MICROBIOLOGIA

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2014
METODOS DE COLORACION
Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas
tcnicas de tincin. Los mordientes intensifican la tincin porque aumentan la
afinidad de la clula por el colorante. Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que
debido a su delgadez no podran ser visualizados de otra forma.

Existen tres tipos de tcnicas de tincin: simples, diferenciales y especficas:

Tinciones simples: En las tinciones simples se usa un nico colorante, que
siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste;
todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por
tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el
espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba,
se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada. Si
se utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante.

Tinciones diferenciales: Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir
entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial consta de dos
etapas: una tincin primaria (siguiendo el mismo mtodo que en una tincin
simple) seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza
otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer
colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa. Por ejemplo, la
tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a
bacterias.

La tincin de Gram La tcnica de la tincin de Gram fue desarrollada por el
bacterilogo dans Christian Gram en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias en
dos grupos: Gram positivas y Gram negativas La tcnica incluye tincin primaria,
decoloracin y tincin de contraste:

1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta, que tie de violeta.

2. Se aade el mordiente, yodo.

3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de acetona o etanol.
En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las
Gram positivas retienen el colorante.

4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de rosa las bacterias
Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram
positivas les proporciona un color violeta ms intenso.

Una tincin cido-alcohol resistente se realiza segn los siguientes pasos:

1. Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas de rojo.

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2. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la penetracin del colorante
en el interior de la clula.

3. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las clulas excepto de las micro bacterias, que la
retienen debido a su superficie crea.

4. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul todas las clulas
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciacin entre las clulas
deMycobacterum, an teidas de rojo, v las clulas restantes del espcimen.

Tinciones especficas: Mientras las tnciones diferenciales permiten distinguir
entre distintos tipos de microorganismos, las tinciones especficas incrementan el
contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares, entre las
que se incluyen las en dos poras, los flagelos y las cpsulas.




MATERIALES

- Cultivo de Escherichia coli
- Cultivo de Staphylococcus aureus
- Coloracion Gram:
- Violeta de genciana
- Lugol
- Alcohol
- Fucsina basica



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PROCEDIMIENTO
Coloracin Gram:
1. Prepara frotices de cultivos.
2. Deja secar al aire y fija con calor.



























3. Cubre los frotices con reactivo de cristal violeta durante un minuto.
4. Lava los portaobjetos con agua corriente durante 5 segundos.



















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5. Cubre el frotis con la solucin de Lugol y deja actuar durante 2 minutos.
6. Lava con agua corriente, y aplica lentamente el alcohol acetona y seguir agregando
hasta que la tintura ya no fluya del frotis. Lava inmediatamente con agua corriente.


















7. Cubrir el frotis con la solucin de safranina durante 30 segundos.
8. Lava con agua corriente y deja secar la preparacin.
9. Observa al microscopio utilizando el lente de inmersin.
















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RESULTADOS
















Al realizar la practica de los mtodos de tincin de Gram se observ en el
microscopio las caractersticas y diferencias. Teniendo como resultado del Gram
positivo cocceas en forma de racimos, aproximadamente 1um de dimetro,
inmviles,no forman esporas, la mayoria son anaerobios facultativos, crece bien en
agar sangre a 37c, colonias medianas, blancas, cremosas y brillantes.
En el cultivo de la bacteria Escherichia coli Gram negativo en este caso la
Eschericha coli se vi la bacteria con pared celular que contienen capas de
peptidoglicano (cadenas de aminocidos vinculadas con molculas de azcar) que
sean demasiado finas para mantener el tinte violeta de cristal o azul de metileno
(utilizan indistintamente en la tincin de Gram) se consideran gram-negativa.
Despus de una tincin de Gram, estas bacterias aparecen de color rojo o rosado en
el color de la mancha fucshin (aplicado despus de cristal violeta).
BIBLIOGRAFIA
- Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas
de las enfermedades infecciosas. Editorial Panamericana, Mexico 2001. 2 ed
Pp 257-429
- Prescott L. Harley J. Klein D 2000 Madrid.

Gram-negativos: bacterias que
no se tien de azul oscuro o
violeta por la tincin de Gram:
de ah el nombre de "Gram-
negativas" como E. Coli.
Gram-positivos: bacterias que
se tien de azul oscuro o violeta
por la tincin de Gram: de aqu
el nombre de "Gram-positivas",
como Staphylococcus aureus.
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CUESTIONARIO
1. Qu importancia tiene la pared celular microbiana en la coloracin
de Gram?

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve
gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape
del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las
paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma
una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los
lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas gram positivas) se
disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal
violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la
importancia general de la pared celular.

2.- Cules son las diferencias qumicas importantes que explican el estado
acido- resistente?

cido-alcohol resistencia es la propiedad fsica de algunas bacterias a la resistencia
a la decoloracin de la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la clula por accin
del fenol y el calor.
Las bacterias cido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados segn la tincin
de Gram, la cual es la tcnica ms comn en la microbiologa contempornea, sin
embargo puede ser teido con algunas tinciones concentradas combinadas con
calor. Una vez teida tiene la capacidad de resistir la decoloracin de una
combinacin de alcohol- cido, el cual es el decolorante ms comn en los
protocolos de tincin de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-cido
resistente.
La alta concentracin de cido micolico en la pared celular es la causante, como las
bacterias del gnero Mycobacterium, de la baja absorcin y alta retencin de la
tincin (fucsina). La forma ms comn para poder identificar este tipo de bacterias
es a travs de la tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen, donde la bacteria queda teida
en rojo y se agrega una tincin de contraste de nombre azul de metileno la cual
permite apreciar de mejor forma la bacteria.