presentara tales antgenos en su membrana.
e) Terapia Gnica contra el Cncer. Existen varios enfoques de la Terapia Gnica experimental en el tratamiento del cncer. Algunos se basen en la introduccin en las clulas cancerosas de genes que den lugar a la produccin de molculas txicas; cuando tales genes se expresan las protenas resultantes matan a esas mismas clulas tumorales. Otras estrategias apuntan a la correccin o compensacin de mutaciones genticas adquiridas. Tambin hay planteamientos que persiguen la activacin de los procesos encargados de la reparacin de tales fallos. Se pretende as mismo actuar contra los mtodos de que se valen los tumores para TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 8 evitar su reconocimiento y destruccin por el sistema inmunitario, contra las vas que siguen los tumores para su diseminacin a partir del foco originario; contra los medios gracias a los cuales los tumores organizan su vascularizacin y contra los caminos por los que alcanzan una serie de condiciones que les permiten resistir y diseminarse. Las principales estrategias experimentales en Terapia Gnica utilizadas contra el cncer son: - Terapia antisentido, mediante el bloqueo de la sntesis de protenas determinadas por genes deletreos. - Quimioproteccin, mediante la adicin de protenas a clulas normales para protegerlas de la quimioterapia. - Inmunoterapia, mediante la estimulacin de las defensas inmunitarias contra el cncer. - Terapia colaboradora de los frmacos o de suicidio celular, mediante la sensibilizacin de las clulas tumorales a frmacos seleccionados que provocan la muerte celular por apoptosis. - Introduccin de genes supresores de tumores, mediante la sustitucin de un bloqueante del cncer alterado o defectivo. - Introduccin de genes que determinan anticuerpos, mediante la obstruccin de la actividad de protenas relacionadas con el cncer en clulas tumorales. - Regulacin-inhibicin de oncogenes, mediante represin de genes que favorecen el crecimiento incontrolado y la diseminacin de clulas tumorales. Algunas de las pruebas actuales de Terapia Gnica contra el cncer son las siguientes:
- Modificar clulas cancerosas mediante la introduccin de genes codificadores de citoquinas. Se extraen primero clulas tumorales, en las que se insertan genes que cifran citoquinas tales como la interleucina 2 (IL2 o factor de crecimiento de linfocitos T) o el activador de clulas dendrticas, conocido como factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-CFS). Luego, se reimplantan estas clulas en la piel o en el msculo del paciente, donde empezarn a segregar citoquinas, que despiertan la atencin del sistema inmunitario. En teora, las clulas alteradas deberan instar una febril actividad de los elementos celulares inmunitarios en el mismo lugar de reimplante. Las clulas activadas ya alertadas sobre la presencia de clulas tumorales, circularan por todo el organismo y atacaran a otros tumores.
- Produccin de antgenos predominantes en las clulas cancerosas. Se ha inyectado directamente, en el msculo de ratones, un fragmento de ADN que determina un antgeno exgeno. Este ADN forneo penetra en las clulas musculares o en las vecinas y dirige la produccin de pequeas cantidades de la protena exgena correspondiente. Las clulas presentan la protena sintetizada a los linfocitos B y T circulantes. Estas clulas inmunitarias, una vez sensibilizadas, recorren luego el organismo dispuestas a atacar a las clulas tumorales portadoras de ese mismo antgeno.
- Produccin de anticuerpos antitumorales. Se han inyectado clulas tumorales humanas en un ratn y ste ha creado anticuerpos contra los antgenos tumorales. Al poner en contacto, in vitro, los anticuerpos murinos con las clulas tumorales humanas se produca su unin especfica, aunque la respuesta inmune era escasa, habida cuenta que son los linfocitos T los que actan contra las clulas cancerosas. Por este motivo, los onclogos han buscado la manera de conjugar la selectividad de los anticuerpos anticncer de ratn con la capacidad de aniquilacin de las clulas T humanas. La tcnica del ADN recombinante ofrece las herramientas precisas. Se han aislado a partir de clulas del ratn los genes que determinan los anticuerpos anticncer humano y se han recombinado parte de aquellos con segmentos de los genes que determinan el receptor que las clulas T asesinas emplean para identificar a sus objetivos. Este receptor modificado faculta a la clula T asesina, a menudo incapaz de reconocer los tumores, anticuerpos de ratn, con menor capacidad de di Se ha comprobado que las clulas T asesinas pro T quimricos eliminan de forma muy eficaz clul para identificar lo que los scriminacin, ya han detectado. vistas de receptores de clulas as tumorales in vitro. TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 9
- Producir la protena p53. El gen supresor de tumores que con mayor frecuencia se encuentra alterado en el p53, cuyo producto proteico regula el ADN durante la divisin celular. Si el ADN sufre cualquier alteracin, la protena p53 puede suspender la divisin celular hasta que se repare el ADN o inducir el suicidio celular (apoptosis). Cuando se introduce una copia normal de este gen en clulas tumorales de un cultivo de tejido, se observa que dichas clulas siguen un patrn de crecimiento ms regular o que inician proceso de apoptosis. De ah el empeo en desarrollar mtodos que permitan la insercin del gen p53 normal en tumores presentes en el organismo.
- Terapia de suicidio celular. En este ensayo se introdujeron en clulas tumorales del cerebro, el gen productor de la quinasa de timidina de un herpes-virus. En las clulas infectadas por el virus herpes simplex, esta zima puede convertir el ganciclovir, un frmac en metabolito que acta o sin actividad txica, en un como un potente agente antivrico. Se observ que este mismo metabolito txico poda destruir clulas cancerosas en divisin y que, en algunos tumores, acababa tambin con las clulas malignas vecinas. Este producto ejerca su efecto de solidaridad gracias a su difusin, desde la clula en que apareca, a travs de las uniones entre clulas vecinas. En el ensayo clnico original, aproximadamente una cuarta parte de los pacientes con tumores cerebrales respondieron al tratamiento.
f) Obtencin de Vacunas Genticas. No slo es importante curar las enfermedades, sino tambin resulta muy beneficiosa su prevencin. Para ello, adems de hbitos de vida saludable, la medicina intenta prevenirlas mediante la activacin del sistema inmune, de tal forma que en el momento en que una enfermedad se declare en un individuo sta pueda ser atajada inmediatamente pues el individuo ya est sensibilizado y su sistema inmune actuar con gran eficacia. Este proceso se conoce con el nombre de vacunacin. La vacunacin clsica consiste en la introduccin del agente infeccioso atenuado en el individuo sano, el cual pone en marcha contra l los canismos naturales de la inmunidad, de tal forma que una nueva exposicin al me TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 10 agente (caso de una infeccin) la reaccin secundaria, violenta y rpida, los destrua. Actualmente se estn buscando nuevas vacunas, buceando los cientficos en el variopinto mundo de la gentica. Bsicamente, se siguen tres lneas de trabajo: utilizar el ADN como agente externo que active al sistema inmune, producir anticuerpos contra un determinado agente infeccioso para utilizarlo en caso de enfermedad, y utilizar teraputicamente a las vacunas.
- Activacin de la formacin de anticuerpos mediante inyeccin de ADN. La primera vez que se puso en prctica este protocolo fue en 1993. En este caso se confeccion una vacuna contre el virus A de la gripe. Se extrajo del virus la secuencia del gen que codifica la protena de la envoltura conocida como hemaglutinina, con capacidad inmungena. Luego, se insert este gen en un segmento circular de ADN bacteriano, un plsmido, as como secuencias genticas accesorias (promotores y amplificadores) para permitir una expresin apropiada del gen extrao en un nuevo husped. Por ltimo, se inyect esta construccin plasmdica en el msculo de las patas de un ratn. Al cabo de unas semanas, se detect, en la sangre de los animales, unos ndices elevados de anticuerpos antihemaglutinina. Al administrarle a estos ratones inmunizados dosis mortales de virus de la gripe, se observ que todos los ratones vacunados sobrevivan, contra solamente el 10% de los ratones testigo. Tambin, siguiendo esta tcnica, se ha utilizado el gen codificador de una molcula vrica interna, como la nucleoprotena, que es idntica en las diferentes cepas del virus. Se obtiene entonces una proteccin similar, pero esta vez gracias a la activacin de clulas inmunitarias citotxicas. Pero lo ms importante de este caso es que los animales quedarn protegidos contra cepas muy diferentes de la cepa vacunal. Este mtodo de vacunacin por ADN ha sido estudiado en varias especies animales: ratn, pollo, chimpanc, conejo, cerdo, cobaya y bvidos, dando excelentes resultados frente a diferentes agentes patgenos. La tabla adjunta muestra una relacin de ensayos de vacunas de ADN en animales. Los beneficios de la vacunacin por ADN son que provoca una respuesta inmune potente, de larga duracin, muy especfica a escala molecular, capaz de proteger contra diferentes cepas del agente patgeno y que, adems de activar la produccin de anticuerpos por los linfocitos B, activa a los linfocitos T citotxicos capaces de destruir las clulas infectadas. Otras ventajas seran la facilidad de produccin de la vacuna, que en un mismo plsmido pueden insertarse varios genes que inmunicen al tiempo contra agentes diferentes y que pueden prepararse en forma de polvo con lo que su conservacin no requerira fro, un obstculo en las zonas tropicales. Este proceso descrito funciona en varios tejidos, pero sobre todo en el msculo, aunque no se sabe por qu. El ADN extrao inyectado consigue de alguna manera llegar hasta las clulas del tejido diana, aunque sin insertarse en los cromosomas. Una vez dentro se produce su expresin, con lo que se forman protenas con capacidad antignica. Los productos antignicos se escinden en pequeos fragmentos protenicos (pptidos), como ocurre normalmente en cualquier antgeno. Estos fragmentos, asociados a molculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), son enseguida transportados a la superficie celular para ser presentados a los linfocitos T citotxicos. Los problemas que se plantean contra las vacunas de ADN son que ste podra integrarse en el genoma humano, destruyendo genes importantes, bien productores de algn enzima bsico o bien inactivando los genes supresores de tumores. Pero parece que la integracin del ADN en un cromosoma no es frecuente y casi imposible.
- Formacin de anticuerpos mediante ingeniera gentica. Se trata de obtener grandes cantidades de un anticuerpo especfico contra un agente patgeno, utilizando como factora una bacteria, el colibacilo. En primer lugar se fabrica in vitro un repertorio de anticuerpos con diversas especificidades. Esto se hace gracias a la reaccin de polimerizacin del ADN que permite utilizar directamente la informacin gentica contenida en los diversos genes de las inmunoglobulinas, a partir de linfocitos extrados de la sangre. La habilidad reside en utilizar no los genes completos de las inmunoglobulinas, sino slo las partes variables reordenadas, que son las responsables de la fijacin del anticuerpo en tal o cual antgeno. La etapa siguiente consiste en insertar esta informacin gentica en un bacterifago. Para ello, las regiones variables que se han amplificado, se TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 11 insertan en el gen de una protena de la cpsida (pIII) del fago. La protena resultante consiste entonces en una fusin entre el fragmento de anticuerpo y la protena pIII. El genoma de los fagos as modificado se introduce en colibacilos. La bacteria desempea la funcin de una fbrica que produce y ensambla todos los componentes del fago. Por medio de esta tcnica se pueden obtener hasta diez millones de fagos- anticuerpos diferente. De entre ellos, se seleccionan luego los que pueden r actua contra un antgeno especfico. Para ello, los fagos-anticuerpo se ponen en presencia del antgeno, unindose entre s, y luego se eliminan por lavado los que no se fijan. Con otras modificaciones genticas se puede conseguir recoger directamente los fragmentos de anticuerpos solubles en el medio de cultivo de las bacterias. Se han obtenido por este proceso anticuerpos contra el antgeno carcino- embrionario, un antgeno marcador para detectar cnceres de colon y recto y tambin contra el virus de la rabia.
- Vacunas Teraputicas. Adems de prevenir una enfermedad, las vacunas tambin podran curar infecciones crnicas, tumores, alergias u otras enfermedades autoinmunitarias. Los tumores son antignicos, pero no son capaces de provocar una spuesta inmunitaria detectable. Para curar los tu re estrategias principales para di mores se han seguido dos sear vacunas tumorales. Una se basa en la identificacin de los antgenos asociados a los tumores (AAT), con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria contra ellos. La segunda estrategia consiste en aumentar la inmunogenicidad de las clulas tumorales; por ejemplo, mediante la creacin de un entorno inflamatorio en los lugares donde se encuentra el tumor o proporcionando en forma soluble las molculas coestimuladoras ausentes de las clulas T.
En las infecciones crnicas, el sistema inmunitario responde a la infeccin, pero sin la intensidad suficiente para erradicarla. Se trabaja as en la preparacin de vacunas contra la infeccin por herpes genital, hepatitis B, hepatitis C, papilomavirus y Helicobacter pylori. Adems, a la mayora de estas infecciones crnicas se les ha atribuido un efecto tumorgeno de los rganos infectado. Por tanto, adems de curar la infeccin crnica, disminuira con la vacuna el riesgo de tumoracin. En el caso de la hepatitis B, la respuesta inmunitaria desencadenada contra la infeccin causa la enfermedad: las clulas T daan al hgado infectado en su empeo por eliminar el virus. Aqu, la estrategia de desarrollo de una vacuna teraputica consiste en ensear al sistema inmunitario para que responda al ataque del agente infeccioso de una manera beneficiosa para el husped, y no perjudicial. En el caso concreto del virus de la hepatitis B, se busca generar una respuesta de anticuerpos neutralizantes y evitar las reacciones citotxicas. En el caso de las enfermedades autoinmunitarias o de las alergias, lo que pretende es suprimir la respuesta inmunitaria patgena. Se s se upone que el rso de las enfermedades autoinmunitarias puede modificarse por supresin de cu TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 12 las clulas patgenas o por alteracin de su funcin efectora. Se supone que cambio de la funcin efectora de las clulas Th1 en clulas Th2 comportar in de la inflamacin crnica que se produce en los lugares de enfermedad autoinmunitaria. Lo contrario ocurrira en las alergias, en las que el cambio de la funcin efectora de las clulas Th2 alrgicas en Th1 podra acarrear el alivio de las reacciones alrgicas.
el la resoluc TERAPIA GNICA (www.rincondelasciencias.com) Pedro Fernndez Garca Pgina 13