Protocolo de Investigación Mauricio Alejandro Andino Molina

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE HONDURAS
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGA

PROTOCOLO DE INVESTIGACIN PRESENTADO POR
MAURICIO ALEJANDRO ANDINO MOLINA

PROYECTO
DIAGNSTICO MOLECULAR DE Clostridium difficile, AISLADA EN
CULTIVO DE HECES FECALES DE CERDOS LACTANTES EN
MUESTRAS CONSERVADAS.

ASESOR ACADMICO: Dr. EDGARDO TZOC, MSc.

CIUDAD UNIVERSITARIA, AGOSTO 2014

TABLA DE CONTENDO

INTRODUCCIN ........................................................................................................... 6
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................ 8
JUSTIFICACIN............................................................................................................ 9
OBJETIVOS ................................................................................................................ 10
OBJETIVO GENERAL: ............................................................................................ 10
OBJETIVOS ESPECFICOS: ................................................................................... 10
MARCO TERICO ...................................................................................................... 11
CARACTERIZACIN DE Clostridium difficile ....................................................... 12
1.1 Clostridium difficile .................................................................................. 12
1.2 SIGNOS CLNICOS DE LA ENFERMEDAD, EN PORCNOS. .................. 14
1.3 CRITERIO DIAGNSTICO ........................................................................ 17
1.4 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO ......................................................... 18
1.5 DIAGNSTICO MOLECULAR .................................................................. 21
1.6 TRATAMIENTO Y PROFILXIS ............................................................... 21
HIPTESIS ................................................................................................................. 22
DISEO METODOLGICO ........................................................................................ 23
BIBLIOGRAFA ............................................................................................................ 35
ANEXOS ..................................................................................................................... 40

LISTA DE TABLAS

TABLA 1. CEPAS DE Clostridium difficile ASOCIADAS A ENFERMEDADES
EN PORCINOS. ................................................................................................ 13

TABLA 2. SELECCIN DE MUESTRA Y OBSERVACIONES EN EL
AISLAMIENTO DE Clostridium difficile ......................................................... 17

TABLA 3. SUSTRATOS Y REACTANTES UTILIZADOS PARA LA
IDENTIFICACIN DE ANAEROBIOS .............................................................. 20

TABLA 4. TABLA DE IDENTIFICACIN PARA Clostridium difficile. ............ 20

TABLA 5. PREPARACIN DE CONJUGADO PARA AMPLIFICACIN DE GEN
Tpi. .................................................................................................................... 28

TABLA 6. PREPARACIN DE CONJUGADO PARA AMPLIFICACIN DE GEN
TOXINAS A/B ................................................................................................... 29

LISTA DE ILUSTRACIONES

ILUSTRACIN 1. NECROPSIA DE LECHN, EDEMA DE COLON. TOMADO
DE SONGER, J.G. ET AL. 2000 ....................................................................... 16

ILUSTRACIN 2. EROSIN SUPERFICIAL FOCAL DE LAMINA PROPRIA,
CON INFILTRADO DE NEUTRFILOS. TOMADO DE YAEGER, M ET AL.
2002 .................................................................................................................. 16

ILUSTRACIN 3. LESIN DE MESOCOLON. TOMADO DE SONGER, J.G. ET
AL. 2000 ........................................................................................................... 16

ILUSTRACIN 4. LESIONES TIPO VOLCN EN LA MUCOSA COLNICA
CON INFILTRADO DE NEUTRFILOS Y MONONUCLEARES. TOMADO DE
SONGER J.G. ET AL. 2000 .............................................................................. 16

ILUSTRACIN 5. COLONIAS TPICAS DE Clostridium difficile EN CCFA .. 19

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ............................................... 41
ANEXO 2. RECURSOS Y PRESUPUESTO .................................................... 42
ANEXO 3. PATOGNESIS DE Clostridium difficile ...................................... 43
ANEXO 4. INTERACCIN DE TOXINAS A/B DE Clostridium difficile .......... 44
ANEXO 5. HOJA DE RESULTADOS PARA ..................................................... 45

PROTOCOLO DE INVESTIGACIN
MAURICIO ANDINO MOLINA
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INTRODUCCIN

Clostridium difficile es considerado uno de los agentes etiolgicos de mayor
importancia asociado a diarrea en lechones, su asociacin y prevalencia se ha
visto incrementada, aunque no claramente establecida, con el desarrollo de
diversos estudios realizados a nivel internacional. La medicina veterinaria ha
subrayado la importancia de la misma como una bacteria cuyo reservorio es el
animal, as como sus implicaciones zoonticas y su patogenicidad en diversas
especies. Clostridium difficile ha sido encontrado en aproximadamente el 20%
de los productos crnicos de origen britnico.
Recientemente se ha descrito un solapamiento entre las cepas caracterizadas y
los reservorios y/u organismos infectados. Sumado a lo anterior, la prevalencia
de las enterotoxinas binarias A y B ha incrementado dramticamente para todas
las especies descritas. Epidemiolgicamente a nivel internacional, las diarreas
asociadas a Clostridium difficile han sido reportadas en ciertos estudios con
porcentajes variables entre 20% y 25% de los casos, produciendo
principalmente la perdida de peso en un 10-15% de los hospederos infectados.
As mismo se ha reportado la presencia y transporte de Clostridium difficile en
animales domsticos como perros y gatos con tasas de 40% y 38%
respectivamente.
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Partiendo de la informacin estadstica y de los casos clnicos investigados se
propone la investigacin de Clostridium difficile como microorganismo
presente en las muestras de los lechones muestreados. Se espera que la
incidencia no sea menor del 10% y que los resultados de la amplificacin de
ADN nos muestre una cepa enterotoxignica.
Se estudio se realizar en la Seccin de Bacteriologa, Escuela de
Microbiologa de la Universidad Nacional Autnoma de Honduras, entre los
meses de Junio a Diciembre del 2014.
El proyecto estar dividido en etapas: recuperacin, resiembra selectiva,
evaluacin bioqumica, amplificacin de ADN y electroforesis. As mismo se
realizara un anlisis estadstico bsico que nos permitir conocer la presencia
de Clostridium difficile y sus posibles implicaciones en el mercado porcino
local y nacional.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

importancia asociado a diarrea en lechones.
La medicina veterinaria ha subrayado la importancia de la misma como una
bacteria cuyo reservorio es el animal, as como sus implicaciones zoonticas y
su patogenicidad en diversas especies. Clostridium difficile ha sido
encontrado en aproximadamente el 20% de los productos crnicos de origen
britnico.
Internacionalmente la informacin epidemiolgica es escasa o no es clara, a
nivel nacional se desconoce si Clostridium difficile se encuentra presente en
aquellos lechones que presentan manifestaciones clnicas asociadas a este
microorganismo.
Nos proponemos la investigacin, mediante metodologas como la bacteriologa
tradicional y el diagnostico molecular, de este microorganismo en muestras de
hisopados rectales de lechones, en el departamento de Francisco Morazn,
Honduras, C.A.

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JUSTIFICACIN

Clostridium difficile ha sido asociado a enfermedad gastrointestinal en los
lechones y otros animales. Los datos epidemiolgicos muestran aumento y
variabilidad gentica entre las cepas que afectan a humanos y a especies
animales diversas.
El correcto manejo de animales y sus productos o derivados, constituyen uno
de los principales desafos a nivel mundial en materia de seguridad alimentaria.
Es por ello que estimamos que la inversin en investigacin y diagnostico
veterinario oportuno nos proporciona una garanta de mejoramiento e inclusin
en mercados internacionales mas exigentes.
El desarrollo de la presente investigacin nos ayudar a establecer los primeros
criterios epidemiolgicos que nos permitira establecer la relacin directa entre
las manifestaciones clnicas y la presencia del microorganismo, mediante el uso
de metodologas tradicionales y de biologa molecular, obteniendo as
resultados sensibles y especficos.

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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:
Determinar la presencia de Clostridium difficile en muestras de hisopado
rectal de lechones, en el departamento de Francisco Morazn, Honduras.

OBJETIVOS ESPECFICOS:
Hacer uso de tcnicas de bacteriologa tradicional y biologa molecular
para la determinacin de Clostridium difficile.

Estandarizar el mtodo de PCR para su posterior uso en investigaciones
asociadas y/o relacionadas.

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MARCO TERICO

importancia asociado a diarrea en lechones, su asociacin y prevalencia se ha
visto incrementada, aunque no claramente establecida, con el desarrollo de
diversos estudios realizados a nivel internacional. Clostridium difficile es una
bacteria de importancia sanitaria tanto en hospitales como en ambientes
laborales relacionados con la industria porcina. Clostridium difficile es una
bacteria ambiental y se ha asociado a diarreas tanto en humanos como en otros
animales. (1) (2)
La medicina veterinaria ha subrayado la importancia de Clostridium difficile
como una bacteria cuyo reservorio es el animal, as como sus implicaciones
zoonticas y su patogenicidad en diversas especies. Clostridium difficile ha
sido encontrado en aproximadamente el 20% de los productos crnicos de
origen britnico. Diversos autores han reportado el incremento en el diagnostico
asociado de enfermedades entricas severas en animales en los ltimos aos,
desplazando poco a poco a otras bacterias de estudio tradicional. (1) (3)
Recientemente se ha descrito un solapamiento entre las cepas caracterizadas y
los reservorios y/u organismos infectados. Sumado a lo anterior la prevalencia
de las enterotoxinas binarias A y B ha incrementado dramticamente para todas
las especies descritas. Expuesto lo anterior podemos asegurar que los
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productos alimenticios de etiologa crnica constituyen una importante ruta de
acceso para la diseminacin del patgeno as como de cepas que
anteriormente no haban sido caracterizadas en el hombre. (4)

CARACTERIZACIN DE Clostridium difficile
El gnero Clostridium es una bacteria bacilo largo, gram-positivo, formador de
espora, aerotolerante y anaerobio estricto. Algunas especies, tales como
Clostridium perfringens tipo A, tipo C y Clostridium difficile, han sido
sealadas como agentes etiolgicos de diversas enfermedades entricas que
van desde cuadros simples hasta cuadros mortales con gran impacto en la
economa de pequeos, medianos y grandes productores. (5)

1.1 Clostridium difficile

Clostridium difficile es una bacteria tpica en su genero. Como hemos
establecido previamente, es una bacteria bacilo largo, gram-positiva,
formadora de espora, anaerobia estricta. Esporula con mayor facilidad
que sus homologas en medios reductores, posee adems tiempos de
generacin mas cortos y son todos estos elementos que le brindan cierta
importancia con la interaccin en el microambiente del hospedador.
Epidemiolgicamente a nivel internacional, las diarreas asociadas a
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Clostridium difficile han sido reportadas en ciertos estudios con
porcentajes variables entre 20% y 25% de los casos, produciendo
principalmente la perdida de peso en un 10-15% de los hospederos
infectados. (5)

El aislamiento de Clostridium difficile proveniente de muestras de
porcinos fue reportado en 1983. El establecimiento de su prevalencia no
ha sido posible debido a la falta de informacin estadstica precisa. (6)

En aos recientes se han descrito brotes, tanto aislados como
regionales. Estos brotes han sido asociados a cepas genticamente
variadas y a algunas consideradas como hipervirulentas, siendo algunas
de ellas las que a continuacin se especifican en la tabla 1. (7) (8) (9)
Tabla 1. CEPAS DE Clostridium difficile ASOCIADAS A ENFERMEDADES EN
PORCINOS.
CEPA GENOTPO ENFERMEDAD
JGS655 (NO MVIL) A
+
B
+

TIFLOCOLTIS
NEONATAL
JGS692 (NO MVIL) A
-
B
-

JGS647 (NO MVIL) A
+
B
+

JGS652 (NO MVIL) A
+
B
+

JGS688 (NO MVIL) A
+
B
+

JGS691 (NO MVIL) A
+
B
+

RIBOTIPO 027 A
+
B
+

RIBOTIPO 078 A
+
B
+

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En el humano las manifestaciones clnicas de cepas hospedero-
especficas han sido desde asintomticas hasta diarreas severas con
infiltrado y lesiones tpicas en la regin cecal. (7)

As mismo se ha reportado la presencia y transporte de Clostridium
difficile en animales domsticos como perros y gatos con tasas de 40%
y 38% respectivamente. Tambin se encontr Clostridium difficile
proveniente de diversos sitios en clnicas veterinarias, tales como: pisos
de clnica, pisos de sala de operaciones, cuartos de recuperacin, sala
de tratamiento y salas de aislamiento. Lo anterior prueba la versatilidad
del patgeno y sus posibles interacciones con diversos medios. (10)

1.2 SIGNOS CLNICOS DE LA ENFERMEDAD, EN PORCNOS.

Las infecciones por Clostridium difficile en lechones, generalmente,
producen lesiones tpicas en la regin cecal, con cuadros de colitis
entrica necrotizante, edema mesocolnico, ascitis, hidrotrax, tiflocoltis
y diarrea. (6) (11)

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Otras manifestaciones de inters clnico-veterinario son:
a. Diarreas severas espontaneas
b. Estrs respiratorio
c. Prdida de peso
d. Muerte sbita

A nivel histopatolgico, es comn el hallazgo de edema mesocolnico,
con contenido pastoso-acuoso de color amarillento, inflamacin de
serosa y tambin la supuracin de la lamina propria con edema
mesentrico. La infiltracin de mononucleares inflamatorios y neutrfilos,
junto a la erosin segmental del epitelio mucoso colnico con lesiones
tipo volcn son tambin muy comunes y evidentes. Las manifestaciones
anteriormente descritas tienen una patognesis mediada por la accin de
las enterotoxinas A y B.
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Ilustracin 1. Necropsia de lechn, Edema de
colon. Tomado de Songer, J.G. et al. 2000

Ilustracin 2. Erosin superficial focal de
lamina propria, con infiltrado de
neutrfilos. Tomado de Yaeger, M et al.
2002

Ilustracin 3. Lesin de mesocolon. Tomado de
Songer, J.G. et al. 2000

Ilustracin 4. Lesiones tipo volcn en la
mucosa colnica con infiltrado de neutrfilos y
mononucleares. Tomado de Songer J.G. et al.
2000

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1.3 CRITERIO DIAGNSTICO
El diagnstico de infeccin por Clostridium difficile puede ser
establecido por la deteccin de las enterotoxinas A y B o por el cultivo del
microorganismo mediante tcnicas bacteriolgicas comunes. El
diagnostico de las enterotoxinas tiene preferencia ante el cultivo, debido
a su rapidez, sencillez y sensibilidad. Las enterotoxinas pueden ser
diagnosticadas a partir de muestras y raspados de colon, como de heces
fecales por medio de kits comerciales de ELISA. Las enterotoxinas son
lbiles y requieren un tratamiento y almacenamiento especial y expedito,
ya que la desnaturalizacin puede ocurrir si las muestras no son
refrigeradas una vez que haya sido recolectadas. (6) En bacteriologa se
ha encontrado que los aislamientos pueden ser toxignicos, pero
tambin pueden no serlo; es por esto que la importancia al preservar y
enviar las muestras a analizar de manera correcta son factores clave
para el diagnostico objetivo. Ver tabla 2. (5)
Tabla 2. SELECCIN DE MUESTRA Y OBSERVACIONES EN EL AISLAMIENTO DE
Clostridium difficile
TIPO DE MUESTRA OBESRVACIONES
TEJDO DE LECHONES
VIVOS O MUERTOS BIOPSIAS DE INTESTINO Y COLON,
ENVIADOS EN HIELO (NO CONGELADO)
HECES FECALES
HISOPADOS RECTALES EN MEDIO DE TRANSPORTE
ANAEROBIO O REDUCTOR, SI EL ENVO REQUIERE MAS DE 24
HORAS, ENVIAR EN HIELO (NO CONGELADO)

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1.4 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

1.4.1 MUESTRA
La muestra utilizada en su mayora para el cultivo y aislamiento de
Clostridium difficile es el hisopado rectal. La muestra deber ser
diarreica y/o mucoide, aunque son aceptadas tambin muestras de
consistencia blanda en animales con historial de diarreas espontaneas
previas o despus de tratamientos con antibiticos prolongados. (12)

1.4.2 TRANSPORTE Y PRE-ENRIQUECIMIENTO
La muestra recolectada deber ser inmediatamente inoculada en los
caldos de enriquecimiento selectivos. Algunos de los que pueden ser
utilizados son BHI (Infusin Cerebro-Corazn), FAB (Caldo para
Anaerobios fastidiosos) o TCCFB (Caldo Cicloserina-Cefoxitina Fructosa,
Suplementado con 0.1% Taurocolato de sodio) (13) (14) (15) (16)

1.4.3 CULTIVO
El cultivo deber ser procesado a partir de un inoculo proveniente de los
medios de enriquecimiento selectivos, las condiciones atmosfricas
debern ser anaerbicas y por 48 horas en medios especficos. El medio
de eleccin y con un uso de amplia distribucin es el CCFA (Agar
Cicloserina-Cefoxitina Fructosa). (17) (18) (19) La morfologa colonial
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tpica, despus de 48 horas de incubacin en anaerobiosis es: Colonias
planas o ligeramente elevadas, rizoides, de color amarillento
opalescente, con 4 milmetros de largo aproximadamente y con un fuerte
olor a caballeriza o desechos de caballo. Estas colonias emiten una
fluorescencia amarillo-verdosas bajo luz U.V. (18)

Ilustracin 5. Colonias tpicas de
Clostridium difficile en CCFA

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1.4.4 PRUEBAS BIOQUMICAS
Se utilizan pruebas para la utilizacin o degradacin de sustratos por
parte del microorganismo en estudio. Para tal fin pueden utilizarse kits
comerciales de enzimas preformadas como REMEL Sistema RapID
ANA II. A continuacin se presentan los sustratos utilizados para la
identificacin bacteriana. (20)

Tabla 3. Sustratos y Reactantes utilizados para la identificacin de anaerobios.
Sistema Rapid ANA II REMEL

El perfil bioqumico esperado para Clostridium difficile es el siguiente:
Tabla 4. Tabla de identificacin para Clostridium difficile.
BASADO EN PORCENTAJ E DE REACCIONES EN TOTAL DE AISLAMIENTOS EN CEPAS CONTROL

Organismo URE BLTS ARA ONPG GLU GLU GAL FUC NAG PO4 LGY GLY PRO PAL ARG SER PYR IND
Clostridium
difficile
0 2 0 2 8 3 0 0 0 9 2 0 99 43 48 16 6 0

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1.5 DIAGNSTICO MOLECULAR

Diversos autores han sealado la importancia de la deteccin a nivel
molecular (PCR) de Clostridium difficile para su correcta asociacin
con las manifestaciones clnicas de los sujetos de estudio. La
metodologa propuesta ser ampliamente discutida en la seccin del
diseo metodolgico correspondiente. (21) (22) (23)

1.6 TRATAMIENTO Y PROFILXIS

Se han realizado diversos ensayos para la implementacin de medidas
profilcticas eficaces y seguras. La utilizacin de ciertos frmacos como
Metronidazol y Vancomicina es prohibida en animales para consumo
humano. La Bacitracina metilen-disalicilato ha sido utilizada mostrando
buenos resultados en la profilaxis y prevencin de porcinos. Tambin se
ha utilizado Tiamulin, Virginiamicina y Tilosina. (11) (24)

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HIPTESIS

Clostridium difficile enterotoxignica, ser recuperada en no menos del 10%
de las muestras obtenidas y preservadas, a partir de hisopados rectales en
lechones.
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DISEO METODOLGICO

I. TIPO DE ESTUDIO:
DESCRIPTIVO TRANSVERSAL

II. AREA DE ESTUDIO:
MUESTRAS CONSERVADAS EN LA SECCIN DE
BACTERIOLOGA, DE HISOPADOS RECTALES, PROVENIENTES
DE LECHONES DEL DEPARTAMENTO DE FRANCISCO
MORAZN, HONDURAS, C.A.

III. UNIVERSO Y MUESTRA:
a. 40 MUESTRAS DE HISOPADO RECTAL EN MEDIO FAB.
b. 40 MUESTRAS DE HISOPADO RECTAL EN MEDIO BHI.

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IV. VARIABLES:
MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
CONDICIONES DE LA MUESTRA Y TOMA DE MUESTRA

V. MTODOS, TCNICAS E INSTRUMENTOS:
a. MTODOS
i. Cultivos bacteriolgicos
ii. Amplificacin de ADN y deteccin de Clostridium difficile
b. TCNICAS
i. Cultivo bacteriolgico de las muestras en medios de
enriquecimiento selectivo FAB y BHI.
1. Se inocularn hisopados rectales de los lechones
muestreados en los tubos conteniendo los medios
anteriormente especificados. Los tubos sern de vidrio,
resistentes, estriles, de rosca y contendrn 10 mL del
medio indicado.
2. Se proceder a la identificacin secuencial y lgica de las
muestras.
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3. Se preservaran las muestras en refrigeracin leve o
moderada hasta su arribo en el laboratorio de la seccin
de bacteriologa de la Escuela de Microbiologa en la
Universidad Nacional Autnoma de Honduras.
ii. Cultivo bacteriolgico selectivo de inculos de las muestras
en medios FAB y BHI en CCFA.
1. Las muestras inoculadas en los medios de
enriquecimiento selectivo sern conservadas a
temperatura ambiente por 7 das.
2. Posteriormente, las muestras sern mezcladas
vigorosamente y se proceder a la inoculacin con asa
bacteriolgica en los medios de cultivo CCFA.
3. Las placas sern sembradas por estra hasta agotamiento.
Luego debern ser incubadas en anaerobiosis (Sistema
OXOID) a 37C durante 48 horas.
4. Se resembrarn las colonias que cumplan con las
especificaciones de morfologa colonial y celular (Ver
seccin correspondiente en Marco Terico) en medio
CCFA y se incubar segn lo indicado en el apartado 3 de
la presente sub-seccin.
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5. Se preparar la muestra para la identificacin bioqumica.
iii. Identificacin bioqumica de los aislamientos que cumplan
con los criterios especificados para el medio selectivo de
cultivo.
1. Se proceder a rotular cada uno de los medios especiales
para preparar los inculos bacterianos. Para ello se
tomaran las asadas necesarias del cultivo puro y se
depositaran en los tubos con medio dispuesto para tal fin.
(Sistema Comercial REMEL)
2. Los inculos deben tener la concentracin final
determinada por turbidez equivalente al tubo 3 de la
escala de McFarland, es decir 9,0x10
8
UFC.
3. Los tubos con medio y muestra se mezclarn
completamente por vortex y se proceder al vaciado de los
mismos en las galeras de enzimas preformadas de accin
rpida.
4. Las galeras sern incubadas a temperatura de 37C, en
aerobisis por 4 horas.
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5. Se proceder segn las instrucciones del inserto comercial
para agregar los reactivos y proceder con la interpretacin
de los procesos de degradacin bacteriana.
6. Se registrarn los resultados obtenidos en dichas
interpretaciones en los cuadros provistos por el fabricante.
7. Se buscarn los resultados mediante la utilizacin de base
de datos propia de REMEL.
iv. Amplificacin de ADN de aislamientos identificados
bioqumicamente como Clostridium difficile.
1. Se preservarn las muestras en leche descremada para
su posterior utilizacin.
2. Las muestras sern sometidas a procesos de purificacin
celular para su amplificacin.
3. El proceso de amplificacin ser secuencial, utilizando una
metodologa modificada a conveniencia. (21) (22)
Amplificacin para gen Tpi
Para tal fin se utilizarn los cebadores con la secuencia
siguiente:
Tpi-F (5 AAAGAAGCTACTAAGGGTACAAA 3)
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Tpi-R (5 CATAATATTGGGTCTATTCCTAC 3)
4. Se utilizar el conjugado y los reactivos, de forma
modificada a conveniencia, ver tabla 5.
Tabla 5. Preparacin de Conjugado para amplificacin de gen Tpi.
COMPONENTE CANTIDAD
PCR MASTER MIX (1X)
12.5 L
10M Tpi-F [0.1 1.0 M]
0.25 - 2.5 L
10M Tpi-R [0.1 1.0 M]
0.25 - 2.5 L
10 % (vol/vol) Glicerol
2.5 L
H
2
O PURA VOLMEN NECESARIO
MUESTRA
1.0 5.0 L
VOLUMEN TOTAL 25.0 L

Amplificacin para toxinas A y B
Para tal fin se utilizarn los cebadores con la secuencia
siguiente:
tcdA-F (5-CCCAATAGATTCAATATTAAGCTT-3)
tcdA-R (5-GGAAGAAAAGAACTTCTGGCTCACTCAGGT-3)
tcdB-F (5-GGTGGAGCTGCTTCATTGGAGAG-3)
tcdB-R (5-GTGTAACCTACTTTCATAACACCA-3)
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5. Se utilizar el conjugado y los reactivos, de forma
modificada a conveniencia, ver tabla 6.
Tabla 6. Preparacin de Conjugado para amplificacin de gen Toxinas A/B
COMPONENTE CANTIDAD
PCR MASTER MIX (1X) 12.5 L
10M tcdA-F [0.1 1.0 M] 0.25 - 2.5 L
10M tcdA-R [0.1 1.0 M] 0.25 - 2.5 L
10M tcdB-F [0.1 1.0 M] 0.25 - 2.5 L
10M tcdB-R [0.1 1.0 M] 0.25 - 2.5 L
10 % (vol/vol) Glicerol 2.5 L
H
2
O PURA
VOLMEN
NECESARIO
MUESTRA 1.0 5.0 L
VOLUMEN TOTAL 25.0 L

6. Los ciclos programados en el termo-ciclador sern los
siguientes:
a. Desnaturalizacin (3 min a 95C)
b. Protocolo Touchdown o de aproximacin:
i. INICIO (30s a 95C)
ii. HIBRIDACIN (30s CADA UNO)
iii. CICLO 1 (65C)
iv. CICLO 2 (64C)
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v. CICLO 3 (63C)
vi. CICLO 4 (62C)
vii. CICLO 5 (61C)
viii. CICLO 6 (60C)
ix. CICLO 7 (59C)
x. CICLO 8 (58C)
xi. CICLO 9 (57C)
xii. CICLO 10 (56C)
xiii. CICLO 11 (55C)
xiv. CICLO 12 - 39 (55C)
xv. CICLO 40 (30s a 72C).
xvi. FINAL DE PROTOCOLO TOUCHDOWN
v. Electroforsis de ADN en gel de agarosa, para la
determinacin o deteccin molecular de Clostridium
difficile, Gen tpi y Toxinas A y B. (25)
1. Se utilizar como marcador bromuro de etdio.
2. Se utilizarn marcadores de peso molecular comerciales.
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c. INSTRUMENTOS, INSUMOS Y MATERIALES
i. Algodn, gaza, alcohol
ii. Bolsas para desechos bioinfecciosos
iii. Cmara para electroforsis
iv. Cebadores (Primers) comerciales, con secuencias pre-
diseadas y especficas.
v. Centrifuga
vi. Computador e impresora
vii. Equipo para bacteriologa (Asas, etc.)
viii. Incubadora
ix. Insumos de oficina
x. Laminas portaobjetos
xi. Medios de cultivo (CCFA)
xii. Micro-pipeteadores
xiii. Microscopio
xiv. Pinzas
xv. Placas de Petri
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xvi. Refrigeradora
xvii. Sistema de Identificacin Bioqumica Rpida REMEL
xviii. Software
xix. Software para identificacin de aislamientos
xx. Termo-ciclador
xxi. Transiluminador
xxii. Tubos de ensayo
xxiii. Vortex
VI. TCNICAS DE MUESTREO:
a. TIPO DE MUESTREO:
Muestreo aleatorio por conveniencia.
b. CRITERIOS DE INCLUSIN:
Muestras de heces diarreicas o blandas de lechones.
c. CRITERIOS DE EXCLUSIN:
Muestras de heces duras o formadas.
d. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO:
Hisopados rectales de lechones con diarrea o enfermedad
gastrointestinal.

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VII. PLAN DE TABULACIN Y ANLISIS
a. La informacin proveniente de los resultados de aislamiento ser
ingresada en una matriz generada en Ms. Excel 2010, para su
posterior anlisis y evaluacin.
b. Con los resultados obtenidos en la amplificacin de ADN de los
aislamientos identificados como Clostridium difficile por
bacteriologa tradicional, se ingresaran en una matriz generada en
Ms. Excel 2010, para su posterior anlisis y evaluacin.
i. Se obtendrn totales por universo.
ii. Se calcular incidencia de Clostridium difficile en tracto
gastrointestinal de los lechones.
iii. Se cuantificara cualitativamente la presencia de toxinas
enteropatgenas A y B o mixtas.
iv. Se realizarn graficas pertinentes para el anlisis visual y
estadstico de los resultados.
v. Se identificarn conclusiones obtenidas a partir del anlisis
estadstico de los resultados.
vi. Se propondrn recomendaciones pertinentes al mtodo y a
las tcnicas utilizadas.
vii. Se realizar una presentacin con Ms. Publisher de los
resultados y del informe final de la investigacin.
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BIBLIOGRAFA

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ANEXOS

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ANEXO 1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD FECHA DE EJECUCIN
Elaboracin del protocolo JUNIO 2014
Presentacin a asesor acadmico y
coordinadora de Orientacin en Microbiologa
Veterinaria
JULIO 2014
Recoleccin de muestras
JULIO
2014
Procesamiento de las muestras
JULIO OCTUBRE
2014
Anlisis e interpretacin de la informacin
OCTUBRE NOVIEMBRE
2014
Elaboracin del informe final
NOVIEMBRE DICIEMBRE
2014
Presentacin del informe final
EN SEMINARIO PROFESIONAL CIENTFICO
DICIEMBRE 2014

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ANEXO 2. RECURSOS Y PRESUPUESTO
RECURSOS
ORGANISMO
FINANCIADOR
TOTAL
UNAH OTRO
TALENTO HUMANO X
EQUIPO DE LABORATORIO X
EQUIPO MENOR Y MATERIALES DE LAB. X
MATERIALES DE OFICINA X L. 700.00
COMUNICACIONES X L. 200.00
TRANSPORTE X L.1,600.00
PRESENTACIN DE INFORME, SEMINARIO
Y GASTOS RELACIONADOS
X L. 800.00
TOTAL X L. 3,300.00

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ANEXO 3. PATOGNESIS DE Clostridium difficile
A NIVEL GASTROINTESTINAL

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ANEXO 4. INTERACCIN DE TOXINAS A/B DE Clostridium difficile
EN TEJIDO GASTROINTESTINAL

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ANEXO 5. HOJA DE RESULTADOS PARA
PERFILES BIOQUMICOS EN ANAEROBIOS

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