Trabajo Final de Biotecnologia PDF

PRODUCCIN DE PATATAS QUE EXPRESEN MS PROTEINA
Pgina de 1 26 MIGUEL NGEL CRESPN AGUILERA

PROYECTO PARA DESARROLLAR
PATATA QUE EXPRESE UN MAYOR
CONTENIDO EN PROTEINA
LICENCIATURA DE BIOQUMICA
MIGUEL NGEL CRESPN AGUILERA
CURSO 2013/2014

INDICE N pgina

INTRODUCCIN 3
GEN QQS 4
MATERIALES Y MTODOS 6
MATERIAL BIOLGICO 6
EXTRACCIN ADN DE Arabidopsis Y AMPLIFICACIN POR PCR 9
EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN 9
AMPLIFICACIN POR PCR Y VISUALIZACIN POR ELECTROFORESIS 11
ELECTROFORESIS DEL FRAGMENTO DE PCR 12
UNIN DEL GEN QQS AL VECTOR pBI121 14
TRANSFORMACIN DEL Agrobacterium tumefaciens 18
PREPARACIN E INFILTRACIN DEL CULTIVO DE Agrobacterium
TRANSFORMADO 22
REACTIVOS 24
BIBLIOGRAFIA 26

INTRODUCCIN

Los seres humanos deben mantener una dieta variada y nutricionalmente equilibrada para
mantener una salud ptima y dependen en gran medida de las plantas para sus necesidades
nutricionales diarias. Las protenas, uno de los principales componentes de una dieta equilibrada
y su potencial en el valor nutricional radica en sus constituyentes estructurales, los aminocidos.
La desnutricin proteica es causada esencialmente por las dietas de mala calidad , que incluyen
un alto consumo de alimentos bsicos con menos protenas y/o protenas de baja calidad en
trminos de la composicin de aminocidos. La deciencia de protenas disminuye la resistencia a
las enfermedades, retrasa el crecimiento fsico y el desarrollo, y puede causar dao permanente
del cerebro en los bebs y nios pequeos.

Uno de los grandes esfuerzos realizados en biotecnologa ha sido ha sido la mejora de la
composicin de aminocidos de la protena de la planta porque los animales, incluidos los
humanos, son incapaces de sintetizar 10 de los 21 aminocidos necesarios para la sntesis de
protenas "aminocidos esenciales " , lo cuales se deben obtener de la dieta. Debido a la
importancia de la protena de la dieta y el hecho de que las plantas son su principal fuente, el
desarrollo de estrategias para incrementar los niveles de protena y la concentracin de
aminocidos esenciales en cultivos de alimentos es de importancia primordial en un programa de
mejoramiento de los cultivos . Ha habido varios intentos a travs de mutantes seleccin e
ingeniera gentica que codican enzimas de la ruta de biosntesis de aminocidos esenciales
para aumentar los aminocidos esenciales libres en las plantas de cultivo, pero con un xito
limitado. Una estrategia prometedora es la ingeniera gentica de los genes que codican
protenas con alto valor nutricional en los cultivos de alimentos. Sin embargo , pese a las
promesas de que los cultivos modicados genticamente podran hacer una contribucin
signicativa en el aporte de alimentos con mayor contenido proteico, las variedades modicadas
genticamente de nueva generacin se han utilizado principalmente para los cultivos industriales,
como el algodn y forrajes, y pocos se han comercializado .

Aunque los cereales y los cultivos de alimentos con almidn contribuyen a ms del 80 % de las
caloras de una dieta , los cultivos no cereales son cada vez ms popular en todo el mundo con
los continuos cambios en los hbitos alimenticios. La demanda de cultivos no cereales seguir
aumentando como consecuencia de la expansin de la poblacin humana . La patata es el cultivo
alimentario ms importante dentro de los no cereales y ocupa el cuarto lugar en trminos de
produccin total mundial de alimentos. Tambin se utiliza como alimento para animales y en los
productos industriales. Hoy en da, la patata se cultiva en casi 125 pases y ms de mil millones de
personas en el mundo la consumen a diario. El valor total de la cosecha se estima en 30 mil
millones de euros para los 10 principales pases productores , que representan dos tercios de la
produccin mundial de patata. Las Naciones Unidas declararon 2008 como el " Ao Internacional
de la Patata ", armando la necesidad de centrarse en el papel que puede desempear para
proporcionar seguridad alimentaria. Desafortunadamente, la calidad nutricional de la patata est
muy comprometida debido a que contienen menos protenas y son decientes en lisina , tirosina, y
los aminocidos que contienen azufre. Para garantizar un suministro suciente de protena de
calidad en una dieta que consiste principalmente de los alimentos bsicos como es la patata, las
intervenciones especcas de la ingeniera gentica son una necesidad absoluta.

En este trabajo, vamos a utilizar el reciente descubrimiento sobre la capacidad del gen QQS de
Arabidopsis thaliana de aumentar la cantidad de protena en las semillas de soja desde un 30 a
un 60 %.

Para ello, vamos a cultivos de Arabidopsis se vamos a extraer el ADN, y por PCR amplicaremos
el gen QQS el cual ser insertado en el plsmido pBI121. Este plsmido se introducir en la
bacteria Agrobacterium tumefaciens y procederemos a infectar a la planta de la patata.

GEN QQS

La secuencia de este gen es casi caracterstica de esta planta, lo que facilitar la evaluacin de la
transfeccin del gen.

Se encuentra en el cromosoma n 3, codica una protena de 59 aminocidos de un peso
molecular de 7052,1 Dalton y un punto isoelctrico de 10,1042. El nmero accesin de la protena
es AT3G30720.1.

La secuencia completa se muestra en la siguiente gura y marcado en amarillo la zona
codicante.

1 CTCAGAAGAA GCCTCCTTTC GATCTGTCAG CCATTGAAGA AACCTCCTTT
51 CGATCTGTCA GCCATTGAAG ATCAGAAGAA ACAAGACTCA CACGGTCAGC
101 CATTGAAGAA GCCTCCTCTC ATTACCTCTC ATCAAACATC TAGATCTGTA
151 CCCAAACCTT ATCCCTTTTT CCTTATTTCT CGCTTTGTCT ATTCTTAATC
201 TGATTAATAC TTGTTGTTGT TCCAGGTTAT AGAAGATCTG GGTTGTGTTA
251 TATGCTTCAT TTTCTCCACA GGTAATATTC TTTTCATCCT TTCAAAAATA
301 ATTTCCGATT CGTCAGAGTG ATATTGATAA GATGCGAGTA CCATTGATTT
351 TCTTTTGTGT ATATTGAATG ATTCTTATAT TTCAGCGACC AGTTGGTGTT
401 TGGTTCTTAG ATTCATGAAG ACCAATAGAG AGGTAAACGA TTAGCCATTA
451 GTAACTTATT TGTAATTCAA ACGACTAACT TTCTTTAGTT TACTGAGATT
501 AAATCTTTCG TTTTGTAGCA GGAAATTTAC GTTGAAAGAA GCTTCAAACC
551 AAACAATTCA ACAATTCAGA ATTTGATGGA CATTGAAAGG TTCATTTTGC
601 CTCACACTTC TACATCAGGT GTCGCAAGGC TCAAAATGAG GGTCATATCA
651 TGGGTCGGGC TTCAGTTCTA CAACTACTGA TATTGGGCCT TATCACAAAT
701 TAGTTATAGG GCCATTGTAT CCAATATTTA ATATCTCTGT AAACTTGTTT
751 AATGGTTATT TTGTTCTAAT GCCCATTACA ACTAGA#
Figura n 1. Secuencia del gen QQS y su zona codicante (CDS) en amarillo

Por otro lado, presenta un intrn tal y como se observa en la siguiente gura


Figura n 2. Alineamiento de la secuencia completa del gen y la zona codicante

Alignment of Sequence_1: [SECUENCIA COMPLETA] with Sequence_2: [SECUENCIA CDS]

Similarity : 180/786 (22,90 %)

Seq_1 1 CTCAGAAGAAGCCTCCTTTCGATCTGTCAGCCATTGAAGAAACCTCCTTTCGATCTGTCA 60

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 61 GCCATTGAAGATCAGAAGAAACAAGACTCACACGGTCAGCCATTGAAGAAGCCTCCTCTC 120

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 121 ATTACCTCTCATCAAACATCTAGATCTGTACCCAAACCTTATCCCTTTTTCCTTATTTCT 180

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 181 CGCTTTGTCTATTCTTAATCTGATTAATACTTGTTGTTGTTCCAGGTTATAGAAGATCTG 240

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 241 GGTTGTGTTATATGCTTCATTTTCTCCACAGGTAATATTCTTTTCATCCTTTCAAAAATA 300

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 301 ATTTCCGATTCGTCAGAGTGATATTGATAAGATGCGAGTACCATTGATTTTCTTTTGTGT 360

Seq_2 1 ------------------------------------------------------------ 0

Seq_1 361 ATATTGAATGATTCTTATATTTCAGCGACCAGTTGGTGTTTGGTTCTTAGATTCATGAAG 420
||||||
Seq_2 1 ------------------------------------------------------ATGAAG 6

Seq_1 421 ACCAATAGAGAGGTAAACGATTAGCCATTAGTAACTTATTTGTAATTCAAACGACTAACT 480
||||||||||||
Seq_2 7 ACCAATAGAGAG------------------------------------------------ 18

Seq_1 481 TTCTTTAGTTTACTGAGATTAAATCTTTCGTTTTGTAGCAGGAAATTTACGTTGAAAGAA 540
||||||||||||||||||||||
Seq_2 19 --------------------------------------CAGGAAATTTACGTTGAAAGAA 40

Seq_1 541 GCTTCAAACCAAACAATTCAACAATTCAGAATTTGATGGACATTGAAAGGTTCATTTTGC 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Seq_2 41 GCTTCAAACCAAACAATTCAACAATTCAGAATTTGATGGACATTGAAAGGTTCATTTTGC 100

Seq_1 601 CTCACACTTCTACATCAGGTGTCGCAAGGCTCAAAATGAGGGTCATATCATGGGTCGGGC 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Seq_2 101 CTCACACTTCTACATCAGGTGTCGCAAGGCTCAAAATGAGGGTCATATCATGGGTCGGGC 160

Seq_1 661 TTCAGTTCTACAACTACTGATATTGGGCCTTATCACAAATTAGTTATAGGGCCATTGTAT 720
||||||||||||||||||||
Seq_2 161 TTCAGTTCTACAACTACTGA---------------------------------------- 180

Seq_1 721 CCAATATTTAATATCTCTGTAAACTTGTTTAATGGTTATTTTGTTCTAATGCCCATTACA 780

Seq_2 181 ------------------------------------------------------------ 180

Seq_1 781 ACTAGA 786

Seq_2 181 ------ 180


MATERIALES Y MTODOS

MATERIAL BIOLGICO

Arabidopsis thaliana

Todas las plantas de Arabidopsis thaliana (Fam. Brassicaceae) que se usarn pertenecen al
ecotipo Columbia-0 (Col-0) que se encuentran en el Arabidopsis stock centre (Universidad de
Nottingham, Reino Unido).

Germinacin in Vitro de semillas

-
Esterilizado de semillas: Se introducen las semillas en un tubo con etanol 70% y 001% Tritn
X-100, y se agita durante 5 minutos en un vrtex a mxima velocidad. Pasado este perodo se
retira la solucin de etanol y se aade leja comn al 30% con Tritn X-100 al 001%,
agitndose al vrtex durante 5 minutos.

Para nalizar se realizan de 5 a 10 lavados con agua estril hasta que desaparezcan las
burbujas. Antes de sembrar las semillas en cualquier medio, se incuban a 4C durante 48
horas mnimo para sincronizar la germinacin.

-
Lquido: una vez esterilizadas las semillas, stas se incuban durante al menos 48 horas a 4oC.
Posteriormente se inoculan en 250ml de medio MS contenidos en un matraz, todo en
condiciones estriles, y se incuba a 23oC, con da largo (16 horas de luz y 8 de oscuridad) y en
agitacin. Si se deseaba un mayor crecimiento de las races con respecto a las zonas areas, el
medio usado era 12 MS.

-
En placa: las placas se componen de medio MS, agarosa al 1% y los antibiticos de seleccin
apropiados, hasta una concentracin nal de 100#g/ml.

Solanum tuberosum

Se plntulas mantenidas in vitro a 23 C, 34 #Em
-2
s
-1
y 16 horas de fotoperiodo de los cultivares
Dsire y Superior. El subcultivo de estas plntulas se realiz cada 3-4 semanas transriendo
segmentos de tallo incluyendo un brote axial. El medio empleado en la propagacin estaba
constituido por sales MS y 3 % (p/v) de sacarosa suplementado con 0,5 mg/l de cido
indolactico, 0,2 mg/l de kinetina y 0,7 % (p/v) de agar.

Vector pBI121

Este vector de la rma CLONTECH, se utiliza para introducir fragmentos de DNA en planta
usando Agrobacterium como mediador. En el caso concreto de este trabajo, se us por poseer el
gen GUS controlado por el promotor 35S. Este vector tambin tiene como regin importante el gen
NPT-II, que otorga resistencia a Kanamicina.

En la siguiente gura se encuentra el mapa de este plsmido y las enzimas de restriccin
adecuadas (XbaI, BamHI y SmaI) para cortar e insertar el ADN de inters.


Figura n 3. Mapa del plsmido pBI121

En este trabajo se propone utilizar la enzima de restriccin BamHI que reconoce la secuencia

GGATCC
CCTAGG

Esta secuencia no se encuentra dentro de la zona CDS, de modo que a la hora de insertar en gen
en el plsmido nos garantizamos que introducimos el gen completo amplicado con la PCR cuyos
cebadores incluyen en el extremo 5 la secuencia que reconoce BamHI.

A modo ilustrativo mostramos la secuencia del gen QQS y los enzimas de restriccin que pueden
cortar su secuencia, y se observa que la enzima BamHI no aparece entre las encontradas.


Figura n 4. Secuencia gen QQS y los enzimas de restriccin que pueden cortarla

Agrobacterium tumefaciens

Utilizaremos la cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plsmido binario desarmado
que porta los genes vir.

Todas las bacterias se crecieron en medio L conteniendo 1 % (p/v) triptona, 0,5 % (p/v) extracto de
levadura, 0,1 % glucosa, 1 % agarosa (solo en caso de cultivo en placa) y ,5 % (p/v) de NaCl; todo
ello ajustado a pH 7,0 con NaOH y esterilizado en autoclave (20 minutos a 120 C). La
temperatura ptima de crecimiento es de 25-28 C.
Los antibiticos aadidos para la posterior seleccin se esterilizaron por ltracin, usando
membranas Millex-GV (MILLIPORE) de 0,22#m de tamao de poro. La concentracin nal
aadida era de 100 #g/mL de cada antibitico.

CEBADORES

Para realizar la amplicacin del gen QQS mediante PCR se van a utilizar los siguientes
cebadores, los cuales incluyen dentro de su secuencia los nucleotidos que son reconocidos por la
enzima de restriccin BamHI.

5-GGATCCATGAAGACCAATAGAGAG-3 Tm= 63,5 C %C+G= 45,8 FORWARD

5-GGATCCTCAGTAGTTGTAGAACTG-3 Tm= 63,5 C %C+G= 45,8 REVERSE

Figura n 5. Secuencia del gen QQS amplicada por PCR en donde se observa la secuencia BamHI introducida

EXTRACCIN ADN DE Arabidopsis Y AMPLIFICACIN POR
PCR

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN

El protocolo que se detalla a continuacin se utiliza para obtener mini-preps de ADN genmico, y
el buffer de extraccin posee SDS como detergente.
PASOS
1. Encender el bao termosttico y regular a 65 C.
2. Colocar aproximadamente entre 100 y 200 mg de tejido joven en tubos de 1,5 mL estriles.
Tapar el tubo, rotularlo y sumergirlo en N2 lquido.
3. Precalentar el buffer de extraccin (EB) en el bao a 65 C. Agregar 1 #L de BETA-

mercaptoetanol por cada mL de EB (EB + B).
4. Extraer el tubo del recipiente con N2 lquido. Abrirlo y extremando los cuidados para no perder la
muestra, colocar en su interior un poco de N2 lquido. Moler con taladro o vrtex hasta obtener un
polvo muy no. LA MUESTRA DEBE PERMANECER CONGELADA DURANTE TODO EL
PROCESO. Si comienza a descongelarse, agregar ms N2 lquido.
5. Una vez pulverizada la muestra, agregar 400 #l de buffer EB + B. Volver a moler y mezclar en
vrtex.
Hasta aqu se pueden utilizar movimientos mecnicos "fuertes", como taladro y vrtex, porque el
ADN an no est en solucin, sino dentro de los ncleos. Luego de la incubacin se libera el ADN
en la solucin, y cualquier esfuerzo mecnico intenso puede romper las hebras, por lo que el resto
del protocolo debe efectuarse con un tratamiento relativamente suave.
6. Incubar durante 10-15 min a 65 C en el bao termosttico.

<Serial Cloner V2.5> -- <26/05/2014 09:35>
Restriction map of PCR(SECUENCIA CDS)
Showing restriction enzymes cutting maximum 1 time [using RELibrary as a Restriction Enzyme Library]
###

>BbvII
>MboII
>BpuAI
>BpiI
>BstV2I MaeII
>BbsI HpyCH4IV AluI
>Bbr7I TaiI HindIII
BamHI(*) HpySE526I AluBI >Tth111II Hpy188I <BccI
| | | || | | |
GGATCCATGAAGACCAATAGAGAGCAGGAAATTTACGTTGAAAGAAGCTTCAAACCAAACAATTCAACAATTCAGAATTTGATGGACATTGAAAGGTTCA < 100
ACCTAGGTACTTCTGGTTATCTCTCGTCCTTTAAATGCAACTTTCTTCGAAGTTTGGTTTGTTAAGTTGTTAAGTCTTAAACTACCTGTAACTTTCCAAGT
10 20 30 40 50 60 70 80 90

BamHI(*)
HpyF3I
<BspCNI
<AcuI BstDEI
<Eco57MI <BseMII
<Eco57I DdeI
>PlaDI <ArsI <Sth132I <PspPRI
| | | | | |
TTTTGCCTCACACTTCTACATCAGGTGTCGCAAGGCTCAAAATGAGGGTCATATCATGGGTCGGGCTTCAGTTCTACAACTACTGAGGATCCA < 192
AAAACGGAGTGTGAAGATGTAGTCCACAGCGTTCCGAGTTTTACTCCCAGTATAGTACCCAGCCCGAAGTCAAGATGTTGATGACTCCTAGG
110 120 130 140 150 160 170 180 190

7. Agregar 150 #L de acetato de potasio 5 M. Mezclar SUAVEMENTE invirtiendo el tubo varias

veces, y dejar en hielo molido durante 20-30 min.
8. Centrifugar 15 min a 10.000 rpm (si es posible, con nalizacin lenta del ciclo de centrifugado).
9. Con una micropipeta, extraer cuidadosamente el sobrenadante (que contiene el ADN en

solucin), evitando levantar impurezas, y trasvasar a un tubo estril de 1,5 mL. Si no se pueden
evitar las impurezas, centrifugar 5 min ms a 10.000 rpm, y pasar el sobrenadante a un nuevo
tubo.
Composicin de EB: 0.1M Tris HCl pH:8; 0,5M NaCl; 50mM EDTA-Na pH:8; 1,2%SDS.
10. Agregar alcohol isoproplico en un volumen equivalente a la mitad del volumen trasvasado
(aproximadamente 250-300 #L). Mezclar bien, pero suavemente. Si la cantidad de ADN es
abundante, se visualizar como un culo otando en la solucin. Enfriar en hielo o freezer
durante un mnimo de 10 min. La cantidad de ADN precipitado es proporcional a la duracin de
esta etapa, por lo que es conveniente dejar las muestras en freezer hasta el da siguiente,
principalmente cuando la cantidad de ADN es limitada. Cuando se procesan un elevado nmero
de muestras, esta etapa es un punto conveniente de detencin ya que stas pueden quedar en
freezer hasta el otro da.
11. Centrifugar 5 min a 10.000 rpm. Eliminar el sobrenadante volcndolo lentamente en un
recipiente, teniendo la precaucin de que no se desprenda el pellet del fondo del tubo.

12. Secar el pellet a temperatura ambiente, invirtiendo el tubo sobre un papel tissue estril durante
30 min, o en bloque calentador a 70 C durante 5 min. En ambos casos, evitar que el pellet se
reseque demasiado porque se diculta su posterior resuspensin.

13. Resuspender en 100 #l de buffer TE, agitando suavemente (NO USAR EL VRTEX). Si se
diculta la resuspensin, calentar a 30 C en bao termosttico o en bloque calentador si el
proceso es muy lento.
14. Agregar 100 #l de acetato de amonio y 200 #l de etanol 96% (para reprecipitar); mezclar
suavemente invirtiendo el tubo. Enfriar en freezer durante 30 min.
15. Centrifugar 10 min a 10 000 rpm. Eliminar el sobrenadante como en (11) y lavar el pellet con
100 #l de etanol 70%. Volcar y secar el pellet como se indic en (12).
16. Resuspender en 100 #L de TE. Para conservar a corto plazo (hasta 2 meses) se puede dejar
directamente a 4 C. Para mantener hasta 1-2 aos, guardar en congelador a -20 C, y para
perodos de ms de 2 aos, guardar en congelador a -80 C o en N2 lquido. Siempre que se
guarde en congelador, evitar someter las muestras a muchos procesos de congelado y
descongelado, porque disminuye la vida til de las mismas.
Composicin de TE: 10 mM Tris HCl, pH:8; 1 mM EDTA-Na pH:8. 6


AMPLI FI CACI N POR PCR Y VI SUALI ZACI N POR
ELECTROFORESIS

En este apartado vamos a realizar una amplicacin del gen QQS contenido en el ADN genmico
obtenido en la etapa anterior, utilizando para ello los cebadores anteriormente citados. En la
ltima etapa de este apartado se realizar una electroforesis del producto obtenido en la PCR
para posteriormente aislarlo y poder insertar el fragmento dentro del vector pBI121.
1. Rotular 4 tubos de PCR de 0.2 mL: dos para la reaccin de PCR problema en duplicado y otros
2 para el control negativo en duplicado (con agua Milli- QTM en lugar del ADN). Mantener siempre
los tubos en hielo hasta colocarlos en el termociclador.
2. Descongelar en hielo el buffer de PCR, los dNTPs, los primers y el ADN. Mantener el agua
Milli-QTM en hielo. Agitar con vrtex a los reactivos pero no el ADN ni la enzima.
Sacar la polimerasa del congelador al momento de usarla y mantenerla en
hielo en todo momento. Regresar la polimerasa al congelador inmediatamente
despus de usarla.
3. En un tubo de 1.6 mL nuevo estril y sobre hielo, agregar los ingredientes para hacer el coctel
de reaccin para las 4 reacciones (problema y control negativo en duplicado), considerando una
reaccin adicional para que no falte. Seguir el orden indicado comenzando por el agua, omitiendo
el ADN y terminando por la polimerasa.
Agitar con vrtex antes de agregar la polimerasa. Despus de agregar la
polimerasa, mezclar por inversin sin usar vrtex. En la Tabla 1 se muestran
los volmenes necesarios por tubo para una reaccin de 100 #L
Tabla n 1. Reactivos para la PCR
4. Distribuir en cada tubo el ADN y despus el coctel de reaccin.
5. Mezclar los componentes golpeando suavemente los tubos con el dedo y dar un pulso en la
centrfuga a los tubos durante 2 segundos para hacer que el lquido quede en el fondo del tubo y
se mezclen todos los componentes.
6. Programar el termociclador con las condiciones de amplicacin necesarias, siguiendo como
gua la Tabla 2 mostrada a continuacin:
Componente Volumen por reaccin de 100 #L
Agua Milli-Q Hasta completar a 100 #L
Buffer 10x 10 #L
Primer Forward (50 #M) 1 #L
Primer Reverse (50 #M) 1 #L
dNTPs 10 mM 2 #L
ADN molde 10-50 ng
Taq ADN polimerasa 5 U/mL 1 #L

Tabla n 2. Condiciones de amplicacin

7. Visualizar el fragmento de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % a 85 V durante
45 min.

ELECTROFORESIS DEL FRAGMENTO DE PCR

El fragmento amplicado que se espera obtener ser el observado en la gura n 5, y tendr un
peso aproximado de 7,17 kDa (192 pb), de modo que con un gel que contenga 2 % de agarosa
ser suciente para poder verlo correctamente, tal y como se muestra en la tabla 3 en donde se
aprecia el contenido en agarosa necesario en funcin de los fragmentos a separar.

Tabla n 2. Relacin de la concentracin de agarosa y los fragmentos a separar

PASOS

1.Limpiar y secar los cristales de preparacin de geles y los peines con agua destilada y
ensamblarlos. Colocar los cristales en una supercie horizontal y nivelada.

2.Acomodar los peines a 0.5 -1.0 mm del fondo de ellas.

3. Preparar, en una botella una solucin de agarosa al 2 % (p/v), en buffer TBE 0.5$, disolver la
agarosa calentando las mezclas en horno de microondas. No apretar las tapas de las botellas.
Vericar que la agarosa est completamente disuelta por medio de agitacin.

FASE N CICLOS TEMPERATURA TIEMPO
Desnaturalizacin inicial 1 94 C 3 min
Desnaturalizacin 94 C 30 s
Alineamiento 25 a 35 58,5 C 30 s
Polimerizacin 72 C 1 min
Extensin nal 1 72 C 7 min
4 C
Concentracin agarosa % (p/v) Longitud del fragmento pb
0,5 25000 - 2000
0,7 10000 - 800
1,0 8000 - 500
1,2 5000 - 400
1,5 3000 - 200
2,0 2000 - 100

La solucin de agarosa se calienta mucho y puede hervir violentamente si
se calienta por largos periodos en el horno de microondas.

4.Dejar enfriar la solucin de agarosa por debajo de 60 C.

5.Verter la agarosa tibia en cada soporte de cristal nivelada y esperar a que solidique.

6.Remover cuidadosamente los peines y montar los geles en las cmaras de electroforesis.

7.Verter el buffer TBE 0.5x en las cmaras hasta cubrir el gel (!1 mm por encima del gel).

8.Descongelar las muestras de ADN y los marcadores de peso molecular en hielo.

9.En un trozo de Paralm mezclar las muestras de ADN y los marcadores de peso molecular con
el buffer de carga 5x y agua Milli-QTM hasta un volumen nal de 12 #L. NOTA: Calcular los
volmenes de ADN, agua y buffer de carga 5x para tener cantidades nales de ADN de 200 ng a
1.0 #g aproximadamente y una concentracin nal 1x del buffer de carga.

10.Utilizando la micropipeta, cargar lentamente los marcadores de peso molecular en el pozo
correspondiente al primer carril del gel.

No tocar el fondo del pozo con la punta para evitar perforar el gel. Evitar
burbujear con la micropipeta mientras se coloca la muestra para que sta
no se salga del pozo.

11.De la misma forma, cargar las muestras de ADN en los pozos siguientes (registrar el orden de
las muestras en los pozos).

12.Cerrar las cmaras de electroforesis y aplicar una corriente de 85 V.

Si la cmara se coloca adecuadamente, se observar la formacin de
burbujas en los electrodos.

13.Cuando el azul de bromofenol haya migrado lo suciente (!34 partes
del gel), apagar la fuente de poder y sacar el gel de la cmara.

14.Teir los geles en una solucin de agua Milli-QTM con bromuro de etidio
(0.5 #g/mL) o SYBR Green I 1$ durante 30 min. Utilizar una charola
especca para la tincin y usar un volumen de agua suciente para cubrir
el gel. Si se utiliza SYBR Green I, el gel se debe proteger de la luz.

A modo de ejemplo se muestra como sera la electroforesis obtenida en
donde se observara una banda cercana a las 200 pb.

Figura n 6 Electroforesis
UNIN DEL GEN QQS AL VECTOR pBI121

Antes de realizar esta etapa debemos de puricar el producto de PCR obtenido utilizando la
extraccin con fenol, precipitacin con etanol y separacin del ADN por adsorcin sobre silica; y
posteriormente determinar su concentracin y pureza.

PURIFICACION DEL ADN

a. Extraccin con fenol y precipitacin con etanol
El fenol puede causar quemaduras severas y dao en la ropa. Utilice y
bata guantes en todo momento. El fenol debe trabajarse en campana de
extraccin.
1. Preparar 1 mL de solucin fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1, v/v/v) en un microtubo
de 1.6 mL.
2. Colocar 50 #L de producto de PCR en un microtubo de 1.6 mL.
3. Completar a 400 #L con agua Milli-QTM estril.
4. Agregar un volumen igual de solucin fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1, v/v/v).
5. Agitar en vrtex vigorosamente por 10 segundos.
6. Centrifugar a 13,000 rpm por 1 min.
7. Con mucho cuidado, remover la fase acuosa (superior) con una punta de pipeta de 200 #L y
verterla en un microtubo nuevo. NOTA: Si en la interface hay precipitados blancos repetir los
pasos 4 a 7. Concentraciones altas de sales pueden provocar la inversin de las fases. La fase
orgnica puede ser identicada por su color amarillo.
8. Agregar 1/10 volmenes de acetato de sodio (3 M, pH 5.2).
9. Agitar con vrtex por 2 segundos.
10. Agregar de 2 a 2.5 volmenes (calculado despus de la adicin del acetato de sodio) de etanol
absoluto fro.
11. Mezclar con vrtex por 2 segundos.
12. Incubar en hielo por 5 min.
14. Eliminar el sobrenadante por inversin lenta del tubo con cuidado de no desprender la pastilla
de ADN.
15. Agregar 1 mL de etanol 70%. Mezclar invirtiendo el tubo varias veces.
17. Eliminar el sobrenandante (ver punto 14) y secar la pastilla en un evaporador al vaco.
18. Disolver la pastilla en 50 #L de TE.


b. Puricacin con slica
1. Preparar y marcar 2 microtubos de 2 mL y un Spin Filter por muestra.
2. Agitar la solucin SpinBind antes de usar.
3. Agregar 5 volmenes de SpinBind a 50 #L de producto de PCR en un microtubo.
4. Mezclar bien con micropipeta.
5. Transferir la mezcla a un Spin Filter.
7. Remover el ltro y eliminar por decantacin el lquido del microtubo.
8. Colocar nuevamente el ltro en el mismo microtubo.
9. Agregar 300 #L de SpinClean Buffer en el ltro sin tocar la membrana.
11. Remover el ltro y eliminar por decantacin el lquido del microtubo.
12. Colocar nuevamente el ltro en el mismo microtubo.
14. Transferir el Spin Filter a un microtubo nuevo
15. Agregar 50 #L de Elution Buffer en el centro del ltro.
16. Centrifugar a 13,000 rpm por 10-30 segundos.
17. Eliminar el ltro Spin. El ADN puricado se encuentra en el microtubo.
18. Conservar el ADN a -20 C.
Visualizar los productos puricados en a) y b) por electroforesis en un gel de agarosa y
cuanticarlos por espectrofotometra.
CUANTIFICACIN DEL ADN
El clculo ms comn para evaluar la pureza consiste en determinar la relacin entre la
Absorbancia a 260 nm (Absorbe ADN, ARN e intereren las protenas) y la absorbancia a 280 nm
(protena). Un ADN de buena calidad deber tener una relacin A260/A280 entre 1.7 y 2.0
En la siguiente tabla se muestra la relacin de absorbancias A260/A280 para estimar la pureza del
ADN. Por otro lado, las lecturas a 320 nm podran indicar si hay turbidez en la solucin, una
posible contaminacion, por ello es conveniente realizar lecturas a 320 nm para obtener una mayor
informacin de la calidad de la muestra.


La concentracin del ADN puede ser estimada ajustando la A260 con la medicin de turbidez,
multiplicndolo por el factor de dilucin y la relacin A260 de 1.0 = 50 #g/mL de ADN puro:
Concentracin ADN (#g/mL) = (A260-A320) x (factor de dilucin) x 50$

El rendimiento total obtenido se calcula multiplicando la concentracin del ADN por el volumen
total de muestra:
Rendimiento ADN (#g) = (Concentracin ADN) x (volumen total de la muestra)
La pureza de la muestra se obtiene mediante la relacin A260/A280, despus de ajustar con el
valor de turbidez:
Pureza ADN (A260/A280) = (A260-A320) / (A280-A320)

UNIN DEL GEN QQS AL VECTOR pBI121
Una vez tenemos nuestro fragmento de ADN con la secuencia que reconoce la enzima de
restriccin BamHI procederemos a unirlo al vector, pero para ello debemos de linealizar el
plsmido.
Para la linealizacin del plsmido, obtenido comercialmente, procedemos a la incubacin de 50 -
500 #g de plsmido entero, 1 U/#L de ARNsa, 1 #g/#L de BSA, BamHI 0.5 U/#L junto con el
tampn de sta 1x. Transcurridas 2 horas a 37 C se para la reaccin congelando a -20 C.
El siguiente paso es correr un gel de agarosa al 1% con el producto de la PCR que previamente
se ha sometido a BamHI (utilizando el mismo procedimiento que el utilizado para el plsmido pero
sin la ARNsa) y el de la restriccin, para despus poder aislar los fragmentos correctos siguiendo
el siguiente protocolo para aislamiento de fragmentos de ADN de geles.
PASOS:
Se usa el kit de aislamiento de DNA de Millipore.
1. Una vez corrido el gel de agarosa y cortada la banda a puricar, se introduce sta en un
cartucho del kit y se centrifuga a 12000 g durante 20 minutos. Si al volumen obtenido lo
llamamos v1, introducimos ahora 400 #l-v1 al cartucho, dejando incubar 1 hora. Despus se
procede a otro centrifugado igual. El volumen obtenido se mezcla con 2 #g de t-RNA y el mismo
volumen de PCI.
Proteina (%) A.Nucleico (%) A260 Proteina (%) A.Nucleico (%) A260
100 0 0.57 40 60 1.91
90 10 1.32 30 70 1.94
80 20 1.59 20 80 1.97
70 30 1.73 10 90 1.98
60 40 1.81 0 100 2.00
50 50 1.87

2. Pasados 5 minutos se recupera la fase acuosa y se precipita el DNA con etanol absoluto y
acetato de sodio 150mM, dejando incubar la mezcla 2 horas a -20 C.
3. Finalmente, la mezcla se centrifuga a 12500 g durante 30 minutos, se lava el pellet obtenido
con etanol 70%, se seca y se redisuelve el DNA en agua.
4. Una vez aislados los 2 fragmentos, se proced a su ligacion, para ello mezclamos 1 U/#L de T4
ADN ligasa (ROCHE), tampn de ligacin (ROCHE) 1x y los dos productos aislados del gel en
proporcin molar 1:5 (vector/inserto) y se incuba durante 1 horas a 25 C.
5. Se analiza la reaccin de ligacin en un gel de agarosa al 0.5 % para comprobar que se ha
realizado correctamente el inserto, con una banda que tenga 14758 bp (plsmido) + 186 bp
(inserto) = 14944 bp.
Figura n 7. Proceso de la unin del fragmento de ADN al plsmido

TRANSFORMACIN DEL Agrobacterium tumefaciens

Este apartado se divide en tres partes, en primer lugar debemos de preparar el Agrobacterium
para hacerlo competente y poder ser transformado por electroporacin, en segundo lugar se
realizar la transformacin de las clulas de Agrobacterium y en tercer lugar se proceder a
comprobar la transformacin del Agrobacterium mediante electroforesis en gel de agarosa o bien
por PCR.

TRANSFORMACIN DE Agrobacterium A ESTADO COMPETENTE
Debido a que el ADN es una molcula hidroflica, su paso a travs de la membrana plasmtica
ser prcticamente imposible si no se realiza algn proceso que lo permita. Cuando una bactera
tiene la capacidad de dejar pasar un plsmido de ADN a su interior a travs de su membrana
plasmtica decimos que esta bacteria se encuentra en estado competente. En el caso que nos
ocupa, electroporacin, para que ocurra la transformacin, el ADN es conducido hacia el interior
de las clulas mediante un proceso inicial de incubacin en hielo de una mezcla que contiene las
clulas competentes y el ADN seguido de la electroporacin.
MATERIALES
1. Cepa de Agrobacterium, en nuestro caso es la LBA 4404
2. Placas con medio LB
3. 1 mM 4-(2-hidroxyetil)piperazina-1-etano cido sulfnico (HEPES), pH 7, esterilizado por
ltracin (ltro de 0.45 #m). Se puede mantener a temperatura ambiente hasta 3 meses
4. Glicerol esterilizado
5. Incubador a 28 C
6. Agitador orbital a 28 C
7. Frascos de 250 mL
8. Tubos de centrgura con tapadera, esterilizados, con capacidad de 50 mL
9. Tubos de microcentrfuga esterilizados de 1.5 mL
PASOS
1. Sembrar por estrias Agrobacterium en un placa con 10 mL de medio LB suplementado con 20
#g/mL de rimpicina y se incuba a 28 C durante 2 das.
2. Toma una colonia e inocularla en un tubo que contiene 5 mL de medio LB
3. Incubar el tubo en un agitador orbital toda la noche a 28 C, a unas revoluciones comprendidas
entre 200 y 300 rpm.
4. En un tubo de 250 mL que contiene 100 mL de medio LB, se incolula 1 mL del cultivo obtenido
en el paso anterior. Se incuba durante 6 horas a 28 C o hasta que el cultivo alcance una
densidad ptica a 600 nm comprendida entre 0.5 y 0.6.

5. Una vez incubado llevamos el frasco a un cubo con hielo y lo dejamos 30 minutos.
6. Transferimos las clulas a un tubo de centrfuga de 50 mL y lo centrifugamos durante 5
minutos a 2000 g (5000 rpm) a 4 C. Se desecha el sobrenadante
7. Se resuspende el pellet en 20 mL de HEPES 1 mM, pH 7.0. Se centrifuga durante 5 minutos a
2000 g a 4 C. Se desecha el sobrenadante
8. Lavamos el pellet con 20 mL de HEPES 1 mM, pH 7.0 y aadimos glicerol esterilizado hasta
alcanzar una concentracin nal de 10 % (v/v)
9. Colocamos alcuotas de 50 #L de las clulas electrocompetentes dentro de tubos de
microcentrfuga de 1.5 mL
10. Usamos las clulas inmediatamente o se guardan a -80 C durante 3 meses.
ELECTROPORACION DE LAS CLULAS COMPETENTES DE Agrobacterium
Hemos seleccionado la transformacin por electroporacin debido a que ofrece mejor eciencia
que otros mtodos existentes para este propsito. El principio bsico de la electroporacin radica
en generar un estmulo mediante un choque elctrico que permita a las clulas abrir unos poros
en su pared celular, por los cuales entrar el plsmido que contiene el ADN de inters. La
eciencia en la transformacin de este mtodo alcanza un valor de 10
9
a 10
10
transformantes/#g
ADN.
MATERIALES
1. Clulas de competentes de Agrobacterium
2. ADN plasmdico que contenga el gen de inters. En nuestro caso pHI121 con el gen QQS de
Arabidopsis thaliana
3. Medio YEP o SOC
4. Placas con medio YEP suplementado con 50 #g/mL de kanamycina y 50 #g/mL de rimpicina.
5. Cubetas de eletroporacin de 0.1 o 0.2 cm, hielo
6. Electroporador
7. Tubos de microcentrfuga de 1.5 mL o tubos de plstico de 5 mL. Esteriles
9. Incubador a 28 C
10. Microcentrfuga

PASOS
1. En un tubo de microcentrfuga que contenia una alcuota de 50 #L de las clulas
electrocompetentes se aadimos de 2 a 5 #g del plsmido.
2. Incubamos durante 5 minutos en hielo
3. Colocamos la mezcla dentro de una cubeta de electroporacin.
4. Electroporamos las clulas con pulsos de 25 #F (capacitancia), 400 % (resistencia) a 1.25 KV
(0.1 cm) o 2.5 KV (0.2 cm), seguidos de 8 a 9 milisegundos de descanso.
5. Una vez nalizado aadimos, inmediatamenta, 0.9 mL de medio YEP o SOC
6. Llevamos la solucin a un tubo esteril de microcentrfuga de 1.5 mL y lo incubamos durante 2
o 3 horas con agitacin a 28 C
7. Centrifugamos las clulas durante 5 minutos a 500 g, a temperatura ambiente. Desechar la
mayora del sobrenadante, dejando alrededor de 100 #L para resuspender
8. Mezclar el pellet tapando el tubo con paralm
9. Sembrar por estrias la mezcla transformada en placas con medio YEP suplementadas con 500
#g/mL de kanamycina y 50 #g/mL de rimpicina.
10. Incubar las placas durante 48 horas a 28 C.
11. Las placas se pueden guardar hasta 3 semanas a 4 C

VERIFICACIN DE LA TRANSFORMACIN DE Agrobacterium
En este apartado vamos a realizar la vericacin mediante PCR ya que permite la amplicacin
del gen de inters en menos de 3 horas utilizando los apropiados cebadores, para posteriormente
vericarlo mediante electroforesis en gel de agarosa.
MATERIALES
1. Clulas de Agrobacterium transformadas
2. Agua esteril
3. Tampn de reaccin 10x
4. 20 #M del cebador forward del gen de inters
5. 20 #M del cebador reverse del gen de inters
6. 2.0 mM de dNTPs
7. 100 mM de MgCl2
8. Polimerasa Taq
9. Geles de agarosa al 2 %

PASOS
1. Tomar colonias de Agrobacterium transformado (10 a 20 colonias) y suspenderlas en 10 #L de
agua destilada
2. Incubar, cada suspensin, durante 3 minutos a 100 C en un termociclador
3. Mientras se incuba la muestra se prepara el siguiente disolucin que contiene
1. 2.0 #L de tampn de reaccin 10x
2. 1.0 #L de 20 #M cebador forwards
3. 1.0 #L de 20 #M cebador reverse
4. 3.0 #L de 2.0 mM dNTPs
5. 0.5 #L de 100 mM MgCl2
6. 0.3 #L de polimerasa Taq
7. 2.2 #L de agua
4. Aadir 10 #L del mix anterior a cada suspensin y agitar
5. Colocar cada mezcla de reaccin en el termociclador y se introduce la siguiente programacin

6. Analizar los productos de la PCR en un gel de agarosa al 2 % para vericar la presencia o
ausencia del gen de inters.
7. Una vez identicadas las colonias como positivas, se pueden guardar permenentemente en
una solucin de glicerol para futuros experimentos de agroinltracion.

Tiempo (min) Temperatura (C) Etapa
25 a 30 ciclos
1 94 desnaturalizacin
1 55 hibridacin
1 72 extensin
10 72 extensin nal

PREPARACI N E I NFI LTRACI N DEL CULTI VO DE
Agrobacterium TRANSFORMADO

En esta etapa se va a proceder a la inltracin de la planta de patata con el agrobacterium
transformado al objeto de introducir el nuevo gen. Las etapas necesarias consiste en la inltracin
y conrmacin de la introduccin del nuevo gen en las plantas de patata.

Se van a utilizar plantas de semillero de 3 o 4 semanas.

MATERIALES

1. Clulas de Agrobacterium transformadas
2. Placas con LB suplementadas con 50 #g/mL de kanamicina y 50 #g/mL de rimpicina
3. Medio LB suplementado con 50 #g/mL de kanamicina y 50 #g/mL de rimpicina
4. Solucin 1 M de cido 2-(N-morfolin)etanosulfnico (MES), pH 5.6, esterilizado por ltracion
(0.45 #m). Se puede guardar hasta 3 meses a temperatura ambiente en botella oscura
5. Solucin de 100 mM de 5dimetoxi-4-hidroxiacetofenona (acetotisiringona) en DMSO
6. Solucin de 10 mM de MgCl2 , preparada a partir de una soluicon esterilizada por ltracin
(0.45 #m) de 1 M.
7. Agua esteril
8. Plantas de semillero de 3 o 4 semanas de Solanum tuberosum con 2 o 3 hojas bien
expandidas
9. Incubador a 28 C
11. Tubos de plstico esterilizados de 50 mL o 100 mL
12. Una jeringa de 1 mL sin aguja
13. Un invernadero o cmara de crecimiento con una temperatura comprendida entre 20 y 23 C
con condiciones de luz ajustables.

PASOS
1. Sembrar una colonia identicada como positiva en una placa con medio LB suplementada con
los kanamicina y rimpicina. Incubar durante 48 horas a 28 C
2. Toma una colonia de la placa e incubarla en un tubo que contiene medio LB suplementado con
50 #g/mL de kanamicina y 50 #g/mL de rimpicina
3. Incubar en agitador orbital durante 48 horas a 28 C a unas revoluciones comprendidas entre
200 y 300 rpm.
4. Inocular 1 mL del cultivo obtenido en el paso anterior en un tubo que contiene 50 mL de medio
LB suplementado 50 #g/mL de kanamicina y 50 #g/mL de rimpicina. Aadimos solucin MES
1 M pH 5.6 y solucin de acetosiringona 100 mM hasta una concentracin nal de 10 mM y
100 #M, respectivamente.
5. Incubar en agitador orbital durante 16 horas a 28 C a unas revoluciones comprendidas entre
200 y 300 rpm
6. Medir la densidad ptica a 600 nm y debe de ser prximo a 1. En este paso, el cultivo debe de
emitir un olor que se asemeja al maz dulce, lo que indica que el gen virulento del plsmido T
ha sido activado.
7. Transferir el cultivo a un tubo esteril
8. Centrifugar durante 10 minutos a 2000 g, a temperatura ambiente
9. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 mL de solucin 10 mM de MgCl2
10. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm, a temperatura ambiente. Desechar el
sobrenadante
11. Resuspender el pellet en 50 mL de una solucin 10 mM de MgCl2 y aadir solucin de
acetosiringona 100 mM hasta una concentracin nal de 100 #M. Mezclar
12. Dejar en reposo el cultivo durante 3 horas, a temperatura ambiente y sin agitacin
13. Utilizando una jeringa de 1 mL, expandir el cultivo en ambas caras del disco foliar (es
conveniente probar primero para ver que cantidad de cultivo necesitamos para poder inltrar
las hojas. La parte de la hoja totalmente inltrada da un aspecto de hoja en remojo.
14. Para una transferencia inmediata, se transeren las plantas al invernadero o a la cmara de
cultivo
15. Para una transferencia demorada, se mantienen las plantas agroinltradas en la cmara de
cultivo durante 1 da bajo condiciones medias de luz (1000 lux) con 16 horas de luz y 8 horas
de oscuridad, a un temperatura comprendida entre 20 y 23 C, y despus se llevan al
invernadero o a la cmara de cltivo.
16. Muy importante NO sobrepasar la temperatura de 23 C ya que se puede inhibir el T-DNA
transferido
17. Recoger muestras de hojas a los 2 das de la inltracin para evaluar el grado de expresin
del gen de inters.


Otro mtodo para poder realizar la inltracin consiste en el protocolo descrito por Bechtold y
Pelletier en 1998. ste es un mtodo de transformacin in vivo, es decir, no requiere pasos
previos de desdiferenciacin y regeneracin que causan numerosas mutaciones. El mtodo
consiste en sumergir los tallos orales de la planta en la solucin de las clulas de Agrobacterium
tumefaciens y el tampn de inltracin, sometiendo el conjunto al vaco durante 10 minutos.
Una vez naliza la inltracin, se introducen las macetas en bolsas de plstico y se mantienen
durante 48 horas mnimo, para as evitar la prdida de humedad y favorecer la recuperacin.
REACTIVOS

Kanamicina , 50 mg/mL

Disolver 50 mg de kanamicina en 1 mL de agua . Esterilizar mediante el paso a travs de un ltro
de 0,22 #m . Dispensar alcuotas de 100 #L en tubos de microcentrfuga de 1,5 mL estril y
almacenar hasta 3 meses a -20 C.

Medio LB con y sin 50 mg/mL de kanamicina y 50 mg/mL de rifampicina

Disolver lo siguiente en 1 litro de H2O :

5 g de extracto de levadura
10 g de Bacto - triptona
10 g de cloruro de sodio

Dispensar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave de 20 min a 15 psi en
ciclo lquido . Almacenar hasta 1 mes a temperatura ambiente o hasta 4 meses a 4 C. Si se
requieren antibiticos , antes del uso, aadir 50 #L de una solucin de 100 mg/mL de rifampicina y
100 #L de 50 mg/mL de kanamicina.

Placas de LB con y sin 50 mg/mL de kanamicina y 50 mg/mL de rifampicina

Disolver lo siguiente en 1 litro de H2O:

10 g de Bacto - triptona
10 g de polvo de cloruro de sodio
15 g de agar

Dispensar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer de 250 ml y autoclave de 20 min a 15 psi en
ciclo lquido . Enfriar el medio a 55 C en un bao de agua y , si es necesario , aadir 50 #L de
una solucin de 100 mg/mL de rifampicina y 100 #L de una soluicn de 50 mg/mL de kanamicina.
Dispensar 25 a 30 mL en placas petri desechables estriles de 15 $ 100 mm. Cuando el medio
haya solidicado, se pueden almacenar en una caja de plstico con tapa o envuelto con Paralm
hasta 6 semanas a 4 C.

La rifampicina , 100 mg/mL

Disolver 100 mg de rifampicina en 1 mL de metanol al 100% . Guarde las soluciones en tubos de
microcentrfuga bien cerrados, durante un mximo de 3 meses a -20 C.

Los antibiticos disueltos en metanol no necesitan ser esterilizados .

Medio SOB

Disolver lo siguiente con agitacin en 950 mL de H2O :

20 g de triptona
0,5 g de cloruro de sodio

Aadir 10 mL de una solucin de CaCl2 250 mM. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N . Ajustar el
volumen nal a 1 litro con agua. Esterilizar en autoclave 20 min a 15 psi . Dispensar 100 mL de
medio en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave de 20 min a 15 psi en ciclo lquido .

Se pueden almacenar hasta 1 mes a temperatura ambiente o hasta 4 meses a 4 C. Justo antes
del uso, aadir 0,5 mL de MgCl2 2 M estril a 100 mL de medio.

Medio SOC

Disolver lo siguiente con agitacin en 950 mL de H2O :

20 g de triptona
0,5 g de cloruro de sodio

Aadir 10 mL de CaCl2 250 mM . Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N . Ajustar el volumen nal a 1
litro con agua. Esterilizar en autoclave 20 min a 15 psi . Aadir 20 ml de solucin estril de glucosa
1 M . Dispensar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave de 20 min a 15
psi en ciclo lquido .

Se puede almacenar hasta 1 mes a temperatura ambiente o hasta 4 meses a 4 C. Justo antes del
uso, aadir 0,5 mL de MgCl2 2 M estril a 100 mL de medio.

YEP placas con y sin 50 mg/mL de kanamicina y 50 mg/mL de rifampicina

Disolver lo siguiente en 1 litro de H2O:

10 g de Bacto peptona
15 g de NaCl
15 g de polvo de agar

Dispensar 100 mL de medio en matraces Erlenmeyer de 250 mL y autoclave de 20 min a 15 psi en
ciclo lquido . Enfriar el medio a 55 C en un bao de agua y aadir 50 #l de rifampicina a una
concentracin de 100 mg/mL y 100 #L de kanamicina a una concentracin de 50 mg/mL.
Dispensar 25 a 30 mL en placas petri desechables estriles de 15 $ 100 mm. Cuando el medio
haya solidicado se pueden almacenar en una caja de plstico con tapa o envuelto con Paralm
hasta 6 semanas a 4 C.


BIBLIOGRAFIA

1. A guide to Agrobacterium binay Ti vectors. Trends in Plant Science Update. Elsevier
Science. October 2000, Vol 5. n 10
2. Current Protocols in Microbiology. R. Coico, T. Kowalik, J. Quarles, B. Stevenson and R.
Taylor. John Wiley & Sons. 2006
3. Current Protocols in Molecular Biology. F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D.
Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl. John Wiley & Sons. 2003
4. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Third Edition. J. Sambrook and D. W. Russell.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001
5. Transformacin Gentica de Solanum Tuberosum L. con el gen b32 mediante
Agrobacterium tumefaciens. E. Ceballos, I. Postigo, J. I. Ruiz de Galarreta y E. Ritter. Invest.
Agr. Prod. Prot. Veg. Vol. 12 (1, 2 y 3). 1997
6. http://www.news.iastate.edu/news/2011/apr/wurtele. Pgina web de la Universidad del
Estado de Iowa en donde se introduce la importancia del gen QQS en el aumento de la
expresin de protena en otros cultivos como la soja.
7. http://www.arabidopsis.org. Pgina web sobre la Arabidopsis thaliana

Trabajo Final de Biotecnologia PDF

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Originaltitel

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Trabajo Final de Biotecnologia PDF

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

PRODUCCIN DE PATATAS QUE EXPRESEN MS PROTEINA

Pgina de 1 26 MIGUEL NGEL CRESPN AGUILERA

1. Encender el bao termosttico y regular a 65 C.

3. Precalentar el buffer de extraccin (EB) en el bao a 65 C. Agregar 1 #L de BETA-

6. Incubar durante 10-15 min a 65 C en el bao termosttico.

7. Agregar 150 #L de acetato de potasio 5 M. Mezclar SUAVEMENTE invirtiendo el tubo varias

9. Con una micropipeta, extraer cuidadosamente el sobrenadante (que contiene el ADN en

Das könnte Ihnen auch gefallen