Tcnicas de Microscopa Electrnica de tejido animal

N. F. Cheville1 y J. Stasko2

abstracto

Las mejoras tcnicas en microscopa electrnica, tanto instrumental como preparativa,
permiten anlisis cada vez ms precisos. Las imgenes digitales para microscopa electrnica
de transmisin (TEM) pueden ser procesados por los programas de software que automatizan
las tareas y crear herramientas personalizadas que permitan la mejora de la imagen de brillo,
contraste y coloracin; para la creacin de selecciones rea rectangular, elipsoidales o
irregulares; y para la medicin de rea media y la desviacin estndar. Preparacin de la
muestra sigue siendo una fuente de error, ya que los orgnulos y arreglos espaciales de
macromolculas cambian rpidamente despus de la anoxia. Directrices para el
mantenimiento de la coherencia en la preparacin, el examen y la interpretacin se presentan
para diferentes modalidades de microscopa electrnica (EM).

Palabras clave
morfometra, estereologa, tomografa, inmunomicroscopa, microscopa electrnica
Microscopa Electrnica de Transmisin

La microscopa electrnica de transmisin (TEM) fue la herramienta de investigacin
importante en la biologa celular de los aos 1960 y 1980. Ultrathin secciones de tejidos
embebidos en resina aaden unas vistas nicas de thecell y establecieron nuestros modernos
conceptos de la morfologa orgnulo. A partir de entonces, durante varias dcadas, el uso de
TEM disminuy y con ella el nmero de laboratorios TEM y microscopistas de electrones.
Patlogos sin un conocimiento prctico de TEM fallaron toincludeit en sus protocolos de
diagnstico y de investigacin. En las publicaciones, era comn encontrar micrografas
electrnicas que tenan artefactos graves o haban sido impresos con un aumento tan bajo que
el lector no poda discernir en ella cualquiera de los componentes descritos en la leyenda de la
figura. Peor an, los profesores y los libros de texto comenzaron a utilizar los dibujos animados
de colores para representar ultraestructura orgnulo. El resultado final: un destacamento an
ms lejos de la realidad y la maravilla de la patologa celular segn lo revelado por TEM. A
pesar de esto, no persistieron en patologa veterinaria un ncleo de microscopistas de
electrones bien entrenados que seguan produciendo contribuciones a nuestra comprensin
de la enfermedad. En la ltima dcada, la riqueza de los datos de las nuevas tecnologas
microscpicas de luz ha sido la conduccin renovado inters en TEM y nuevas formas de ver
ultraestructura celular en 3 dimensiones de alta resolucin.
Hoy en da, cuando las muestras estn bien fijadas y embebidas y utilizando improvementsin
tcnicas existentes, tanto instrumental como preparativa, TEM clsico sigue revelando detalles
llamativos de los orgnulos celulares y sus alteraciones en la enfermedad. Las nuevas tcnicas
permiten que los datos ms reproducibles para el anlisis de la estructura celular y function.15
Las imgenes digitales pueden ser procesados por una increble seleccin de programas de
software que automatizan las tareas y crear herramientas personalizadas. Mejora de la imagen
para el brillo, el contraste y la coloracin; para la creacin de rectangular, elptica, o
selecciones de rea irregulares; para la medicin de rea media y la desviacin estndar; y
para la creacin automtica de los cambios mediante una herramienta varita todo mejorar los
anlisis de datos.3 Algunos de estos programas (como ImageJ, un programa de imagen de
procesamiento y anlisis escrito en Java de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD)
estn disponibles en lnea sin cargos. En la discusin de las tcnicas TEM que sigue, los
trminos en negrita son los candidatos para las bsquedas en lnea en www.pubmed.gov y
otros sitios de bsqueda.
A pesar de las nuevas tcnicas notables, la mayor fuente de error en las secciones delgadas
para TEM sigue estando en preparacin de la muestra. En la fijacin convencional y de
empotramiento en resinas epoxi a temperatura ambiente, la estructura orgnulo y
disposiciones espaciales de complejos macromoleculares cambiar rpidamente despus de la
toma de muestras de tejido. Por ejemplo, el citoesqueleto, complejo de Golgi, y el sistema de
endomembrane se remodelan en fracciones de secondtives y tampones para la fijacin. Con
una preparacin precisa, la estructura despus de la anoxia tisular. Esto requiere atencin a la
recogida de muestras, especialmente los tiempos de toma de muestras, el recorte, y la
temperatura de fixatures que llevan cidos nucleicos y protenas se conservan.
Aunque el poder de resolucin de los microscopios electrnicos es en la escala atmica, los
artefactos en las clulas y las muestras de tejido introducidas por muestreo, fijadores aldehdo,
deshidratacin, manchas, y el espesor de la seccin se reduce a nanmetros. Directrices
recomendadas para mantener la coherencia en glutaraldehdo inmersin de fijacin son los
siguientes:
Tiempo de muestreo: el intervalo de anoxia tisular a la fijacin debe ser slo unos pocos
segundos.
Tamao de la muestra: se requieren Blocks2 tejido mm2 (en general, cuanto menor es el
mejor).
La cuchilla nitidez y apopleja: nueva superficie de la hoja para cada muestra; rpidas y golpes
simples.
Fijador y tampn: las soluciones deben ser frescos sin desnaturalizacin de aldehdos o
desequilibrio de iones en tampones.
Temperatura de fijador: refrigerado (? * 4 F), ambiente (? * 65 F) y el cuerpo (? * 98 F) son
opciones.

Fijacin
En el protocolo estndar de preparacin, las muestras de tejido se fijaron en glutaraldehdo al
2,5% a pH 7,2 (a temperatura ambiente), durante 2 a 3 horas y se fijaron posteriormente en
OsO4 al 1% en tampn de cacodilato 0,1 M durante 60 minutos (Fig. 1). La fijacin con
glutaraldehdo solo o tetrxido de osmio (OsO4) por s sola causa artefactos que se evitan
sustancialmente cuando el tejido est doblemente fija. Fixesproteins glutaraldehdo bien pero
es duro con membranas. Lo contrario es cierto para OsO4which mejora el contraste de la
membrana, pero las protenas daa; es decir, el contraste de la membrana se ve reforzada por
OsO4 fijacin.
El paraformaldehdo (que produce efectos similares a la formalina) se utiliza para conservar la
antigenicidad de algunas protenas en inmunomarcaje. Se utiliza en combinacin con
glutaraldehdo (que se refiere como solucin de Karnovsky, que vara de 0,5% a 2% de
paraformaldehdo con 2% de glutaraldehdo).
Cuando fijador toma 1 minuto para llegar a la clula, orgnulos sufren de autolisis. Incluso
cuando fijador penetra en menos de 1 segundo, las reacciones de reticulacin son selectivos
(por ejemplo, glutaraldehdo slo reaccionar con ciertos residuos de aminocidos en las
protenas y no efectivamente cidos nucleicos reticular y molculas de hidratos de carbono). El
resultado es la extraccin molculas de desvinculados de la clula durante el enjuague y
dehydration.44
Cadodylate y fosfato buffers predominan en fijadores para microscopa electrnica, pero tenga
en cuenta que una alta concentracin de mitocondrias daos fosfato. En los casos en que los
tampones de fosfato son indeseables, tampones orgnicos tales como bis 1,4 piperazina (cido
2-ethanolsulfonic) (tuberas) podra ser considerada, ya que tiene menos efectos perjudiciales
sobre las clulas (Tabla 1). Es especialmente importante que la tincin y tampones ser
apropiados en la fijacin de los tejidos blandos calcificadas ya la redistribucin de sales de
calcio durante la fijacin puede dar lugar a interpretaciones errneas. Hay algo de
descalcificacin con OsO4 fijacin, y el aumento del tiempo de inmersin puede dar resultados
sorprendentes en los grados diferenciales de la calcificacin en las lesiones de los tejidos
intersticiales (Fig. 2).
Fijacin por perfusin a travs de cnulas en el sistema vascular tpicamente se realiza ya sea
por (1) la gravedad de perfusin mediada continua a presin de agua de 12 cm o (2) rodillo de
flujo pulsante la perfusin de la bomba mediada. En cualquiera de los casos, la perfusin de
fijador est precedida por una perfusin de tampn de prefijacin. Ambos mtodos dan
fijacin superiores de las clulas del parnquima, pero pierden las relaciones con las clulas de
la sangre y los vasos linfticos. En pulsada fijacin por perfusin de flujo de hgado, una
velocidad de flujo de 1 ml / g de tejido de hgado es recommended.73

(figura2-3)

Microondas fijacin asistida se puede utilizar tanto para microscopa de luz (LM) y TEM. La
energa de microondas se utiliza en combinacin con concentraciones bajas de glutaraldehdo
(0,05%) o ormaldehyde (2,0%) conserva rpidamente algunas lesiones; que puede ser
especialmente til para la fijacin de algunos antigens.35, 61 Para la fijacin de microondas
para LM, muestras de tejido deben ser no ms de 1 cm3. Criterios para el mximo xito para
microscopa electrnica incluyen (1) muestra de tejido de menos de 1 mm en 1 dimensin, (2)
la temperatura de irradiacin inferior a 50 C, (3) el tiempo de irradiacin de menos de 50
segundos, (4) la sustitucin inmediata de la solucin de post-irradiacin con tampn de
almacenamiento en fro, y (5) la fijacin del tejido dentro de los 5 segundos despus de la
eliminacin de la fuente de la sangre.
Recuperacin de tejido fijado con formalina mediante el reprocesamiento a travs de fijador
de glutaraldehdo permite para el descubrimiento de informacin valiosa para TEM de
diagnstico. Para ello, seleccionar muestras de 1 mm3 de tejido hmedo fijado en formol al
10%, enjuague y coloque en glutaraldehdo durante la noche, y luego proceder con el
protocolo de microscopa electrnica de rutina.
Fijado en formol, tejido incluido en parafina puede ser recuperada cuando ningn otro tejido
est disponible o se necesita una pieza especfica de que los datos para el anlisis. Para ello,
cortar pequeos trozos de tejido del bloque de parafina, retire la parafina en xileno, y
rehidratar los tejidos para amortiguar, y luego colocar los tejidos en glutaraldehdo y el
proceso de acuerdo a los resultados del procesamiento de EM rutina schedule.38 son a
menudo tiles a pesar de que los artefactos y vacuolas son prominentes (Fig. 3).
Incorporacin
Para empotramiento estndar para TEM, las muestras se deshidratan a travs de una serie de
etanol; transferido a varios cambios de un disolvente de transicin, xido de propileno; y
embebido en resina epoxi. La resina de epxido es intolerante con agua y dejar de polimerizar
correctamente si el tejido no es totalmente deshidratada; esto da lugar a bloques de goma que
son imposibles de cortar y los tejidos que son recuperables para corregir el problema. Adems,
el agua restante en la muestra durante la deshidratacin no permitir la incorporacin de los
medios de comunicacin para infiltrar completamente la muestra. Es crtico que la incrustacin
de ingredientes de la mezcla se mezclan a fondo antes de su uso. La mezcla incorrecta de los
ingredientes se traducir en bloques de tejido no endurecer lo suficiente. Proporciones
incorrectas o tiempo suficiente para la mezcla, as como aceleradores defectuosos o
insuficientes, pueden impedir la infiltracin y la polimerizacin adecuada. Excesivo vigor en la
mezcla para esto introduce burbujas de aire en la resina, lo que hace difcil el corte y har que
las muestras inestable en el haz de electrones. 6.
Fijado en formol, tejido incluido en parafina puede ser recuperada cuando ningn otro tejido
est disponible o se necesita una pieza especfica de que los datos para el anlisis. Para ello,
cortar pequeos trozos de tejido del bloque de parafina, retire la parafina en xileno, y
rehidratar los tejidos para amortiguar, y luego colocar los tejidos en glutaraldehdo y el
proceso de acuerdo a los resultados del procesamiento de EM rutina schedule.38 son a
menudo tiles a pesar de que los artefactos y vacuolas son prominentes (Fig. 3).
Incorporacin
Para empotramiento estndar para TEM, las muestras se deshidratan a travs de una serie de
etanol; transferido a varios cambios de un disolvente de transicin, xido de propileno; y
embebido en resina epoxi. La resina de epxido es intolerante con agua y dejar de polimerizar
correctamente si el tejido no es totalmente deshidratada; esto da lugar a bloques de goma que
son imposibles de cortar y los tejidos que son recuperables para corregir el problema. Adems,
el agua restante en la muestra durante la deshidratacin no permitir la incorporacin de los
medios de comunicacin para infiltrar completamente la muestra. Es crtico que la incrustacin
de ingredientes de la mezcla se mezclan a fondo antes de su uso. La mezcla incorrecta de los
ingredientes se traducir en bloques de tejido no endurecer lo suficiente. Proporciones
incorrectas o tiempo suficiente para la mezcla, as como aceleradores defectuosos o
insuficientes, pueden impedir la infiltracin y la polimerizacin adecuada. Excesivo vigor en la
mezcla para esto introduce burbujas de aire en la resina, lo que hace difcil el corte y har que
las muestras inestable en el haz de electrones.

(Figura 4)

Seccionamiento
Ultrathin secciones se cortan con un cuchillo de diamante, se pusieron sobre rejillas, y se
dejaron secar. El nmero de reas de cada tejido procesado se registra y el nmero de clulas
evaluado. Correlacin de datos de la seccin ultrafina con la de la seccin gruesa (por
histologa) es un evento crtico en la evaluacin de micrografas de electrones. Para patlogos
veterinarios, la evaluacin TEM de tejido patolgico est inherentemente en comparacin con
la histologa, tpicamente mediante el examen de secciones alternativa-un finas y gruesas
tcnica que se refiere a la luz como paralelo y microscopa electrnica.
Corte Preparatoria de secciones gruesas (1 m) de tejido resinembedded permite identificar
lesiones y recortar el bloque de tejido a un tamao pequeo apropiado para la seccin
delgada. Secciones gruesas se cortan con un cuchillo de cristal, se tieron con azul de toluidina
al 1% (1 minuto en una placa calefactora 60 C), enjuagar, secar, y examinados por LM. Las
secciones ultra delgadas (70 nm) se cortan con un cuchillo de diamante de las reas
seleccionadas. El uso de un segundo colorante en secciones gruesas proporciona una mayor
diferenciacin de los componentes del tejido. Fucsina bsica es un segundo mancha til; Por
ejemplo, despus de tincin con azul de toluidina, la seccin gruesa se mancha sobre el
portaobjetos durante 1 minuto con 0,5% fucsina bsica se mezcla igualmente con 0,25% de
brax, y la mancha se enjuaga con 70% de alcohol, seguido por un enjuague de agua (Fig. 4 ).
Seccionamiento de los cristales, cuerpos extraos, y lesiones mineralizadas puede requerir
secciones que son mayores que 70 nm. Cuando estas lesiones son destruidas por el haz de
electrones despus de mltiples intentos, un procedimiento de superposicin de la seccin de
resina puede ser til (fig. 5). Nueva tecnologa digital proporciona un haz de manera menos
intensa destruccin de seccin delgada es rara vez un problema.
La tincin de secciones ultrafinas
Rejillas teniendo secciones delgadas son procesados por la tincin positiva con metales
pesados para aumentar el contraste de tejidos. La tincin en bloque (antes de la
incorporacin) tambin se puede hacer para aumentar el contraste. Las manchas ms
comnmente utilizados para la TEM son acetato de uranilo y citrato de plomo. Acetato de
uranilo se puede utilizar para la pre-o tincin postembedding. Es tpicamente una solucin
acuosa al 2%, aunque algunas resinas necesitan un alcohlico (etanol o metanol) acetato de
uranilo para penetrar en la resina. La mancha citrato de plomo ms utilizada es el citrato de
plomo de Reynolds. Aunque consume tiempo para prepararse, el plomo de Reynolds es
estable, siempre que est protegido de dixido de carbono y luz. Se debe tener cuidado
durante el almacenamiento y la tincin desde citrato de plomo reacciona con dixido de
carbono atmosfrico para formar un precipitado fino de carbonate.7 plomo. Precipitados Stain
sern retenidos en cortes de tejido al agua o pH es inapropiado. Al hacer la mancha, no se
requiere conexin CO2 agua porque las manchas de plomo se precipitan fcilmente al entrar
en contacto con el CO2. Mientras que la tincin, es necesario proteger la solucin de tincin
durante el proceso de tincin, as como durante el almacenamiento. PH apropiado es
importante con esta mancha y no se puede variar de incluso 0,1 unidades de pH 12,0 o pobre
tincin y precipitacin mancha occur.38. Concentracin e Fotografiando el espcimen en el
TEM cuidadosa de enfoque es una de las funciones ms importantes que se requieren para el
uso TEM xito. Para obtener la mejor fotografa durante el examen de la seccin ultrafina de
colores, hay que mejorar el contraste, una tarea que requiere de los objetivos y
condensadores del microscopio electrnico para estar en la alineacin. El TEM utiliza un haz de
electrones de alta tensin emitida por un can de electrones para crear una imagen. El haz es
acelerado por un nodo, enfocada por las lentes electrostticas y electromagnticas, y lleva a
travs de la muestra, que es transparente a los electrones o los esparce fuera del haz.
La regla bsica de enfoque es que la mayor es la ampliacin, ms preciso ser el enfoque debe
ser y cuanto ms se debera ser el ajuste de enfoque verdadero o cerca. Verdadero o cerca de
enfoque es que el espcimen es exactamente en el plano conjugado al plano de imagen de la
lente objetivo. Los resultados ptimos se deben obtener de una micrografa centrado, pero un
cierto grado de underfocusing es y puede ser en general a favor. Desde focalizacin de la
imagen se ve afectada por las variaciones en la corriente de la lente del objetivo, lo mejor es
insuficiente y overfocus para asegurar que elementos en la muestra son genuinos.
En la produccin de micrografas electrnicas, la meta es siempre la generacin de datos
vlidos, no de micrografas electrnicas de una calidad particular. En la publicacin,
microscopistas de electrones enfrentan obstculos por evaluadores con experiencia TEM pero
poca comprensin de la naturaleza del foco del haz de electrones o la deflexin y la
profundidad de foco dentro de la seccin ultrafina. Nunca'' equilibrar la luz'' para crear un
fondo uniforme en la micrografa; que la manipulacin casi siempre destruye los datos, sobre
todo de pequeas vesculas y fragmentos de protenas que proporcionan datos importantes
para la interpretacin de los tejidos patolgicos (Figs. 6, 7).

(Figura 6 - 7)

Cryo-Microscopa Electrnica
Artefactos isqumicas y anxicas son inevitables debido a la fijacin de inmersin. La
introduccin de la crio-microscopa electrnica (CEM) en la dcada de 1980 permiti mejorar
las imgenes y la extensin de la resolucin para la determinacin de las estructuras celulares
y microbianos de micrografas electrnicas. Congelacin rpida, criopreparacin, y CEM menos
artefactos introducidos durante la preparacin de procesamiento qumico a temperatura
ambiente y, adems, permite imgenes de la muestra hidratada. CEM moderna implica
criofijacin por congelacin de alta presin (HPF), que, cuando se utiliza en combinacin con la
sustitucin de hielo vitrificado por disolventes orgnicos a baja temperatura (sustitucin de
congelacin), anula la mayor parte de las desventajas de la fijacin qumica. En cryotechniques
in vivo, particularmente cryobiopsy, 50 permiten que los patlogos para obtener muestras de
tejido de los animales y sin impactos de isquemia o anoxia en las clulas.
Criofijacin para inmunomarcaje se puede hacer en secciones Lowicryl de alta presin cells.13
congelado, 26,68 Un ingrediente crtico para fijadores para preservar la reactividad es
informado de que un cctel de 0,1% de permanganato de potasio combinado con 0,001% de
osmio tetroxide.65To fluorescencia para retener LM, las muestras estn incrustados en
metacrilato de glicol. Congelacin de alta presin es el primer paso para la conservacin de la
fluorescencia y la morfologa. Tcnicas de HPF y freezesubstitution permiten la inmovilizacin
casi instantnea de las muestras y evitar la fijacin y deshidratacin artefactos como
aggregation.67 protena. Tincin negativa TEM en tcnicas de tincin negativa para TEM han
permitido importantes avances en las ltimas dcadas mediante la definicin de los detalles
finos en las estructuras superficiales de bacterias y virus (Fig. 8), as como las membranas,
lpidos, y filamentos de protena, especialmente de B- hojas plisadas tales como amiloide. Para
la tincin, una suspensin de las partculas o fibras al ser examinados se mezcla con una
solucin diluida de material de electon-opaco, tal como cido phophotungstic, acetato de
uranilo, o molibdato de amonio, y se dej caer en una rejilla recubierta adecuadamente para
su examen. La tincin negativa es esencial para la identificacin de los virus en los fluidos. El
estudio de los poros de la membrana inducidas por la insercin de toxinas bacterianas intothe
membrana celular ha revelado la complejidad notable de reconfiguracin de la toxina para
formar poros que causan fugas citoplsmica y las clulas de lisis celulares en los fluidos.

(figura 6-8)

Cryo-tincin negativa proporciona enfoques tiles para estudios de alta resolucin de las
macromolculas y estructuras virales. Tincin negativa tradicional de secado al aire consiste en
especmenes absorbidos a las pelculas de soporte de carbn (con o sin agujeros). En la tincin
de crio-negativo, las muestras se congelan y hidratada o vitrificados utilizando mtodos
molybdate.14These amonio evitar la formacin de rouleau y otros artefactos cuando se estn
examinando las lipoprotenas.