Administracin de fructosa rpidamente induce el estrs oxidativo que provoca

cambios compensatorios metablica heptica. Se evalu el efecto de un

antioxidante, R/S--lipoico en estrs oxidativo inducido por fructosa y cambios del
metabolismo de carbohidratos.
Mtodos: Ratas Wistar fueron alimentadas con una dieta comercial estndar, la
misma dieta ms 10% de fructosa en agua potable, o inyectado con R/S--lipoico
(35 mg/kg, i.p.) (control L y fructosa L). Tres semanas despus, la sangre muestras
fueron dibujadas a medida de glucosa, triglicridos, insulina y la homeostasis
modelo evaluacin-insulina Matsuda ndices y resistencia (HOMA-IR). En el hgado,
medimos la expresin gnica, contenido de protena y la actividad de varias
enzimas y metabolitos concentracin.
Resultados: Cambios de peso Comparable y de caloras se registraron en todos los
grupos despus de los tratamientos.
Fructosa alimentado ratas tena hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, mayor
HOMA-IR y lowerMatsuda ndices comparados para controlar los animales.
Fructosa alimentado ratas mostraron fructoquinasa aumento de la expresin
gnica, contenido y actividad de la protena, glucokinase y glucosa-6-fosfatasa
gene expresin y actividad, almacenamiento de glucgeno, glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa mRNA y actividad enzimtica, (NAD (P) H oxidasa subunidades
gp91phox y p22phox) gene expresin y concentracin de la protena y contenido
proteico de Fosfofructoquinasa-2 de controlan de ratas. Todos estos cambios
fueron prevenidos por R/S--lipoico cido co-administracin.
CONCLUSIONES: Fructosa induce cambios metablicos hepticos que
presumiblemente comienzan con fructosa creciente
fosforilacin por fructoquinasa, seguida de cambios adaptativos que intentan
cambiar el flujo de sustrato del metabolismo mitocondrial
para almacenamiento de energa. Estos cambios pueden prevenirse efectivamente
por la administracin concomitante de cido
R/S--lipoico.
Significado general: Control del estrs oxidativo podra ser una estrategia til para
evitar que la transicin de la deteriorada
tolerancia a la glucosa a diabetes tipo 2.


Introduccin
Varios autores han sugerido que el aumento del uso de los
carbohidratos refinados como jarabes ricos en fructosa ha contribuido
enormemente a las epidemias de de la obesidad y la diabetes tipo 2
[1,2]. Adems, muchos investigadores han demostrado que la
administracin de dietas ricas en fructosa para ratas normales induce
varias disfunciones metablicas y endocrinas, afectando muchos
tejidos y rganos [3-6]. Puesto que el hgado es principalmente
responsable para la absorcin de la fructosa y el metabolismo, un
nmero de estudios ha versado sobre su efecto en el metabolismo de
la glucosa heptica [7,8]. Aunque no el mecanismo subyacente de
efectos perjudiciales inducida por fructosa es completamente
entendida evidencia experimental sugiere que el estrs oxidativo
podra desempear un papel clave [9-12]. En este sentido, tenemos
previamente demostr que la administracin de fructosa a corto plazo
en ratas normales induce una mejora significativa de los marcadores
de estrs oxidativo en varios rganos incluyendo el hgado [3,4],
asociados a resistencia a la insulina, un interruptor de metabolismo
heptico de carbohidratos y lpidos hacia su camino anablico e
intolerancia a la glucosa [5,6,13,14]. Si los cambios habian mencionado
que estaban vinculados especficamente a fructosa-inducidos
oxidativo estrs, entonces la administracin de un agente antioxidante
debera evitar/aliviar el desarrollo del estrs oxidativo. Apoyando esta
hiptesis, previamente hemos demostrado la coadministracin de un
antioxidante, R/S--lipoico a fructosa consumieron previene tanto
estrs oxidativo y la mayora de las disfunciones endocrino-metablica
provocadas por fructosa [15]. No sabemos, sin embargo, el potencial
vnculo molecular entre estrs oxidativo inducido por fructosa y el
metabolismo de los carbohidratos deterioro resultante. En la serie de
experimentos descritos en este documento se examin el efecto de
R/S--lipoico cido co-administracin en metabolismo de
carbohidratos en fructosa consumieron para clarificar los mecanismos
adaptativos involucrados en inducido por fructosa oxidativo estrs
que puede ser la base para las estrategias para la comprensin de la
de la obesidad y tipo 2 diabetesmellitus frecuentemente asociados con
consumo de alta fructosa.

Materiales y mtodos
2.1. Los productos qumicos y medicamentos reactivos del grado ms
puro disponible se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
Estados Unidos). Una solucin inyectable (Megatioc ) de R/S--
lipoico fue adquirida de John Martin S.R.L (Buenos Aires-Argentina).
2.2. animales
Wistar macho Normal ratas (150 180 g) fueron mantenidas a 23 C
con un ciclo fijo de oscuros 12 h (6:00 18:00 h) y divididas en 4
grupos de: dieta comercial estndar ad libitum y agua del grifo
(control),la misma dieta ms el 10% de fructosa en los agua potable
(fructosa) y grupos de dos adicionales que fueron inyectados con R/S-
-lipoico (35 mg/kgi.p) (control L y fructosa L) durante los ltimos
cinco das de del tratamiento. Control y fructosa animales fueron
inyectados con el mismo volumen de tampn salino. La ingesta de
agua se midi diariamente, y se registr el peso de cuerpo individual
semanal. Este procedimiento fue Replica 5 veces (en total, 20 animales
por grupo). Veintin das despus de este tratamiento, las muestras de
sangre de animales ayunas 4-h fueron extradas del plexo retroorbital
bajo luz halotano anestesia y recogidas en tubos heparinizados para
medir la glucosa en la sangre, suero nivel immunoreactive de la
insulina y triglicridos. Despus, los animales fueron asesinados por
decapitacin y una porcin del lbulo medio del hgado fue quitada
para realizar todos los ensayos. Cuando los ensayos no fueron
realizado inmediatamente, el lbulo estaba inmerso rpidamente en
nitrgeno lquido y posteriormente almacenado en una congeladora en
el C 80; todas las actividades de la enzima se midieron en una
semana. Los experimentos con animales y manejo fueron realizada
segn los "principios ticos y directrices para los animales de
experimentacin
" (3 edicin 2005) de la Academia Suiza de medicina
Ciencias.



2.3. sricas
Glucosa se midi con la glucosa oxidasa Dios-PAPmethod (Roche
Diagnostics, Mannheim, Alemania), se determinaron los niveles de
triglicridos con un kit comercial (color TG GPO/PAP AA, Wiener lab,
Argentina) y los niveles de insulina inmunorreactiva fueron determinado
mediante radioinmunoensayo (Linco Research Inc., IN, USA). Valores de
glucemia insulina y ayuno suero fueron utilizados para estimar la resistencia
la homeostasis modelo evaluacin de la insulina (HOMA-IR) (suero insulina
(U/ml) ayuno de glucosa en sangre (mM)) / 22.5 [16]. El ndice de
Matsuda (sensibilidad a la insulina heptica) fue calculado con la frmula k /
ayuno plasma insulina (FPI) ayuno de plasma glucosa (FPG), donde k:
22.5 18 [17].
2.6. Western blot anlisis
Inmunodeteccin de glucoquinasa, 2 Fosfofructoquinasa (PFK-2),
fructoquinasa, p22phox y -actina fue hecho en homogenados del hgado.
Protena concentracin se cuantific mediante los anlisis de protena de
Bio-Rad [20]. Posteriormente, ditiotreitol y azul de bromofenol se aadieron
a una concentracin final de de 100 mM y 0,1%, respectivamente. Unin
inespecfica sitios de las membranas fueron bloqueados por la incubacin
durante la noche anterior con leche en polvo descremada a 4 C. Enzima
identificacin y cuantificacin se realizaron utilizando anticuerpos primarios
(cuadro 2). Diaminobenzidina (Sigma Co.) o quimioluminescencia mejorada
(GE Healthcare, UK) fue utilizada para desarrollo del color. Finalmente, las
bandas fueron cuantificado por densitometra sea utilizando el analizador
de Gel-Pro software. -actina densidad fue utilizada para normalizar el
contenido de protena: el contenido relativo de objetivo protena fue dividido
por el nivel de protena -actina relativa de cada grupo.
2.7. hgado glucgeno que contenido
Trozos de hgado fresco (400 mg) fueron colocados en 1 ml de 33%
KOH y se incubaron durante 20 min a 100 C. Entonces, 1,25 ml de
etanol ha sido aadido a cada tubo y la mezcla se incub durante 48 h
a 4 C y por ltimo se centrifug a 700 g por 20 min. El obtainedwere
de pellets resuspendi en 1 ml de agua destilada y 3 ml de solucin de
antrona (0,1% en el 84%
H2SO4) y se incubaron durante 20 min a 100 C. La absorbancia fue
medido fotomtricamente a 620 nm y los resultados se expresaron
como mol de glucgeno/mg de tejido [21].
2.8. hgado fructoquinasa actividad
Pedazos de liverwere homogeneizaron en bfer que contiene 25 mMHEPES
(pH 7.1), 100 mM KCl, 1 mM DTT y 0,1 mM EDTA; eran entonces girar a
10.000 g a 4 C durante 20 min y alcuotas del sobrenadante fueron
congelados para el ensayo de actividad adicional. Para medir el FK
actividad utilizamos un acoplado ensayo enzimtico basado en mtodos
existentes [22]. Brevemente, 10 20 l de la muestra fueron agregados a
200 l de la que contiene reactionmixture de 25 mM HEPES (pH 7.1), 6 mM
MgCl2, 25 mM KCl, 10 mM NaF, 5 mM D-fructosa, 0.2mm NADH,
fosfoenolpiruvato 1 mM, 40 U/ml piruvato quinasa, 40 U/ml lactato
deshidrogenasa y 50 mM n-acetil-D-glucosamina (para inhibir la
hexoquinasa pero conservan fructoquinasa actividad). La reaccin fue
iniciada por aadir 10 l de ATP (concentracin de final de 5 mM) y medir
cuantitativamente por consiguiente una disminucin de la densidad ptica a
340 nm durante 30 min.
2.9. heptica glucoquinasa actividad
Hgado trozos extrados de los animales se homogeneizaron en icecold
PBS con 0,1 mM PMSF, benzamidine 0,1 mM, 2 mM DTT, 4 g/ml
aprotinina y 0,3 Msucrose, pH 7,5. Alcuotas de los homogenados se
centrifugaron a 600 g para separar la fraccin nuclear. El
sobrenadante de se centrifug a 8000 y 100.000 g a 4 C, y el
sobrenadante resultante fue recogido e identificado como la fraccin
citoslica (cf), que contiene la forma funcional activa de la enzima.
Despus de eso, la fraccin nuclear, que contiene la forma inactiva de
glucokinase debido a su unin con la protena reguladora, se
resuspendido y se incub durante 12 minutos a 20 C en un
permeabilizingmedium que contienen 150 mmol/ml KCl, 3 mmol/l
Hepes, 2 mmol/l de TDT y digitonin de 0,04 mg/ml, pH 7.2. Al final de la
incubacin, las muestras fueron centrifugados (600 g) y el
sobrenadante digitonin fue eliminado y recogidos por otras
determinaciones (nf). Digitonin tratamiento permite
el lanzamiento de glucoquinasa de su protena reguladora, renderizado
una glucokinase soluble y activo. Glucokinase actividad fue finalmente
medido en alcuotas de las fracciones del hgado y el coeficiente de
actividad para cf/nf considerada como una medida indirecta de
translocacin de ncleo/citosol [5]. Tasas de la fosforilacin de la
glucosa en ambos fractionsweremeasured 37 C, pH 7,4, registrando
el aumento de la absorbancia a 340 nm en un bien establecida Enzima-
juntada fotomtrico ensayo [5,23]. Glucokinase actividad se obtuvo
restando la actividad medida en glucosa 1 mM (hexoquinasa) desde
que medido en glucosa 100 mM. La actividad enzimtica se expresa
como m-unidades/mg de protena. Una unidad de enzima actividad se
defini como 1 mol de glucosa-6-fosfato formado de glucosa y
ATP/min a 37 C.

Resultados
3.1. Consumo de agua y peso de cuerpo
Comparable cuerpo peso cambios se registraron en todos los grupos sobre
el perodo de 3 semanas de estudio (cuadro 3). Alimentados con fructosa y
animales fructosa L bebieron un mayor volumen de agua que control y L (55
11 y 47 12 vs 29 2 y 28 2 ml/da, respectivamente; b p 0.05). Por el
contrario, control y control L ratas comieron significativamente alimento ms
slido de fructosa y fructosa L ratas (21 1 y 22 1 vs 16 1 y 17 1
g/animal/da; b p 0.05). En consecuencia, mientras que el diario era de
ingesta de nutrientes (expresado como porcentaje) diferente en los grupos
experimentales (hidratos de carbono/protena/lpidos 45:43:12 para el
control y control L comparado con 59:32:9 y 57:34:9 para la fructosa y
fructosa L respectivamente), sus caloras intakewas comparable (control: 58
3; control L: 65 2 fructosa: 66 5; fructosa L: 66 4 kcal/da). La ingesta
diaria de caloras se calcul con base en la cantidad de ingesta diaria de
nutrientes (alimentos slidos adems de la fructosa en el agua) haba
multiplicado por 4 (carbohidratos y protenas) o 9 (grasa) caloras.


3.2. sricas
Fructosa-ratas alimentadas tenan concentraciones ms altas del suero
insulina y triglicridos que las ratas control (cuadro 3). El alto ndice de
Matsuda y HOMAIR los valores medidos en fructosa consumieron
demostraron la presencia de una disminucin de de la sensibilidad a la
insulina en el hgado y en los otros tejidos perifricos as como (cuadro 3).
La administracin concomitante de R/S--lipoico cido a estas ratas previno
el desarrollo de todos los metablicos y endocrinos cambios, as como el
respuesta disminuida general y heptica a la insulina; en consecuencia, los
diferentes parmetros probaron valores logrados comparables a los
registrados en las ratas control; este effectwas an mayor para los
triglicridos, en cual triglicridos concentraciones fueron baje que los
registrados en las ratas control (cuadro 3).
4. discusin
Previamente hemos demostrado que normalWistar ratas alimentadas con
fructosa para 21 das desarroll varios desordenes generalizados
metablicos y endocrinos [6]. Estos changeswere acompaado por aument
concentracin heptica de marcadores de estrs oxidativo y cambios
significativos en el metabolismo de carbohidratos y lpidos que canalizara
metabolitos del hgado preferencial a almacenamiento de energa en lugar
de oxidacin mitocondrial de [5,6,14]. Adems, utilizando el mismo modelo
animal, recientemente demostramos que R/S--lipoico cido co-
administracin previno el desarrollo de las concentraciones sricas de
triglicridos altos y contenido heptica, probablemente por la disminucin de
PPAR y su objetivo expresin de genes lipognicos [15]. As, estos
cambios seran parte del los mecanismos por los cual hgado compensa la
sobrecarga de sustratos lpidos [26], tal como ocurre en el modelo rico en
fructosa. Como hemos informado anteriormente [5], fructosa tambin induce
un aumento en la actividad heptica glucoquinasa. Puesto que no era la
actividad realzada acompaada de cambios significativos en la
concentracin de protena glucokinase gene expresin/ , el efecto
principalmente el resultado de un aumento significativo de en la
translocacin de ncleo/citosol glucokinase as como un aumento en la
concentracin de PFK2, un activador glucokinase citoslica [5].
Los datos actuales apoyan esos resultados y demostraron que la
coadministracin de R/S--lipoico a fructosa consumieron condujo los
valores de relacin nuclear citosol y PFK2 contenido a los registrados en
el control de animales. Especulamos que la fructosa inducida por aumento
de la produccin de especies reactivas de oxgeno desempea un papel
modulador activo en hgado glucokinase actividad.
Puesto que la insulina estimula la expresin gnica glucokinase va PI3K
[27-29] y las ratas alimentados con fructosa tienen hiperinsulinemia, podra
argumentarse que la hiperinsulinemia tambin contribuye al aumento
glucokinase actividad. Sin embargo, puesto que estas ratas demostraron
disminucin de insulina sensibilidad (HOMA-IR mayor y menores ndices de
Matsuda en alimentados con fructosa en comparacin con ratas control),
esta posibilidad parece menos probable .Mientras que el rango normal de
de esos ndices es confuso en roedores, la significativa diferencia entre los
dos grupos sugiere fuertemente que la fructosetreated los animales tienen
una sensibilidad de insulina disminuida como en comparacin con las ratas
de control no slo en el hgado (ndice de Matsuda) pero tambin global
(HOMA-IR).
Se ha alegado que oportuna y rpida adaptacin metablica a cambios en
la fuente de hidratos de carbono es fundamental para mantener la
homeostasis de energa y esa glucosa heptica ftil ciclismo desempea un
papel importante en ese proceso de [30]. Tambin se ha demostrado que en
los ratones, reciclaje de glucosa-6-fosfato glucosa heptica/ compensa
glucosa perifrica disposicin, con el fin de preservar la homeostasis de la
glucosa [31]. Un comparable aumento de glucoquinasa y actividad de
glucosa-6-fosfatasa fue medido en nuestras ratas alimentados con fructosa
(107 y 141% sobre el control de los valores, respectivamente), por lo tanto,
lo que sugiere que este ciclo ftil podra ser activamente operando en
nuestro modelo, disminuye el metabolismo de la glucosa y el flujo del
hgado sustratos a las mitocondrias para especies reactivas del oxgeno
produccin. Del mismo modo, el aumento de la actividad de glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa (enzima de la lanzadera de las pentosas fosfato
limitando) la actividad
y de depsito de glucgeno y grasa en el hgado sera parte del proceso de
adaptacin porque al mismo tiempo disminuye la sobrecarga de sustratos a
la mitocondria y refuerza el poder redox por aumentar la produccin de NAD
(P) H [32]. NAD (P) H juega un antioxidante importante papel por un
complexmechanism que incluye la reduccin de glutatin oxidado a glutatin
reducido a travs de la enzima glutatin reductasa, actuando como
coenzymefor peroxidasas (a travs de glutatin) y ha exigido para la
estabilizacin de la catalasa [32-34]. Refuerza el hecho de que R/S--lipoico
co-administracin evitado todos estos cambios nuestra interpretacin
original. El hecho de que R/S--lipoico cido co-administracin Mellado el
fructosa inducida por el gen mayor expresin y protena de NAD (P) H
oxidasa subunidad p22phox (hubo una reduccin simultnea de significativa
en gp91phox) tambin sugiere la existencia de una relacin entre la
produccin de especies reactivas de oxgeno mitocondrial y citoslica. Esta
posibilidad merece mayor investigacin. Nuestro consumieron fructosa tuvo
un aumento significativo de fructoquinasa mRNA, nivel de protena y apoya
los hallazgos de otros o dietas ricas en fructosa o sacarosa [35 37] usando
la actividad. Por otro lado , fructosa indujo aumentos en la expresin gnica
fructoquinasa, protena nivel y actividad en los hepatocitos cultivados [22].
Adems, dispone de se ha demostrado que fructosa estimula su propio
metabolismo mediante la induccin de fructoquinasa heptica expresin
[38,39] y establecer un ciclo vicioso de , es decir, aumento de fosforilacin y
aumento del metabolismo, as potenciar el efecto deletreo de fructosa
sobre metabolismo heptico [40]. Consistente con estos datos, los pacientes
con enfermedad de del hgado graso no alcohlico (EHGNA) retratan la
actividad fructoquinasa dos veces ms alta que la poblacin general
asociada a un consumo significativamente mayor de de bebidas azucaradas
(rico en fructosa) [22]. El hecho de que R/S-- lipoic cido co-administracin
a nuestro consumieron fructosa impidi que los cambios fructoquinasa
fuertemente sugiere que la actividad enzimtica no slo depende de la
sobrecarga de fructosa sino adems de la retroalimentacin positiva
efecto de algn metabolito rio abajo o seal. En este sentido, el estado
redox de los hepatocitos podra ser un candidato potencial: convincente
evidencia indica que mejora los niveles de radicales de oxgeno
especies pueden modificar la actividad de la protena o incluso alterar su
conformacin [41]. Sin embargo, una alteracin especfica mediada por
estrs oxidativa en fructoquinasa estructura es slo hipottica y necesita
ms apoyo experimental.
5. conclusin
En breve, nuestros resultados demostrar fructosa inducesmanymetabolic
cambios en el hgado que es probable que comienzan con un aumento en la
fosforilacin de la fructosa por fructoquinasa seguida de cambios
adaptativos que intentan cambiar el flujo de sustrato del metabolismo
mitocondrial para almacenamiento de energa. Todos estos cambios son
esencialmente prevenidos por la administracin concomitante de cido
lipoico R/S-- . Por lo tanto, el estrs oxidativo junto con fructoquinasa
aparecen ser keymediators de themetabolic cambios inducidos por la
fructosa. La reduccin de la actividad fructoquinasa por R/S--lipoico
sugiere que algunos compuestos de estrs oxidativo o un metabolito
producido posteriormente acta como una regeneracin positiva mantenga
su alto nivel en ratas alimentados con fructosa. Identificacin de tal un
enlace activo y el efecto de antioxidantes en la prevencin de de la
transicin de la tolerancia deteriorada de la glucosa a diabetes merece
estudios adicionales.













El ndice HOMA (Homeostasis Model Assessment) propuesto por Mathews y
colaboradores, en 1985,
19
es el mtodo ms utilizado para diagnosticar RI en la
poblacin peditrica. Se deriva de la interaccin entre la funcin celular y la
sensibilidad a la insulina en un modelo matemtico donde se utilizan las
concentraciones de glucosa e insulina en ayuno. El modelo se calibra con una funcin
celular de 100% y una resistencia a la insulina normal de 1 de acuerdo con la
siguiente frmula:
HOMA-IR= [insulina plasmtica en ayuno (U/ ml)*glucosa plasmtica en ayuno
(mmol/L)]/22.5.
20

El ndice HOMA tambin puede utilizarse para evaluar la funcin de la clula
pancretica utilizando el siguiente modelo matemtico:
HOMA-%= [20*insulina plasmtica en ayuno (U/ ml)] / [glucosa plasmtica en
ayuno (mmol/L) 3.5].