2014 TECNICAS DE SIEMBRA, ESTUDIO DEL DESARROLLO BACTERIANO EN MEDIOS LIQUIDOS, SEMISOLIDOS Y SOLIDOS
Para cada bacteria a ser cultivada para cualquier propsito es necesario proveer el ambiente bioqumico y biofsico apropiado. El ambiente bioqumico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propsitos y utilizaciones. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y tambin son utilizados para la identificacin de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas. El modo en que las bacterias son cultivadas, y el propsito de los medios de cultivo, varan ampliamente. Los medios lquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios slidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimacin de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propsitos. El agar, agente glido ms utilizado para medios slidos o semislidos, es un hidrocoloide derivado de las algas rojas. El agar es utilizado por sus propiedades fsicas nicas (se funde a 100 grados y permanece lquido hasta enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel) y porque no puede ser metabolizado por la mayora de las bacterias. Por lo tanto, como un componente del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes que se encuentran en la solucin acuosa. Los medios de cultivo pueden ser clasificados en varias categoras dependiendo de su composicin o uso. Un medio qumicamente definido (sinttico) (Tabla 4 y 4b) es un medio en el que se conoce la exacta composicin qumica. Un medio complejo (indefinido) (Tabla 5 y 5b) es un medio en el que no se conoce la composicin qumica exacta. Los medios definidos estn habitualmente compuestos por bioqumicos puros sacados del stock; los medios complejos habitualmente contienen materiales complejos de origen biolgico tales como la sangre, la leche, el extracto de levadura o el extracto de carne, cuya composicin qumica exacta es obviamente indeterminada. Un medio definido es un medio mnimo (Tabla 4) si provee slo los nutrientes exactos (incluyendo algunos factores de crecimiento) necesarios para el crecimiento del organismo. La utilizacin de medios mnimos definidos requiere que el investigador conozca los requerimientos nutricionales exactos de los organismos en cuestin. Los medios definidos qumicamente son de MICROBIOLOGIA
FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
2014 valor para el estudio de los requerimientos nutricionales mnimos de los microorganismos, para cultivos enriquecidos, y para una amplia variedad de estudios fisiolgicos. Los medios complejos habitualmente proveen la gama completa de factores de crecimiento que pueden ser requeridos por un organismo por lo que pueden ser utilizados ms prcticamente para cultivar bacterias desconocidas o bacterias cuyos requerimientos nutricionales son complejos (por ejemplo, organismos que requieren muchos factores de crecimiento). Otros conceptos empleados en la construccin de medios de cultivo son los principios de seleccin y enriquecimiento. Un medio selectivo es aquel que tiene agregados componentes que inhibirn o prevendrn el crecimiento de ciertos tipos o especies de bacterias y/o promovern el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede tambin ajustar las condiciones fsicas del medio de cultivo, como el pH y temperatura, para hacerlo selectivo para organismos capaces de crecer bajo esas condiciones. Un medio de cultivo puede tambin ser un medio diferencial si permite al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias basado en algn rasgo observable de su pauta de crecimiento en el medio. As, un medio selectivo, diferencial para el aislamiento de Staphylococcus aureus, el patgeno bacteriano ms comn en los humanos, contiene una concentracin muy alta de sal (que el estafilococo tolerar) que inhibe a la mayora de las otras bacterias, mannitol como fuente de azcar fermentativo, y un tinte de indicador de pH. De los especimenes clnicos, slo el estafilococo crecer. S. aureus es diferenciado de S. epidermidis (un componente no patgeno de la flora normal) por su capacidad de fermentar el mannitol. Las colonias fermentadoras de mannitol (S. aureus) producen cidos que reaccionan con el tinte indicador formando un halo coloreado alrededor de las colonias; las no fermentadoras del mannitol (S. epidermidis) utilizan otros sustratos no fermentadores en el medio para el crecimiento y no forman un halo alrededor de sus colonias. Competencias:
- Realizar diversas tcnicas de siembra para su cultivo y aislamiento. - Aplica las tcnicas de aislamiento hasta la obtencin de cultivos puros.
MICROBIOLOGIA
FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
2014 MATERIALES: 1.- Tecnicas de siembra en medios liquidos, semislidos y solidos: - Placas Petri con agar TSA. - Tubos agar SIMy TSA en agar inclinado - Tubos con caldo TSB - Cultivo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis y Psudomonas aeruginosa. 2.- Desarrollo bacteriano: - Utilizar los medios de cultivo preparados en la prctica anterior y proceder a realizar los sembrados en los distintos medios segn tcnicas. PROCEDIMIENTO: 1. Tcnicas de Siembra en medios lquidos, semislidos y solidos:
- Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inoculo del cultivo de bacterias y sembrar en agar manitol salado y MB, por el mtodo de estra.
MICROBIOLOGIA
FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
2014
Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada de cultivo, y sembrar por el mtodo de inoculacin en el tubo con TSI.
1. Forrar de manera adecuada las placas Petri con el medio de cultivo respectivo. 2. Controla la esterilidad del medio, por incubacin del mismo a 37 C por 24 horas.
RESULTADOS Al da siguiente se realiz la lectura de los cultivos comprobando que se realiz una siembra correcta libre de microorganismos extraos que pudieran contaminar nuestra muestra, se pudo observar la siembra de Stapylococcus ( Gram + ) en MB, Steptococcus sp ( Gram + ) en agar manitol salado , y Eschiericha coli (Gram -), evitndose as la contaminacin y prdida del cultivo en estudio, la salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de utensilios, productos y del personal.
MICROBIOLOGIA
FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
2014 CUESTIONARIO 1 .- Con que propsito se emplean cada una de las diferentes tcnicas de siembra? El mtodo de siembra a emplear depender de los objetivos que se pretendan alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxgeno, los mtodos de siembra ms empleados son los siguientes:Siembra por estras, Siembra por puncin, Siembra volumtrica, Siembra masiva. Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrn, deben ser calentados en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y despus de realizar la siembra, con el objetivo de destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento. Con independencia del tipo de medio y el mtodo de siembra a emplear sta debe realizarse en las proximidades de la llama del mechero y a que el calor emanado reduce el nmero de microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor del proceder asptico. 2.- Describe las caractersticas de crecimientos de cada uno de los cultivos bacterianos proporcionados en la prctica. Los medios lquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios slidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimacin de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propsitos. El agar, agente glido ms utilizado para medios slidos o semislidos, es un hidrocoloide derivado de las algas rojas. El agar es utilizado por sus propiedades fsicas nicas (se funde a 100 grados y permanece lquido hasta enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel) y porque no puede ser metabolizado por la mayora de las bacterias. Por lo tanto, como un componente del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes que se encuentran en la solucin acuosa.
MICROBIOLOGIA
FACULTAD FARMACIA Y BIOQUIMICA
2014
3.- Describe el mtodo de siembra por incorporacin y seala en que casos se emplea: Este mtodo consiste en sembrar cajas de Petri con 1ml de muestra (y de sus diluciones) y agregar de 10 a 12 mL de agar nutritivo esteril difundido (teniendo la precaucion de dejarlo enfriar hasta 44-46 grados). Se mezcla rapidamentey, una vez solidificado el agar, se incuban las placas durante 7 dias a 20 grados.
BIBLIOGRAFIA - Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, Mexico 2001. 2 ed Pp 257-429 - Prescott L. Harley J. Klein D 2000 Madrid.