Uso del Western blot

para investigacin en
metabolismo
Jordi Daz Garca


INTRODUCCIN
El Western blot o inmunotransferencia es una tcnica
analtica usada para detectar e identificar protenas
especficas a partir de una muestra compleja con varios
tipos de otras protenas desconocidas.
Esta tcnica es un sistema muy rpido, especfico y muy
sensible para la deteccin de protenas concretas que se
beneficia de la propiedad de la especificidad de
reconocimiento entre una protena antignica y su
anticuerpo.
Es una combinacin de tres tcnicas analticas:
- Separacin mediante electroforesis.
- Electrotransferencia (electroblotting).
- Inmunodeteccin
Las tres tcnicas se desarrollan en seis pasos
fundamentales:
- Electroforesis de la muestra con las protenas.
- Transferencia de las protenas del gel a la
membrana de nitrocelulosa, PVDF u otros.
- Bloqueo de los sitios de unin no especfico de
anticuerpos.
- Incubacin con el anticuerpo especfico primario
- Lavado de reactivos y anticuerpos.
- Enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo.
El uso del western-blot se utiliza normalmente como una
prueba confirmatoria de la presencia o no de una
determinada protena en una muestra compleja y
adems podemos llegar a saber en qu proporcin se
encuentra. Esta caracterstica es particularmente
importante en el metabolismo para poder detectar los
niveles de expresin de ciertas protenas o enzimas en
diferentes condiciones celulares o patolgicas.












1. ELECTROFORESIS DE LA MUESTRA
Generalmente las muestras electroforticas provienen
de muestras tisulares que han sido previamente
tratadas mediante procesos mecnicos y qumicos que
provocan la lisis celular y han quedado solubilizado las
protenas propias del metabolismo celular en un mezcla
compleja.
A partir de esta solucin de partida que contiene una
mezcla compleja de multitud de protenas se procede a
la separacin de las protenas por electroforesis en
funcin del peso molecular.
La mayora de ensayos Western blot se realizan en geles
de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones
desnaturalizantes y de reduccin (DTT), las protenas
cargadas negativamente, cuando se someten a un
campo elctrico, migran al electrodo positivo. Debido a
que el SDS iguala la carga en todas las protenas, la tasa
de migracin viene determinada por su tamao
molecular. Por tanto, las molculas ms pequeas
migran ms rpidamente que aquellas con pesos
moleculares mayores producindose la separacin de la
mezcla de protenas en el gel.

Fig. 1. Electroforesis en SDS PAGE.
2. ELECTROTRANSFERENCIA O ELECTROBLOTTING
Una vez la electroforesis del gel ha concluido, las
protenas se transfieren a una membrana, generalmente
de nitrocelulosa o PVDF. La membrana es un soporte
slido que inmoviliza las protenas, permitiendo as que
la hibridacin de un anticuerpo pueda detectar a la
protena antignica que buscamos.
La mayora de los sistemas de transferencia utilizan la
generacin de un campo elctrico para conducir a las
protenas desde el electrodo negativo al positivo de
forma perpendicular desde el gel de poliacrilamida a la
membrana. Es esencialmente una transferencia
electrofortica, por lo que, la membrana resultante es
una copia exacta del patrn de protenas que se tena en
el gel de poliacrililamida.
Para comprobar la efectividad de la transferencia, las
protenas presentes en la membrana son teidas
dbilmente con rojo Ponceau. Al ser una tincin
reversible, posteriormente podr eliminarse de las
protenas para poder realizarse la unin con anticuerpos.



3. BLOQUEO DE LOS SITIOS DE UNIN INESPECFICOS
El paso siguiente al electroblotting sera bloquear la zona
con ausencia de protenas en la membrana para reducir
la unin inespecfica a su superficie de los anticuerpos
que se van a utilizar posteriormente para la deteccin de
la protena antignica de inters. Es decir, saturar toda la
superficie de la membrana no ocupada por las protenas
transferidas con otras protenas bloqueantes. Se evita
as la unin inespecfica de los anticuerpos a la
membrana si estuviese desprovista de estas protenas
bloqueantes evitando los falsos positivos.


En la actualidad se utilizan una amplia variedad de
tampones de bloqueo, a menudo, son soluciones a base
de protenas, como la leche descremada en polvo o la
albmina de suero bovino (BSA).
El tampn de bloqueo ideal se va a unir a todos los sitios
de unin inespecfica de la membrana, esto se conoce
como eliminacin del ruido de fondo. Es decir, lo que
hacen los tampones de bloqueo es incrementar la
sensibilidad del ensayo reduciendo los lugares de unin
no especficos al anticuerpo (ruido de fondo), adems de
evitar los falsos positivos.








4. HIBRIDACIN DEL ANTICUERPO
Despus del proceso de bloqueo, la membrana se
incuba con el anticuerpo primario especfico contra la
protena antignica que buscamos. En general, los
anticuerpos reconocen una secuencia de aminocidos
pequea (eptopo) que queda expuesta al desorganizar
la estructura tridimensional de la protena inmovilizada
en la membrana en condiciones desnaturalizantes y
reductoras.
En la transferencia Western se puede utilizar, tanto
anticuerpos primarios monoclonales como policlonales.
Fig. 2 Montaje del equipo en el aparato electrofortico debe seguir una secuencia especfica: apilar sobre una esponja plana papel de filtro empapado en
tampn, el gel, la membrana en contacto directo con el gel, ms papel de filtro y finalmente una esponja plana. Nota: si no colocamos las diferentes capas
en el orden correcto, respecto al sentdo de la corriente, se producira una transferencia de la protenas al tampn de la cubeta y no a la membrana.
Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se
obtienen de forma diferente.
Los anticuerpos policlonales son bastante ms baratos,
son mezclas heterogneas de anticuerpos, cada uno
especfico para los diversos eptopos de un antgeno. Al
reconocer mltiples eptopos o lugares de unin de una
misma protena incrementa la sensibilidad pero tambin
reduce la especificidad, por tanto, mayor probabilidad de
producir reaccin cruzada con otras protenas diferentes
que pueden tener mismos eptopos y provocar falsos
positivos.
Los anticuerpos monoclonales son muy valorados por su
gran especificidad, son todos idnticos y, por tanto,
reconocen un nico eptopo. Este hecho le reduce
sensibilidad debido a que slo un anticuerpo se une a
cada protena, pero le aporta mayor especificidad y
menor probabilidad de provocar reaccin cruzada con
otras protenas diferentes y sufrir menos falsos positivos.

5. INMUNODETECCIN
La deteccin de la protena se puede hacer mediante
mtodos directos o indirectos, cada uno tiene sus
ventajas e inconvenientes.
Los mtodos directos utilizan un anticuerpo primario
contra la protena diana sobre la superficie de la
membrana y conjugado con una enzima, biotina, una
molcula fluorescente o con radioistopos segn el
mtodo de deteccin que se quiera utilizar.
Los mtodos indirectos utilizan dos anticuerpos: un
anticuerpo primario (monoclonal siempre que se pueda)
contra la protena antignica que queremos buscar, y un
anticuerpo secundario contra el anticuerpo primario (si
el anticuerpo primario es un anticuerpo monoclonal de
ratn entonces el anticuerpo secundario debe ser un
anticuerpo secundario anti-IgG de ratn obtenido a partir
de otro animal que no sea ratn). Este anticuerpo
secundario ser preferentemente policlonal e ir
marcado en funcin del mtodo de deteccin que se
utilice.
Los mtodos ms comnmente utilizados para detectar
protenas son:
- Quimioluminiscencia
- Fluorescencia
- Colorimetra.
Los radioistopos se utilizaban ampliamente en el
pasado, pero son caros, tienen una vida til corta, y no
ofrecen ninguna mejora en la relacin seal:ruido.
Adems requieren un manejo muy delicado y un
equipamiento especial. Las alternativas actuales se
decantan por el uso de enzimas y fluorforos.






















Deteccin directa Deteccin indirecta
Ventajas
- Ms rpido ya que se
realiza en menos pasos.

- Menos posibilidad de
unin no especifica.

- Se elimina la posible
reaccin cruzada del Ac 2
- Se incrementa la
sensibilidad ya que cada Ac
1 posee numerosos
eptopos a los que puede
unirse el Ac 2 marcado.

- Versatilidad. El mismo Ac 2
puede utilizarse para
diversos anticuerpos de la
misma especie.

- No se afecta la
inmunoreactividad del Ac 1
por el marcaje.
Inconvenientes
- La inmuroreactividad del Ac
1 puede verse disminuida
por el marcaje.

- Ms costoso
- Ms lento, se necesitan
ms paso.

- Mayor probabilidad de
unin no especfica y
reaccin cruzada (falsos
positivos).
Anticuerpos Primarios:
Monoclonal vs Policlonal.

El primer paso en la produccin de ambos anticuerpos, es
la inyeccin de un antgeno en un animal, para provocar
una respuesta inmune y producir los anticuerpos que se
desean. Los anticuerpos policlonales se obtienen
directamente a partir del suero del animal, conejo, cabra,
ratn, etc., que contendr anticuerpos contra todos los
antgenos a los que ha estado expuesto el animal;
finalmente es purificado y probado. Los anticuerpos
policlonales reconocen mltiples eptopos del antgeno y
en cambio los monoclonales reconocen un nico eptopo
de la protena. Para la sntesis de un anticuerpo
monoclonal, las clulas que sintetizan anticuerpos
(linfocitos B) se aslan del bazo del animal y se fusionan
con clulas del mieloma que se caracterizan por su
inmortalidad. Lo hibridomas resultantes secretan
anticuerpos al medio de cultivo, el cual se analiza y
determina la afinidad al antgeno. Los hibridomas heredan
caractersticas fenotpicas de ambas clulas parentales,
de tal manera que son capaces de indefinidamente en
medios de cultivo y producir el anticuerpo monoclonal
especfico constantemente. De esta forma, se pueden
preparar fcilmente anticuerpos monoclonales de
prcticamente cualquier especificidad deseada.

5.1. Quimioluminiscencia
Los mtodos de deteccin de quimioluminiscencia
utilizan comnmente anticuerpos secundarios
conjugados con una enzima peroxidasa. La reaccin
entre el enzima y el substrato produce luz, que puede
ser detectada mediante la exposicin de la membrana a
una pelcula de rayos X o captada de forma digital
utilizando una cmara.
Los sustratos quimioluminiscentes difieren de otros
sustratos en que la seal es un producto transitorio de la
reaccin y persiste slo mientras se est produciendo la
reaccin enzima-sustrato, y no es el producto formado el
que emite luz. As en cuanto se agote el sustrato, la
reaccin cesar y se perder la seal.
Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse
para reutilizarse con una nueva adicin de anticuerpos y
visualizar otra protena, ahorrndose volver hacer ms
electroforesis y transferencias. Adems se pueden hacer
mltiples exposiciones en pelculas de rayos X o captarla
de forma digital hasta conseguir la mejor imagen.
La alta sensibilidad de los sustratos quimioluminiscente
hace que sea posible cuantificar cantidades de protenas
muy pequeas, ya que, la emisin de luz es proporcional
a la cantidad de protena.
Inconvenientes: requiere una habitacin oscura (pelcula
rayos X) o sistemas de imagen caros. La seal
quimioluminiscente tiene una vida media limitada que se
desvanece en poco tiempo. No son posibles detecciones
multiplex (deteccin de ms de una protena porque slo
ofrece un color de reaccin).

5.2. Colorimetra
Los mtodos colorimtricos utilizan un Ac secundario
que ha sido conjugado previamente a una enzima
(peroxidasa o fosfatasa alcalina). La enzima convierte el
substrato en un producto insoluble coloreado que
precipita y puede ser visualizado en la propia membrana.
La cantidad de colorante producido es proporcional a la
cantidad de protena. La intensidad de la tincin puede
ser medida por espectrofotometra.
Ventajas: muy barato y sencilla de realizar, no requiere
cmara oscura ni instrumentacin especial y las
membranas se pueden registrar fcilmente mediante
fotografa o escaneado con el fin de hacer una rplica
permanente.
Inconvenientes: no es tan sensible como la
quimioluminiscencia y la fluorometra mtodos y el color
se desvanece con el tiempo.























5.3. Fluorescencia
El anticuerpo secundario se une a un fluorforo, que
cuando es excitado con una determinada longitud de
onda emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un
dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante
una cmara provista con los filtros de longitud de onda
apropiada y poder digitalizar su imagen y registrarla
permanentemente.
Ventajas: alta sensibilidad y requiere pocos pasos pero
necesitan equipos algo ms especiales. Permite una
deteccin muy precisa y una cuantificacin de la
protena antignica ms exacta que la de la
quimioluminiscencia. Se pueden realizar ensayos
multiplex para detectar mltiples protenas. Aporta datos
cuantificables. Pueden usarse Ac primarios marcados
(para protenas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden
ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para
protenas poco abundantes).
Fig. 3. Mtodos de deteccin directa e indirecta.
6. UTILIDAD DEL WESTERN BLOT PARA EL ESTUDIO DEL
METABOLISMO
En el metabolismo se dan multitud de reacciones
qumicas procesadas por protenas enzimticas. Se
convierten en elementos claves en el funcionamiento de
las diferentes vas metablicas puesto que su regulacin
y control consigue adaptar las diferentes vas
metablicas a las diferentes circunstancias fisiolgicas
del organismo.
Por tanto, su conocimiento es crucial para el
entendimiento de las diferentes funciones biolgicas y
patolgicas de los organismos vivos.
En la actualidad, se dispone de una extensa gama de
tcnicas de laboratorio con objeto de aumentar el
conocimiento de estas macromolculas catalticas. En
muchas ocasiones es fundamental identificar
exactamente qu tipo de protena est implicado en un
determinado proceso, cmo opera, cuando lo hace y en
qu cantidad se halla en los diferentes escenarios
metablicos.
La tcnica Western blot permite desvelar informacin
muy precisa sobre las protenas, pero principalmente se
utiliza para detectar e identificar una sola protena
especfica a partir de una muestra compleja con varios
tipos de otras protenas desconocidas. La especificidad
de Western Blot se logra, como ya sabemos, mediante la
utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un
eptopo nico de la protena de inters.
Con la tcnica de Western Blot se puede estimar otros
parmetros complementarios como:
- El tamao de una protena.
- La cantidad relativa dentro de una mezcla de
protenas y otras molculas y as poder comparar
cuantitativamente los niveles. Este parmetro es
importante para poder observar los niveles de
expresin de las distintas protenas enzimticas
en distintas circunstancias metablicas.
- Confirmar la presencia de modificaciones post-
traduccionales como la fosforilacin.
- Detectar interacciones entre protenas. Hay
protenas enzimticas que pueden ser miembros
de un complejo ms grande de protenas o bien
pueden interactuar de forma transitoria para
modificar a otra protena. La asociacin fsica de
dos o ms protenas diferentes puede hacerse
precipitar mediante una inmunoprecipitacin y
luego poderlas separar e identificar los diferentes
miembros mediante un Western blot.




















Fig. 4. Inmunoprecipitacin ms electroforesis y Western Blot para
comprobar interacciones entre protenas.