Os mtodos imunolgicos desenvolvidos para quantificar a concentrao de

antgenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade,

tornaram-se tcnicas padronizadas para pesquisa e aplicaes clnicas. ntre
esses mtodos, um dos mais usados o !"#$ %nz&me-lin'ed immuno sorbent
assa&(.
)esse mtodo, uma enzima, que reage com um substrato incolor para
produzir um produto colorido, covalentemente ligada a um anticorpo especfico
que recon*ece um antgeno alvo. #e o antgeno estiver presente, o comple+o
anticorpo-enzima ir, ligar-se a ele e a enzima catalisar, a reao. nto, a
presena de produto colorido indica a presena de antgeno. -rata-se de um
mtodo eficiente pois permite detectar quantidades de protena da ordem de
nanogramas %./
-0
g(.
)o !"#$, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser
monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior
especificidade.
1entre os diversos tipos de !"#$, destaca-se o !"#$ #$)12345.
)esse mtodo, o anticorpo de um antgeno particular , inicialmente, adsorvido no
6ell. 1epois, o antgeno %soro, urina ou outra soluo contendo o antgeno(
adicionado e se liga ao anticorpo. 7inalmente, um segundo e diferente anticorpo
ligado 8 enzima adicionado. )esse caso, a intensidade da reao proporcional
8 quantidade de antgeno presente. !ogo, permite mensurar at pequenas
quantidades de antgeno.
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.
Freemn nd !om"ny, #$$$%, ". &'#.(
htt")**+++.,llisto.si.-sherb.,).$.$*iml/$#*im0es*elis/.1"0
9uanto ao mtodo de revelao, pode ser direto ou indireto. )o primeiro, a
enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo,
enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.
O !"#$ constitui a base do teste para infeco por 5":. )esse teste,
protenas virais %os antgenos( adsorvem nos ;poos< %6ells( da placa de !"#$.
m seguida, adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos
antgenos. 7inalmente, anticorpos ligados 8 enzima ligam-se aos anticorpos
*umanos, propiciando a reao enzim,tica com mudana de cor.
EQUIPAMENTOS NECESSRIOS:
PLACA DE ELISA
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.
Freemn nd !om"ny, #$$$%, ". &'#.(
PIPETAS AUTOMTICAS
LEITOR DE ELISA
LAVADOR AUTOMTICO DE PLACAS
htt")**+++.1els.,om*im0enes*"i"et&.1"0
2eitor de tirs 3245A
htt")**+++.r,l,omer,il.,om.br*dr6e*i$$4.1"0
htt")**"ndor.lb0eminis.,om).7$7*im0es*
.8#$$9-l.1"0
htt")**+++.lb0eminis.,om*"-bli,idd*l9te,ni,9elis.htm
2eitor de "l,s 3245A
htt")**+++.lb0eminis.,om*"-bli,idd*l9te,ni,
9elis.htm
CUIDADOS:
1ata de validade e estocagem dos REAGENTES
=rocessamento e estocagem das AMOSTRAS
vitar contaminao e espuma no PREPARO DE
SOLUES
CALIBRAO de pipetas e demais aparel*os
LIMPEZA
PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUCHE:
4oloca-se, na placa de !"#$, soluo tampo contendo o
primeiro anticorpo com concentrao con*ecida e suficiente para
adsorver nos ;poos< %;6ells<( da placa. m geral, a soluo
saturada.
!avam-se os ;poos< com tampo de lavagem, de forma a retirar
o tampo, mas dei+ar o anticorpo aderido 8 placa.
$diciona-se soluo contendo protena de alto peso molecular,
como a >#$ %$lbumina de #oro >ovino(, com o ob?etivo de
bloquear as ,reas onde os anticorpos no aderiram na placa
%stios inespecficos(.
htt")**+++.iitri.or0*5er:4mm-nolo0y.shtml
1
O
ANTICORPO
2
O
ANTICORPO ANTGENO DA
AMOSTRA
ANTICORPO
LIGADO
MUDANA
DE COR
A;A<TA;O ;3) htt")**+++.med4yo-.t*lborbef-nde*te,hni6en*en=yme*eli=.0if
@ealiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAO da
placa est, cumprida.
"ncubao com as amostras %solues teste com antgenos em
concentrao descon*ecida devem ser adicionadas 8 placa(
)ova lavagem e o antgeno que reagiu com o anticorpo
previamente aderido 8 placa tambm permanecer, aderido. =or
outro lado, os antgenos no ligados sero removidos.
"ncubao com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
"ncubao com terceiro anticorpo anti-espcie con?ugado a uma
enzima, como a peroxidase. #egue-se outra lavagem.
$dio de substrato para revelao. -rata-se de um substrato
incolor que, quando ativado pela poro enzim,tica do ligante,
produz um produto final corado. $ mudana de cor pode ser lida
diretamente em aparel*o apropriado. m geral, bloqueia-se a
reao para evitar que o produto final fique muito escuro e
atrapal*e a leitura do teste. $lm de bloquear a reao,
possvel adicionar um ,cido que provoque mudana para uma
cor cu?a absorbAncia mel*or detectada pelo leitor de !"#$.
OBSERVAES IMPORTANTES
m geral, faz-se uma CURA PADRO! preenc*endo B
;poos< de uma fileira com concentraes crescentes e
htt")**+++."ositi:ehelth.,om*"ermit*Arti,les*
!olon>#$Helth*brhm'#.htm
htt")**+++.netri.,o.-6*im0es*elis#.1"0
con*ecidas de antgeno. $ curva serve como padro de
comparao para deduzir as quantidades de antgenos nas
solues-testes. O gr,fico fornecido por um programa
prprio para a leitura de !"#$.
2m outro controle feito o TESTE BRANCO! que consiste
na adio somente do tampo com o ob?etivo de avaliar se
*ouve contaminao durante o e+perimento.
O teste deve ser feito em DUPLICATA o" TRIPLICATA,
servindo de controle para os erros de manuseio. $ mdia
dos resultados deve ser avaliada e se *ouver diferena
significativa, o e+perimento deve ser repetido.
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA# se a amostra for
sangue, deve-se centrifugar, col*er o plasma ou soro, diluir
e analisar. 4lulas em cultura devem ser trituradas, o
tampo deve ter p5 adequado, substAncia detergente%para
htt")**+++.shiby0i.,o.1"*<rod?3*"rod96rie?#&&.htm
3@3A<2O ;3 !BRCA <A;RDO
lisar a membrana( e inibidores de proteases. 1epois,
centrifuga-se e col*e-se o sobrenadante para an,lise.