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MARCO TEORICO

ACTIVIDAD E INHIBICION ENZIMATICA - TIROSINASA



La Tirosinasa es una oxidasa responsable del proceso de melanizacin en animales y del
pardeamiento en vegetales. Su actividad cataltica es doble, ya que cataliza dos tipos de
reacciones que se pueden considerar consecutivas:

a) Actividad monofenolasa o cresolasa: consiste en la hidroxilacin de fenoles
sustituidos (generalmente en posicin para) a o-difenoles.

b) Actividad difenolasa o catecolasa: se trata de la oxidacin de o-difenoles a o-
quinonas.

En animales, el sustrato precursor es la L-tirosina (de ah el nombre de tirosinasa) y los
productos de reaccin son la L-dopa (o-difenol correspondiente a la tirosina) y la
dopaquinona. Esta ltima en muy reactiva y rpidamente evoluciona a dopacromo. El
dopacromo evoluciona lentamente hasta melanina, pasando por intermedios 5,6-
dihidroxiindol (carboxilado o no) y 5,6-indolquinona.

En animales, la fuente principal de tirosinasa es la piel, y ms concretamente unas
clulas especializadas de sta, los melanocitos, responsables de la sntesis de melanina.
Las diferencias de color entre las diferentes razas, y entre el color de piel y pelo dentro
de un mismo grupo tnico, se deben, entre otros factores, a diferencias en la cantidad y
tipo de pigmentos melnicos presentes en cada individuo. La alteracin de la actividad
tirosinasa puede dar lugar a modificaciones de la pigmentacin como el albinismo. Por
otra parte, la malignizacin de melanocitos produce un tipo de cncer de piel conocido
como melanoma.

La enzima tirosinasa en una metalo-protena (metalo-enzima) que contiene dos tomos
de cobre en el centro activo. Por tanto resulta inhibida por muchos agentes quelantes,
con afinidad por los iones metlicos.

El dopacromo, formado tras la oxidacin del dopa, es un compuesto coloreado que hace
posible la medida de la actividad tirosinasa por mtodos colorimtricos. Aunque el pico
de absorcin en el ultravioleta es ms intenso, el pico ancho en la regin visible,
centrado alrededor de 420 nm y responsable de la coloracin del compuesto, permite
una medida colorimtrica ms cmoda al tener menores requerimientos tcnicos, y es el
que se utiliza normalmente para determinar la actividad enzimtica de tirosinasa: puesto
que la enzima transforma el dopa incoloro en dopacromo con absorcin a 420 nm, la
actividad enzimtica es directamente proporcional al incremento de absorbancia por
minuto a esa longitud de onda.







CINETICA ENZIMATICA

La velocidad de transformacin de los sustratos de una reaccin en los correspondientes
productos en una reaccin enzimtica que transcurra en condiciones de estado
estacionario es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los
sustratos. Normalmente, esa dependencia puede expresarse matemticamente por la
ecuacin de Michaelis-Menten:

v = Vmax [S] / (Km + [S])

Esta ecuacin predice que la velocidad de formacin de producto es saturable con
respecto al sustrato, es decir existe una concentracin de sustrato a partir de la cual la
velocidad (v) no aumenta de forma significativa.

La Km es un parmetro que depende de la afinidad de la enzima por el sustrato y que se
denomina constante de Michaelis.

La Vmax se denomina velocidad mxima, y depende de la concentracin de enzima
segn una relacin lineal:

Vmax = k2 [E]


El clculo de los valores de Vmax y Km se realiza mediante la representacin de
Lineweaver-Burk, que es en realidad la ecuacin de Michaelis-Menten en forma
inversa:




1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax) [S]


La representacin de 1/v frente a 1/ [S] da lugar a una lnea recta cuya ordenada en el
origen es 1/Vmax y cuya abscisa es -1/Km.

La velocidad de reaccin vara tambin con la presencia en el medio de determinados
agentes qumicos que reciben el nombre de efectores. Existen varios tipos, y uno de los
ms frecuentes son los denominados inhibidores competitivos. Generalmente, stos
son sustancias de naturaleza anloga al sustrato, que pueden competir con l por el
centro activo de la enzima. As, disminuyen la velocidad de transformacin del
verdadero sustrato, aumentando la constante de Michaelis. En su presencia, se puede
obtener lo que se denomina constante de Michaelis aparente. La cintica de inhibicin
competitiva responde a la siguiente ecuacin:

v= Vmax.[S] / (Km ap +[S]),

Donde la constante aparente (Km ap) vale:

(Km)ap = Km/ (1+ [I] / Ki)

Siendo [I] la concentracin de inhibidor y Ki la denominada constante de inhibicin,
caracterstica de cada enzima y cada inhibidor.




RESUMEN DE LAS PRCTICAS


ACTIVIDAD ENZIMATICA

Se inicia con la extraccin de la enzima a partir de una papa:

Pesamos entre 10 a 15 gramos de papa; luego de pesados, se depositan en el mortero
pre-enfriado y se le agregan 30 ml de solucin buffer a pH 7.2.

Luego agregamos arena de mar y trituramos con ayuda del pistilo; luego filtramos y
centrifugamos a 3500 por 10 min. Se decant y se coloc en un bao de hielo.

Para la actividad enzimtica se agreg 1mL de solucin enzimtica (extracto de papa)
en un tubo de ensayo donde le adicionamos 3 mL de solucin buffer a pH 6.0.

A esta solucin se le agreg 1 mL de dopa con la cual se le dio inicio a la reaccin.

Se prepar tambin un blanco con 1mL de solucin enzimtica ms 3 mL de solucin
buffer y 1 mL de H2O.

La lectura se hizo por 10 min; tomando una lectura cada 1 min. Transcurrido.







INHIBICIN ENZIMATICA

En un tubo de ensayo agregamos 1 mL de solucin enzimtica y 3 mL de solucin
buffer a pH 6.0 se puso en un bao mara por 10 min. a 70 C.
Se dej enfriar la muestra, y se adicionaron 1 mL de dopa; posteriormente se ley la
absorbancia por 10 min. Tomando datos cada 1 min transcurrido.

Se prepar un Blanco con 1 mL de solucin enzimtica y 3 mL de solucin buffer de
pH: 6.0 luego se puso en un bao mara por un lapso de 10 min. a 70C, se dej enfriar
y luego se le adicionaron 1 mL de H2O.


CINETICA ENZIMATICA

Se tomaron 5 tubos de ensayo, uno de estos tubos se utiliz para preparar un blanco con
1.5 mL de solucin enzimtica y 2.5 mL de solucin buffer de pH: 6.0.

Al resto de tubos se le adicionaron 1.5 mL de solucin enzimtica, luego se agrego
solucin buffer pH: 6.0 a diferentes volmenes:


Solucin
Blanco
(mL)
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
4
Extracto Enzimtico 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Buffer pH 6.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Dopa 0.03 M (Antes de leer %
Tramitancia)
0 0.5 1.0 1.5 2.0
Volumen total 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0


Al tubo 1 se le agregaron 2.0 mL
Al tubo 2 se le agregaron 1.5 mL
Al tubo 3 se le agregaron 1.0 mL
Al tubo 4 se le agregaron 0.5 mL

Posteriormente se adicion Dopa en cada tubo tal como muestra la tabla.

Finalmente leemos Absorbancia cada 1 min. Por 10 min. A 420nm



DATOS Y RESULTADOS


Actividad enzimtica

Se mide tomando la diferencia entre la lectura final e inicial dividida por el intervalo de
tiempo (En nuestro caso experimental se tomaron estos puntos con referencia en la
pendiente positiva del grafico; puntos 7 y 6 del grafico) Esta actividad tambin puede
ser determinada de la pendiente del grfico. Absorbancia vs tiempo.
Actividad Tirosinasa Inhibicin
tiempo (min) Absorbancia a 420nm Absorbancia a 420nm
0 0,387 0,06
1 0,435 0,058
2 0,427 0,06
3 0,42 0,061
4 0,418 0,061
5 0,407 0,062
6 0,4 0,058
7 0,495 0,061
8 0,467 0,062
9 0,415 0,062
10 0,406 0,063
Actividad (Ab/min) 0,095 0,031578947








m (pendiente) = Y2 Y1 = 0,495 - 0,4 = 0.095 Abs/min Para la actividad
X2 X1 7 - 6










(Pendiente) m = Y2 Y1 = 0,061 - 0,058 = 0,0315 Abs/min Para la Inhibicin
X2 X1 7 - 6


Si comparamos estos resultados, teniendo en cuenta que se tomaron los mismos puntos
correspondientes de ambas graficas, podemos ver que la pendiente disminuy casi una
tercera parte respecto a la curva no inhibida. Era de esperarse este resultado pues la
actividad cataltica de la reaccin disminuye si se inhibe la reaccin en este caso con
aumento en la temperatura.


Cintica

cintica tirosinasa
tiempo (min)
tubo 1 tubo 2 tubo 3 tubo 4
Absorb a 420nm Absorb a 420nm Absorb a 420nm Absorb a 420nm
0 0,475 0,556 0,624 0,67
1 0,476 0,563 0,617 0,665
2 0,491 0,553 0,605 0,65
3 0,503 0,546 0,588 0,637
4 0,619 0,53 0,573 0,622
5 0,553 0,523 0,557 0,606
6 0,533 0,503 0,541 0,591
7 0,511 0,489 0,525 0,573
8 0,505 0,478 0,512 0,562
9 0,502 0,466 0,501 0,548
10 0,394 0,426 0,627 0,626
Igualmente como en la actividad, se mide la pendiente de la curva de progreso tomando
la diferencia entre la lectura final e inicial dividida por el intervalo de tiempo (En
nuestro caso experimental se tomaron los puntos con referencia en la pendiente positiva
de cada uno de los grficos; estos puntos estn sealados en la tabla)


Se obtuvieron las siguientes curvas de progreso:
















Con respecto a estas curvas de progreso y la pendiente hallada de cada una de ellas, se
obtienen los siguientes datos experimentales:


Michaels-Menden

Vo (Ab/min) [S]M
Tubo 1 0,116 0,00375
tubo 2 0,007 0,0075
tubo 3 0,126 0,01125
tubo 4 0,078 0,015

Donde Vo corresponde a cada pendiente del grafico, solo de aquellos puntos que
mostraron una pendiente positiva.

[S] = Dopa 0.03 M inicial:

Para el tubo 1: [S] = 0.03M*0.5ml/4ml totales = 0,00375 M
Para el tubo 2: [S] = 0.03M*1.0ml/4ml totales = 0,0075 M
Para el tubo 3: [S] = 0.03M*1.5ml/4ml totales = 0,01125 M
Para el tubo 4: [S] = 0.03M*2.0ml/4ml totales = 0,015 M


Finalmente con los datos anteriores, se realiza la respectiva linealizacin mediante el
inverso, obteniendo los siguientes datos:



Lineweaver-Bork
tubo 1/Vo (min/Ab) 1/[S]M
-1

1 8,62068966 266,666667
2 142,857143 133,333333
3 7,93650794 88,8888889
4 12,8205128 66,6666667









DISCUSIN DE RESULTADOS

Al analizar la grafica obtenida despus de la linealizacin de la ecuacin de Michaelis-
Menten, (grafica de Lineweaver-Burke), no se evidencia lo esperado, en principio
queramos obtener una grfica que se aproximara a un modelo de ecuacin de la lnea
recta (para ello se linealiza) con el fin de obtener la Vmax y la Km; en nuestro caso no
obtuvimos dicho modelo; esto podra deberse a errores sistemticos, donde se incluyen
errores experimentales, de procedimiento o calidad de reactivos los cuales serian
necesarios precisar.

Otro posible factor de error que ha nuestro criterio podra ser el ms acertado radica que
desde la realizacin de las curvas de progreso se garantizaba la no linealidad; esto se
puede evidenciar al observar las graficas, la cual es discontinua en el tubo 1 y en otros
casos como las del tubo 2, 3 y 4 donde tienen pendientes negativas. Podramos asegurar
que la posible causa de esta discontinuidad en las curvas de progreso que deberan
seguir el siguiente patrn:

Curva de progreso de una reaccin enzimtica



Radica necesariamente en que los valores obtenidos debieron corresponder a la zona
encerrada en el circulo en la curva de progreso donde apenas se inicia la reaccin;
puesto que los datos ni siquiera precisan un momento en el cual se alcanza un estado de
equilibrio donde se alcance la mxima concentracin de producto; es decir un valor casi
fijo de este. Para asegurar esta apreciacin se debera iniciar el proceso y tomar lecturas
hasta un tiempo superior a los 10 min hasta que los valores obtenidos ya no sufran
cambios significativos de tal forma que se pueda obtener una curva de progreso total y
de esta manera poder determinar con una tangente a ella los parmetros de Vo
requeridos (como sugerencia a la prctica; aumentar el intervalo de tiempo en las
lecturas o revisar concentraciones de reactivos)


MARCO TEORICO


ACTIVIDAD E INHIBICION ENZIMATICA FOSFATASA ALCALINA


Las fosfatasas alcalinas son un grupo de enzimas que se clasifican dentro de las
hidrolasas, estas catalizan la liberacin de fosfatos de algunos steres mono fosfricos, a
un pH elevado, del orden de 10:



O2N OPO3H2 + H2O O2N OH + H3PO4

p-nitrofenilfosfato Fosfatasa Alcalina p-nitrofenol


Existen diferentes fosfatasas alcalinas en los diferentes tejidos (hueso, rin, hgado,
placenta, tejido tumoral). La actividad fosfatasa alcalina presente en suero puede ser,
por tanto, una mezcla de enzimas de los tejidos. Los niveles de fosfatasa alcalina en
suero se ven elevados en enfermedades seas y hepticas. Su actividad se da en
presencia de iones de Zn
2+
.

La fosfatasa alcalina es un ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida por un
mtodo colorimtrico. Este se basa en la transformacin de un sustrato, el p-
nitrofenilfosfato (p-NPP), en p-nitrofenol (p-NP), producto de color amarillo que en
solucin alcalina absorbe a 410 nm.


INHIBICIN ENZIMATICA

La actividad enzimtica puede ser disminuida o bloqueada por la accin de ciertas
molculas o inclusive tomos a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores
enzimticos. Mediante el uso de los inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin
muy valiosa sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas.

Las distintas formas de interaccin se traducen en varios tipos de inhibicin
perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos ms comunes de
inhibicin son la competitiva y la no competitiva. La primera es cuando el inhibidor
compite con el substrato por la unin con el centro activo de la enzima. Este tipo de
inhibicin puede reducirse si se aumenta la concentracin de substrato. En el segunda
tipo de inhibicin, el inhibidor interacta con la enzima ya sea cerca del centro activo o
distante modificando el centro activo pero sin modificarla irreversiblemente.

Se conocen sustancias que inhiben a las enzimas, son los metales como el plomo,
mercurio y arsnico que inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos que
presentan grupos -SH libres.

Los inhibidores enzimticos han sido muy tiles en las estrategias desarrolladas para
comprender los mecanismos de accin txica y farmacolgica de algunos compuestos.





RESUMEN DE LAS PRCTICAS


CINETICA ENZIMTICA

2mL 2mL 2mL 2 mL

Tubos 1 2 3 4 5 Blanco
0.5 mL PNPP 0.750 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 0
Buffer Glicina 5.250 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Vol total* Descarto 2 mL 2mL 2 mL 2 mL Descarto 2 mL 2 mL
Sln de ZnCl2 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Llevo a 37 C en Bao Mara
A los 5 min. 6 min. 7 min. 8 min. 9 min. 10 min.
Sln enzimtica 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
A los 5 min. (15) 6 min.(16) 7 min.(17) 8 min.(18) 9 min.(19) 10 min.(20)
Na2HPO4 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Leo absorbancia a 410 nm


Nota: el volumen total* es 2 mL debido a que de cada tubo paso 2 mL de solucin
despus de agregar la solucin buffer de glicina y mezclar con el vortex.

La solucin enzimtica es suero fetal bovino.










INHIBICIN ENZIMTICA

2mL 2mL 2mL 2 mL

Tubos 1 2 3 4 5 Blanco
0.5 mL PNPP 0.900 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 0
Buffer Glicina 5.100 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Vol Descarto 2 mL 2mL 2 mL 2 mL Descarto 2 mL 2 mL
Sln de ZnCl2 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Inhibidor 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Vol. total 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL
Llevo a 37 C en Bao Mara
A los 5 min. 6 min. 7 min. 8 min. 9 min. 10 min.
Sln enzimtica 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
A los 5 min. (15) 6 min.(16) 7 min.(17) 8 min.(18) 9 min.(19) 10 min.(20)
Na2HPO4
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Leo absorbancia a 410 nm


El inhibidor utilizado es el K2HPO4
La solucin enzimtica es suero fetal bovino


DATOS Y RESULTADOS

Curva de calibracin para el p-nitrofenol

Tubo [PNP] M
absorbancia a 410nm
grupo 1 grupo 2 grupo 3 grupo 4 grupo 5
1 8,5714E-05 1,201 1,334 1,26 1,322 1,515
2 3,6735E-05 0,563 0,65 0,653 0,658 0,643
3 1,5743E-05 0,25 0,315 0,33 0,333 0,306
4 6,7472E-06 0,099 0,163 0,164 0,172 0,161
5 2,8917E-06 0,057 0,087 0,093 0,098 0,088


Donde inicial [PNP] = 10
-4
M


Para el tubo 1: [S] = 0,0001 * 6.0ml/7.0ml totales = 8,5714E-05 M
Para el tubo 2: [S] = 8,5714E-05M * 3.0ml/7.0ml totales = 3,6735E-05 M
Para el tubo 3: [S] = 3,6735E-05M * 3.0ml/7.0ml totales = 1,5743E-05 M
Para el tubo 4: [S] = 1,5743E-05M * 3.0ml/7.0ml totales = 6,7472E-06 M
Para el tubo 5: [S] = 6,7472E-06M * 3.0ml/7.0ml totales = 2,8917E-06 M

Tomando los datos obtenidos por el grupo 5, pues de todos es el grafico con mejor valor
de correlacin lineal (R
2
= 0.999) se tiene el siguiente grafico del cual mediante su

ecuacin de la lnea recta podremos posteriormente mediante un valor de absorbancia,
obtener la concentracin del p-Nitrofenol.





Usando la ecuacin y = 17164x + 0.035 reemplazamos en Y las absorbancias obtenidas
y despejamos X como la concentracin de [PNP] obteniendo los siguientes resultados:


0.654 0.035 = X = 3,60639E-05
17164

De la misma forma se calculan las dems concentraciones.


cintica fosfatasa alcalina
tubo Ab. 420 nm [S] M [PNP] M Vo = [PNP]/T T = tiempo (min)
1 0,654 0,0005 3,60639E-05 2,40426E-06 15
2 0,415 0,00025 2,21394E-05 1,38371E-06 16
3 0,228 0,000125 1,12445E-05 6,61439E-07 17
4 0,103 0,0000625 3,96178E-06 2,20099E-07 18
5 0,048 0,00003125 7,57399E-07 3,98631E-08 19

Donde inicial [PNPP] = [S] = 5 x10
-3
M


Para el tubo 1: [S] = 5 x10
-3
M * 0.750ml/6.0ml totales = 6,25E-04 M (antes del zinc)
[S]final = 6,25E-04 M * 2.0ml/2.5ml = 0,0005 M (despus del zinc)

Para el tubo 2: [S] = 6,25E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 3,125E-04 M
[S]final = 3,125E-04 M * 2.0ml/2.5ml = 0,00025 M (despus del zinc)
Para el tubo 3: [S] = 3,125E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 1,56E-04 M
[S]final = 1,56E-04M * 2.0ml/2.5ml = 0,000125 M (despus del zinc)

Para el tubo 4: [S] = 1,56E-04M * 2.0ml/4.0ml totales = 7,81E-05 M
[S]final = 7,81E-05 M * 2.0ml/2.5ml = 0,0000625 M (despus del zinc)

Para el tubo 5: [S] = 7,81E-05 M * 2.0ml/4.0ml totales = 3,917E-05 M
[S]final = 3,917E-05 M * 2.0ml/2.5ml = 0,00003125 M (despus del zinc)


Posteriormente realizamos la respectiva linealizacin y tenemos:


Lineweaver-Burke
tubo 1/Vo (Ab/min) 1/[S]M
1 415928,9176 2000
2 722694,7368 4000
3 1511854,922 8000
4 4543411,765 16000
5 25085846,15 32000

Eliminando el dato del tubo numero 5 tenemos un mejor coeficiente de correlacin
lineal = 0.945 segn el grafico; puesto que tomando todos los datos este coeficiente es
de 0.841.

Obtenemos la siguiente grafica:

Donde la ecuacin de la lnea recta es y = 269,96x - 104737,95 que representa el
modelo

1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax) [S]

Teniendo en cuenta este modelo, la pendiente de la grafica seria (Km/Vmax) = 269,96
Y el intercepto 1/Vmax = - 104737,95 procesando estos valores se obtiene finalmente que

La Vmax = 9.55 E-06
Km = 2.577E-03



Inhibicin

De la misma manera, usando la ecuacin y = 17164x + 0.035 (curva de calibracin)
reemplazamos en Y las absorbancias obtenidas y despejamos X como la concentracin
de [PNP] obteniendo los siguientes resultados:


0.257 0.035 = X = 1,2934E-05M
17164

De la misma forma se calculan las dems concentraciones.

En este caso al interpolar los valores de absorbancia con relacin a la curva de
calibracin antes obtenida, se arrojan valores negativos en la concentracin de los
tubos 4 y 5.


Inhibicin fosfatasa alcalina
tubo Ab. 420 nm [S] M [PNP] M Vo = [PNP]/T T = tiempo (min)
1 0,257 5,88E-04 1,2934E-05 8,6227E-07 15
2 0,139 2,94E-04 6,05919E-06 3,787E-07 16
3 0,083 1,47E-04 2,79655E-06 1,64503E-07 17
4 0,029 7,40E-05 -3,49569E-07 -1,942E-08 18
5 0,017 3,68E-05 -1,04871E-06 -5,5195E-08 19


Donde inicial [PNPP] = [S] = 5 x10
-3
M


Para el tubo 1:
[S] = 5 x10
-3
M * 0.9ml/6.0ml totales = 8.82E-04 M (antes del zinc)
[S]final = 8.82E-04 M * 2.0ml/3.0ml = 5.88E-04 (despus del zinc + inhibidor)

Para el tubo 2:
[S] = 8.82E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 4,41E-04 M
[S]final = 4,41E-04 M * 2.0ml/3.0ml = 2.94E-04 M (despus del zinc + inhibidor)
Para el tubo 3:
[S] = 4,41E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 2,21E-04 M
[S]final = 2,21E-04 M * 2.0ml/3.0ml = 1.47E-04 M (despus del zinc + inhibidor)

Para el tubo 4:
[S] = 2,21E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 1.11E-04 M
[S]final = 1.11E-04 M * 2.0ml/3.0ml = 7.4E-05 M (despus del zinc + inhibidor)

Para el tubo 5:
[S] = 1.11E-04 M * 2.0ml/4.0ml totales = 5.51E-05 M
[S]final = 5.51E-05 M * 2.0ml/3.0ml = 3.675E-05 M (despus del zinc + inhibidor)

Suprimiendo los datos de los tubos 4 y 5 de concentraciones negativas realizamos la
respectiva linealizacin y tenemos:


Lineweaver-Burke
tubo 1/Vo (Ab/min) 1/[S]M
1 1159729,73 1700,68
2 2640615,385 3401,36
3 6078916,667 6802,72







Donde la ecuacin de la lnea recta es y = 970,8x - 55942 que representa el modelo
1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax) [S]

Teniendo en cuenta este modelo, la pendiente de la grafica seria (Km/Vmax) = 970,8
Y el intercepto 1/Vmax = - 55942 procesando estos valores se obtiene finalmente que

La Vmax = 1.79 E-05
Km = 1.7E-02




ANLISIS DE RESULTADOS


Al comparar la Vmax y la Km obtenidas con y sin inhibidor podemos apreciar que ambas
sufrieron cambios; ambos parmetros cinticos aumentaron con la adicion del inhibidor.



V
max
K
m

Sin inhibidor 9.55 E-06 2.577E-03
Con inhibidor 1.79 E-05 1.7E-02


Basados en estos hechos no podramos definir con exactitud que tipo de inhibicin se
llevo a cabo; pues ambos factores cinticos aumentaron. Era de esperarse debido al poco
nmero de datos en la linealizacin de la curva (solo 3) debido a la obtencin de
concentraciones negativas del producto respecto a la curva de calibracin.


Es de notar que el cambio ms significativo pudo ser el de la Km y teniendo en cuenta
esta observacion entonces el inhibidor es de caracter competitivo donde el inhibidor
compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima de tal forma que aumenta su Km


La verdad no estamos muy conformes con esta conclusin del tipo de inhibicin por que
a nuestro criterio para poder hacer estas afirmaciones y observar cambios precisos en la
cintica enzimtica, ambos procedimientos (con y sin inhibicin) debieron realizarse
bajo los mismos parmetros experimentales; es decir iguales cantidades de sustratos
(vari en cada experimento 0.750ml [PNPP] y 0.9ml) igual temperatura para llevar a
cabo la reaccin enzimtica y dems; no se garantiza la igualdad de condiciones
experimentales al realizarse en das diferentes inclusive respecto a la curva de
calibracin.


La obtencin de concentraciones negativas del producto respecto a la curva de
calibracin obtenida, puede tener sentido si nos percatamos que en el experimento con
el inhibidor las lecturas de absorbancia fueron muy cercanas a cero en los tubos donde
ms tiempo acto el inhibidor (tubos 4 y 5); es decir una absorbancia muy baja implica
bajas concentraciones del producto (ley de Beer), si asumimos que de verdad el
inhibidor es de carcter competitivo, tiene sentido apreciar que en efecto debido a la
presencia del inhibidor y su competencia con el sustrato por el sitio activo, se favoreci
la poca produccin de producto evidenciado en la baja absorbancia del mismo en el
espectrofotmetro.

PREGUNTAS

1. Porque en la tirosina, para la extraccin de la enzima se necesita un pH 7.2 y para
la actividad un pH 6?

R/: El pH 7.2 se utiliza para que la enzima este estable despus de ser extrada,
adems previene que la enzima no se desnaturalice. El pH 6.0 es para que los puntos de
activacin de la enzima se activen y pueda ser funcin; ya que en este pH la enzima se
hace biolgicamente activa.

2. Qu significa cada uno de los parmetros en una regresin lineal?

R/: El coeficiente de correlacin (r
2
) nos indica la intensidad o grado de dependencia
entre las variables X e Y.

Cuando r=1, la correlacin lineal es perfecta, directa.
Cuando r=-1, la correlacin lineal es perfecta, inversa
Cuando r=0, no existe correlacin alguna, independencia total de los valores X e Y

Los coeficientes a y b son parmetros que definen la posicin e inclinacin de la recta.

El parmetro a, conocido como la ordenada en el origen, nos indica cunto es Y
cuando X = 0.
El parmetro b, conocido como la pendiente, nos indica cunto aumenta Y por cada
aumento de una unidad en X.


CONCLUSIONES


La importancia en el estudio de la cintica enzimtica es que permite explicar cmo
funciona una enzima, y permite predecir cmo se comportar esa enzima in vivo. Las
constantes cinticas Km y Vmax, son fundamentales a la hora de intentar comprender el
funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo.

Las enzimas son sensibles a la temperatura por lo cual puede verse modificada su
actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar
sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la
temperatura, una enzima ver incrementada su actividad hasta el momento en que
comience la desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva
de dicha actividad.

El rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del
medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al
aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto
la actividad enzimtica.

Una inhibicin competitiva (competencia del inhibidor y el sustrato por el sitio activo
de la enzima) afecta notoriamente la Km generalmente aumentado su valor con la
presencia del inhibidor.

Una inhibicin No competitiva (donde el inhibidor se une a los sitios alostericos de la
enzima y no compite por los sitios activos con el sustrato) reduce la concentracin de
enzima "activa" resultando en una disminucin de la Vmax.





BIBLIOGRAFA

http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica

http://www.um.es/bbmbi/Areas/Biomedicina/Practicas/PracticasAvanzadas/Prac
_avanz__cinetica
http://www.scribd.com/doc/6695541/Informe-Cinetica-Enzimatica
http://www2.uah.es/sancho/farmacia/practicas/guiones/1er%20cuatrimestre/Gui
ones/Fosfatasa.pdf




























UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUIMICA FARMACEUTICA








LABORATORIO BIOQUIMICA
(M 16-19)






Practica N 2-3
Actividad e inhibicin enzimtica
TIROSINASA FOSFATASA ALCALINA








SANTIAGO DEL VALLE T.
CAMILO QUINTERO

















MEDELLIN 26 OCTUBRE 2010