UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
ENGENHARIA AGRONMICA







RELATRIO
FITOBACTRIAS TESTE DE COLORAO DE GRAM E TESTE KOH 3%




DISCIPLINA: FITOPATOLOGIA
MINISTRANTE: Prof. JOS EVANDO AGUIAR BESERRA Jr.
BRUNO ARCANJO SILVA







TERESINA, JULHO/2014.
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SUMRIO


INTRODUO --------------------------------------------------------------------------------------------------3

OBJETIVO DA PRTICA ------------------------------------------------------------------------------------5

METODOLOGIA------------------------------------------------------------------------------------------------5

RESULTADOS E DISCUSSO -----------------------------------------------------------------------------7

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS-----------------------------------------------------------------------8

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Introduo
A colorao de Gram, um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico
dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar
bactrias com diferentes estruturas de parede celular a partir das coloraes que estas adquirem aps
tratamento com agentes qumicos especficos. O mtodo consiste em tratar sucessivamente
um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes, cristal violeta, lugol, etanol e fucsina.
As bactrias que adquirem a colorao azul violeta so chamadas de Gram-positivas e aquelas que
adquirem a colorao vermelho so chamadas de Gram-negativas.
O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias
Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol
enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem.
A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados em
laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a
caracterizao de amostras de bactrias. Na fitopatologia esse teste tambm tem sua importncia,
uma vez que, no sabendo qual bactria esta causando tal doena, atravs dele podemos identificar
se a bactria Gram-positiva ou Gram-negativa, assim restringindo o numero de bactrias que
possam ser as possveis causadoras dessa doena.
O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em
meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um
fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira
idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um
complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um
solvente orgnico, o etanol. O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das
bactrias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, descorando as clulas. Por
outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Gram-positivas e
provoca a contrao dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o
corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a
exposio prolongada ao solvente provoca a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias,
podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente
das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura,
densidade, porosidade e integridade.
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Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao
microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as Gram-negativas
em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas, clulas velhas, mortas ou com
envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma
mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como Gram-negativas.
Portanto, o uso de material fresco importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-
positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol for omitido.
Gram-positivas: so bactrias que possuem parede celular com uma nica e espessa camada de
peptidoglicanos. Pelo emprego da colorao de Gram, tingem-se na cor prpura ou azul quando
fixadas com cristal violeta, porque retm esse corante mesmo sendo expostas a lcool.
Gram-negativas: bactrias que possuem uma parede celular mais delgada e uma segunda
membrana lipdica - distinta quimicamente da membrana plasmtica - no exterior desta parede
celular. No processo de colorao o lipdio dessa membrana mais externa dissolvido pelo
lcool e libera o primeiro corante (cristal violeta). Ao trmino da colorao, essas clulas so
visualizadas com a tonalidade rosa avermelhada do segundo corante (fucsina) que lhes confere
apenas a colorao vermelha.
A tcnica da colorao de Gram no infalvel e pode-se fazer o teste do hidrxido de
potssio (KOH). Em uma lmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma soluo de KOH
a 3%. Com o auxlio de uma ala de semeadura coleta-se uma colnia isolada da bactria a ser
testada e mistura-se com a soluo de KOH na lmina por 30 segundos. Durante a mistura deve-se
erguer a ala de semeadura cerca de 1 a 2 cm da superfcie da lmina observando-se se h fios de
material viscoso pendentes. Se a bactria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH ir romper
sua parede celular e liberar seu DNA que ser observado como fios viscosos. Se a bactria for
Gram-positiva no haver a formao de fios.
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Objetivo
Desenvolver habilidades para executar as tcnicas de preparao de esfregaos e para o
mtodo de colorao de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactrias de acordo com a
colorao obtida e relacionando-as composio qumica da parede celular das mesmas, atravs do
mtodo de colorao de Gram, bem como tambm saber diferencia as bactrias Gram positivas e
Gram negativas atravs do teste de lise por KOH.

Metodologia
Colorao de Gram
Utilizando-se da rea estril em volta do bico de Bunsen, retirou-se uma pequena poro da
bactria desejada (j inoculada em placa petri).
Colocou-se uma gota de gua destilada em uma lmina, esfregou-se a ponta da ala com a
bactria na gota, fazendo um crculo.
Secou-se a gua com o auxlio do bico de bunsen.
Corou-se com Cristal violeta por 1 minuto.
Lavou-se com gua corrente.
Cobriu-se com Lugol por 1 minuto.
Lavou-se novamente com gua corrente.
Descorou-se com lcool (at que no haja mais desprendimento de corante).
Repetiu-se o procedimento de lavagem com gua corrente.
Corou-se com fucsina por 30 segundos.
Lavou-se com gua corrente e esperou-se a lmina secar.
Observou-se a lmina no microscpio na objetiva de 100x.

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Lise por KOH
Em uma lmina adicionou-se duas gotas de uma soluo de KOH 3%. Com o auxlio de uma
ala coletou-se uma colnia isolada da bactria a ser testada e misturou-se com a soluo de KOH
na lmina por 30 segundos. Durante a mistura, fazendo movimentos circulares, erguia-se a ala da
superfcie da lmina observando-se se havia formao de fios de material viscoso.

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Resultados e Discusso








Bactria Gram positiva vista do microscpio na objetiva de 100x. Bactria Gram negativa vista do microscpio na objetiva de 100x.
As bactrias roxas, com forma de bastonetes, vistas no microscpio eram gram-positivas,
enquanto as de colorao rosa com forma de cocus eram gram-negativas. Essa diferena de cor
ocorre, pois as bactrias gram-positivas possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua
parede celular, enquanto as gram-negativas possuem uma fina camada desse composto e uma
membrana externa, constituda por lipopolisacardeos. Ao corar as bactrias com cristal violeta e
lugol, o complexo de cristal violeta-iodo absorvido por ambas, porm, ao serem tratadas com
lcool, as espessas paredes celulares das bactrias gram-positivas so desidratadas, provocando a
contrao dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; enquanto a
poro lipdica das membranas externas das bactrias gram-negativas se dissolve, deixando o
complexo ser removido. Ao corar ambas com fucsina, as gram-negativas absorvem esse corante por
estarem incolores, diferentemente das gram-positivas, que no absorvem por j estarem coradas.
No teste de lise por KOH, observou-se que as bactrias Gram-negativas, quando entram em
contato com KOH, o mesmo rompe a parede celular dessas bactrias liberando seu DNA que
observado na forma de um fio viscoso quando se ergue a ala utilizada para misturar a bactria com
o KOH. Ao contrrio das bactrias Gram-negativas, as Gram-positivas no tem sua parede celular
rompida pelo KOH por ser mais espessa, fenmeno este observado durante o teste, onde ao se
misturar o KOH com uma bactria Gram-positiva, no se observou a formao do fio viscoso,
mostrando que o KOH no rompeu a parede celular da bactria, no liberando seu DNA.

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Referncias bibliogrficas
PELCZAR, MICHAEL. Microbiologia - Conceitos e Aplicaes - Vol. 2 - 2 Ed. Editora: Makron
Books, 2005.
WIKIPEDIA. Colorao de Gram. Disponvel em:
<http://pt.wikipedia.org/wiki/Tcnica_de_Gram>. Acesso em: 26 jul. 2014.
WIKIPEDIA. Bactrias. Disponvel em:
<http://pt.wikipedia.org/wiki/Bactria#Classifica.C3.A7.C3.A3o_Gram>. Acesso em: 26 jul. 2014.
EBAH. Mtodo de lise por KOH. Disponvel em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAADmsAK/microcopia-optica-coloracao-gram>. Acesso
em: 26 jul. 2014.