ii

Resumen
El cido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina
dependiente que cataliza los primeros pasos de la ruta
biosinttica de los aminocidos de cadena ramifcada valina,
leucina e isoleucina Esta enzima se encuentra en plantas,
hon!os " bacterias por lo que es el principal blanco de acci#n de
herbicidas, $un!icidas " a!entes antimicrobianos El ciclo
catal%tico de la AHAS est constituido por cuatro pasos
principales En el primer paso el intermediario iluro realiza un
ataque nucleo$%lico sobre una molcula de piruvato para dar paso
a la $ormaci#n del intermediario (&S)'&'(actil')h*+ ((')h*+) (a
$ormaci#n de este intermediario necesita adems la presencia de
un hidr#!eno el cual en la AHAS es de procedencia desconocida,
debido a la inexistencia de !rupos ionizables cercanos a las
zonas del sitio activo de la enzima +or este motivo en la
presente tesis se estudi# el mecanismo de reacci#n para la
$ormaci#n del (')h*+, postulando que el !rupo encar!ado de
promover la trans$erencia prot#nica es el !rupo amino del anillo
de pirimidina cuando este se encuentra ba,o la $orma A+H- +ara
ello se realiz# una exploraci#n de la superfcie de ener!%a
potencial (SE+) de la reacci#n considerando a los sustratos
aislados en $ase !as Adems se realizaron clculos de las
$unciones de .u/ui para el sustrato piruvato, para el estado de
transici#n " para el intermediario iluro ba,o las $ormas A+ " A+H-
con el fn de contrastar la reactividad de ambas $ormas
tautomericas +or 0ltimo se realizaron clculos termodinmicos
utilizando medios de distintas constante dielctrica, con el
prop#sito de verifcar la estabilidad de $ormaci#n del
intermediario iluro ba,o la $orma A+H- debido a la protonaci#n
del anillo pirimid%nico por parte del aminocido !lutamato (os
clculos computacionales se realizaron con el paquete
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computacional 1A2SS3A4 56, empleando la teor%a de los
$uncionales de densidad (*.)) a nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p) para
la exploraci#n de la SE+ " 76(8+(='+=>)9:'6;;<
<1(d,p)9976(8+9:'6;<<1(d,p) para los clculos termodinmicos,
en tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete
computacional ?a!uar @@, empleando 76(8+9:'6;<<1(d,p) (os
resultados obtenidos indicaron que la $ormaci#n del (')h*+
ocurre de manera concertada, mostrando una barrera de
activaci#n de aproximadamente &; Acal9mol Adems se observ#
que es el iluro ba,o la $orma A+ quien realiza el ataque
nucleo$%lico sobre la molcula de piruvato
Abstract
Acetoh"drox" acid s"nthase (AHAS) is a thiamine'dependent
enz"me that catal"zes the frst steps in the bios"nthetic pathBa"
o$ branched chain amino acids valine, leucine and isoleucine
)his enz"me is $ound in plants, $un!i and bacteria ma/in! it the
main tar!et o$ action o$ herbicides, $un!icides and antimicrobial
a!ents )he catal"tic c"cle o$ AHAS consists o$ $our main steps 3n
the frst step the intermediate "lide per$orms a nucleophilic
attac/ on a molecule o$ p"ruvate to ma/e Ba" $or the $ormation
o$ the intermediate (&S)'&'lact"l')h*+ ((')h*+) )he $ormation o$
this intermediate also needs the presence o$ a h"dro!en Bhich is
o$ un/noBn ori!in in the AHAS, due to the absence o$ ionizable
!roups in the active site o$ the enz"me .or this reason in this
thesis studied the reaction mechanism $or the $ormation o$ ('
)h*+, postulatin! that the !roup responsible $or the protonation
is the amino !roup o$ the p"rimidine rin! Bhen the $orm is A+H-
3n order to validate this h"pothesis, the potential ener!" sur$ace
(+ES) Bas explored considerin! the reaction betBeen isolated
substrates in !aseous phase .urthermore, .u/ui $unction
calculations Bere per$ormed $or the substrate p"ruvate, $or the
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iii iii
transition state and $or the intermediate "lide under the $orms
and A+ and A+H- in order to compare the reactivit" o$ both
tautomeric $orms .inall" thermod"namic calculations Bere
per$ormed usin! diCerent dielectric media, in order to veri$" the
stabilit" o$ the intermediate "lide $ormation under the $orm A+H-
oBin! to protonation o$ the p"rimidine rin! b" the amino acid
!lutamate )he computations Bere per$ormed usin! the
1A2SS3A4 56 so$tBare pac/a!e, usin! the densit" $unctional
theor" (*.)) at 76(8+9:'6;<<1(d,p) $or the exploration o$ the
SE+ and 76(8+(='+=>)9:'6;;<<1(d,p)9976(8+9:'6;<<1(d,p) $or
thermod"namic calculations, Bhile reactivit" studies Bere
per$ormed usin! the so$tBare pac/a!e ?a!uar @@ emplo"in!
76(8+9:'6;<<1(d,p) )he results obtained indicated that the
$ormation o$ (')h*+ occurs in a concerted Ba", shoBin! an
activation barrier o$ approximatel" &; Acal 9 mol Also Bas
observed that the "lide in the A+ $orm is responsible $or the
nucleophilic attac/ on the molecule o$ p"ruvate
ndice general
CAPITUL !"
IntroduccinDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD
DDDDDD;
;& +ropuestas de investi!aci#n
:
;6 +ropuestas de investi!aci#n
;;
;E Hip#tesis " ob,etivos del traba,o de tesis
;6
;E; Hip#tesis
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iv iv
;6
;E& Fb,etivos
;6
CAPITUL #"
$etodologa ;E
&; =onstrucci#n de la SE+ con los sustratos aislados
;G
&& =lculos de reactividad
;@
&6 =lculos termodinmicos
;H
&6; =lculos en $ase !as
;H
&6& =lculos en soluci#n
;I
CAPITUL %"
Resultados & discusin &5
6; Exploraci#n de la SE+ con los sustratos aislados
&;
6;; SE+ a nivel semiempirico
&;
6;& =orrecci#n *.) de la SE+ a nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p)
&H
6;6 Fptimizaci#n de los puntos cr%ticos de SE+ *.) al
nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p)
65
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vv
6& Estudio de reactividad
6:
66 Anlisis termodinmico
6I
CAPITUL '" Conclusiones & pro&ecciones
E;
E; =onclusiones
E&
E& +ro"ecciones
E6
(ibliogra)a
EE
ndice de *guras
.i!ura ;J s%ntesis de (&S)'&'acetolactato " (&S)'&'aceto'&'
hidroxibutirato :
.i!ura &J estructura del co$actor tiamina di$os$ato con diedros K p
" K ) @
.i!ura 6J mecanismo de protonaci#n del co$actor )h*+
correspondiente a las etapas de activaci#n del co$actor para
$ormaci#n del intermediario 3luro H
.i!ura EJ estructura del co$actor .A*, las unidades de riboLavina,
adenina, ribosa " el !rupo di$os$ato I
.i!ura GJ ciclo catal%tico de la enzima AHAS reportado en
literatura ;5
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vi vi
.i!ura :J mecanismo de $ormaci#n del intermediario (')h*+ en
literatura ;&
.i!ura @J mecanismo postulado para la $ormaci#n del intermediario ('
)h*+ ;&
.i!ura HJ coordenadas de reacci#n para exploraci#n de SE+ en la
$ormaci#n del intermediario (')h*+ ;G
.i!ura IJ equilibrio termodinmico entre A+'3luro " A+H - '3luro
=on M;N =H & =H & FH ;H
.i!ura ;5J ciclo termodinmico para calculo de O 1 P del equilibrio
en soluci#n ;I
.i!ura ;;J representaci#n 6* de la SE+ a nivel semiempirico +>6
&&
.i!ura ;&J representaci#n bidimensional de la SE+ a nivel
semiempirico +>6 &&
.i!ura ;6J estructuras de los puntos cr%ticos de la SE+ a nivel +>6
optimizados en $ase !asJ (A) reactantes, (7) estado de transici#n
E);, (=) intermediario 3, (*) estado de transici#n E)&, (E)
producto (')h*+ &6
.i!ura ;EJ estructura rotulada del co$actor )h*+, correspondiente
al intermediario 3 &E
.i!ura ;GJ mecanismo de reacci#n propuesto para la $ormaci#n
del intermediario (')h*+ mediante clculos a nivel +>6 &@
.i!ura ;:J dia!rama de ener!%a para SE+ a nivel semiemp%rico
+>6 &@
.i!ura ;@J representaci#n 6* de la superfcie de ener!%a
potencial a nivel *.) &H
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vii vii
.i!ura ;HJ representaci#n &* de la superfcie de ener!%a
potencial a nivel *.) &I
.i!ura ;IJ estructuras de los puntos cr%ticos de la SE+ a nivel *.)
optimizados en $ase !asJ (A) reactantes, (7) estado de transici#n
E), (=) producto (')h*+ 65
.i!ura &5J estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel
*.) 6;
.i!ura &;J estructura del estado de transici#n E) con el
stretching simultneo de las coordenadas de reacci#n =&'=& Q "
HER'F& Q 6&
.i!ura &&J esquema de los clculos 3M= aplicados al estado de
transici#n E) 6&
.i!ura &6J estabilizaci#n por enlace de hidro!eno del sitio
pre$erencial de protonaci#n del anillo de aminopirimidina en la
$orma A+ con MS i!ual a G'(&'Thidroxidi$os$atoUetil)'E'metil';,6'
tiazol'6'io 66
.i!ura &EJ mecanismo de reacci#n propuesto para la $ormaci#n
del intermediario (')h*+ mediante clculos a nivel 76(8+9:'6;<
<1(d,p) 6G
.i!ura &GJ dia!rama de ener!%a para la SE+ a nivel 76(8+9:'6;<
<!(d,p) 6G
.i!ura &:J $unciones de .u/ui para el (A) A+H - '3luro, (7) A+'
3luro, (=) estado de transici#n E) " (*) piruvato .unci#n de .u/ui
para (E) piruvato 6:
.i!ura &@J %ndices at#micos de .u/ui para A+'3luro " A+H - '3luro
=on M;N =H & =H & FH 6@
.i!ura &HJ %ndices at#micos de .u/ui (A) " (7) para la
molcula de piruvato 6@
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f
+
f

f

f
+
f
+
f

f

viii viii
.i!ura &IJ %ndices at#micos de .u/ui " , en parntesis, para
el estado de transici#n E) de la SE+ *.) =on M;N =H&=H&FH
6H
.i!ura 65J equilibrio termodinmico entre A+'3luro " A+H - '3luro
=on M;N =H & =H & FH 6I
ndice de tablas
)abla 3J valores de las coordenadas de reacci#n M;, M& " de los
n!ulos diedros p " ) para los puntos cr%ticos de la SE+
optimizados en $ase !as a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano +>6 &6
)abla 33J valores de lon!itudes " n!ulos de enlace para los
puntos cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase !as a nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano +>6 &E
)abla 333J valores de car!as at#micas tras >+A para los puntos
cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase !as a nivel +>6 &E
)abla 3VJ valores de lon!itudes de enlace del anillo pirimid%nico
para los puntos cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase !as a nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano +>6 &:
)abla VJ ordenes de enlace de >ulli/en del anillo pirimid%nico para
los puntos cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase !as a nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano +>6 &:
)abla V3J valores de car!as at#micas tras >+A para el anillo
pirimid%nico del co$actor )h*+ en el mecanismo de reacci#n
obtenido a nivel +>6 &:
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i+ i+
)abla V33J valores de las coordenadas de reacci#n M;, M& " los
n!ulos diedros p " ) para los puntos cr%ticos de la SE+ en
$ase !as a con el mtodo *.) a nivel :'6;<<1(d,p) 65
)abla V333J valores de lon!itudes de enlace de los puntos cr%ticos
de la SE+ optimizados en $ase !as a nivel 76(8+ :'6;<<1(d,p)
6;
)abla 3WJ valores de n!ulos de enlace para los puntos cr%ticos de
la SE+ optimizados en $ase !as a nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p)
6;
)abla WJ valores de ordenes de enlace para los puntos cr%ticos de
la SE+ optimizados en $ase !as a nivel 76(8+ :'6;<<1(d,p)
6;
)abla W3J valores de car!as at#micas tras anlisis 47F para los
puntos de cr%ticos de la SE+ a nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p) 66
)abla W33J valores de lon!itudes de enlace para el anillo
pirimid%nico de los puntos cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase
!as a nivel 76(8+ :'6;<<1(d,p) 6E
)abla W333J valores de ordenes de enlace 47F para el anillo
pirimid%nico de los puntos cr%ticos de la SE+ optimizados en $ase
!as a nivel 76(8+ :'6;<<1(d,p) 6E
)abla W3VJ valores de car!as at#micas del tipo 47F para el anillo
pirimid%nico del co$actor )h*+ en el mecanismo de reacci#n a
nivel 76(8+9:'6;<<1(d,p) 6E
)abla WVJ valores de 1P para la reacci#n acido base entre el
residuo altamente conservado 1lu;6I, simulado con una
molcula de acido actico " A+'3luro 6I
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++
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