Agrobiotecnologa.

Curso 2013
Clase 2: Cultivo de tejidos vegetales
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
Transparencias 3-6
La teora de la totipotencialidad celular constituye el principio rector de las tcnicas de
cultivo de teidos vegetales. !nuncia la posibilidad de obtener una planta entera a
partir de cual"uier clula viva# bao condiciones controladas de cultivo. $esulta
re"uisito lograr la desdi%erenciaci&n previa de la clula inicial# induciendo la prdida de
las caractersticas de especiali'aci&n de dic(a clula (asta un estadio de
desdi%erenciaci&n )eriste)*tica. +osterior)ente se buscar* la re-di%erenciaci&n de
esta clula de partida# de )anera de lograr variadas respuestas )or%ogenticas tales
co)o la obtenci&n de callo# la regeneraci&n de brotes o pri)ordios de ra'# etc. +ara
pro)over estas posibles respuestas es necesario adicionar a los )edios sintticos de
cultivo reguladores del creci)iento# %unda)ental)ente au,inas y cito"uininas.
!l %isi&logo austriaco -aberlandt .1/020 %ue el pri)er investigador en intentar cultivar in
vitro clulas vegetales en un )edio sinttico de cultivo. 1tili'& un )edio "ue contena
)acro y )icronutrientes# asparagina# peptona y sacarosa. A pesar de "ue las clulas
sobrevivieron durante varios )eses# estas no proli%eraron. La %alla de su protocolo se
debi& probable)ente a la pobre co)posici&n del )edio de cultivo y al e)pleo de
clulas )uy di%erenciadas co)o )aterial vegetal de partida. 2ue $obbins .1/220 "uien
inici& el cultivo aislado de )eriste)as. 3esarroll& la tcnica de cultivo de *pices de
ra'. 4(ite .1/350 logr& el cultivo inde%inido de races in vitro. Con el descubri)iento
de las pri)eras (or)onas vegetales result& posible pro)over las desdi%erenciaci&n de
teidos vegetales y obtener variadas respuestas )or%ogenticas .4ent# 1/360.
!l cultivo in vitro de clulas y teidos vegetales i)plica el )anteni)iento de partes
aisladas del cuerpo de una planta bao condiciones controladas de asepsia# nutrientes#
lu' y te)peratura. !l cultivo de teidos es %recuente)ente utili'ado co)o siste)a
)odelo en el estudio de proble)as %isiol&gicos# bio"u)icos# genticos y estructurales
relativos a las plantas. !l uso co)ercial de estas tcnicas# la )icropropagaci&n
vegetal# posibilita la propagaci&n vegetativa a gran escala de especies de i)portancia
econ&)ica. !,isten ade)*s )uy variadas aplicaciones del cultivo de teidos vegetales
"ue utili'an di%erente )aterial vegetal de partida y condiciones particulares de cultivo.
Micropropagacin vegetal
Transparencias 6-/
!n las %otos puede observarse )aterial vegetal de di%erentes especies propagado in
vitro7 en los %rascos se observan pl*ntulas y )icrotubrculos de papa8 en la placa de
+etri crecen pl*ntulas de violeta a%ricana .Sainpaulia sp0 )ientras "ue en el tubo de
cultivo se enra'a un v*stago de clavel .Dianthus sp0.
Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas
Transparencias 10-22
!l cultivo de teidos vegetales no re"uiere de e"uipa)iento co)pleo ni de gran
in%raestructura. Las necesidades dependen de la escala de producci&n pretendida o de
la naturale'a del proyecto de investigaci&n en curso. 9e detalla la organi'aci&n b*sica
de un laboratorio de )icropropagaci&n vegetal.
+ara la propagaci&n clonal )asiva de plantas resulta de %unda)ental i)portancia la
preparaci&n y presanea)iento de las plantas )adres a partir de las cuales se to)ar*n
los e,plantos. La disecci&n de los e,plantos y los subcultivos sucesivos se reali'an
bao condiciones de esterilidad en un gabinete de %luo la)inar. Las plantas son
crecidas en una c*)ara de cultivo a apro,. 25 grados centgrados de te)peratura y un
%otoperodo de 16 (oras lu': ; (oras oscuridad. Los )edios sintticos y los recipientes
de cultivo .de vidrio resistente a altas te)peraturas0 son esterili'ados por autoclave.
Las plantitas clonales crecen en recipientes estriles# sellados con un %il) de
polietileno transparente "ue per)ite el interca)bio gaseoso.
1n )edio nutritivo consiste b*sica)ente en sales inorg*nicas# una %uente de carbono#
algunas vita)inas# reguladores del creci)iento y suple)entos org*nicos. 3e acuerdo
con el nivel de organi'aci&n y ta)a<o del )aterial vegetal en cultivo la co)posici&n
del )edio ser* )*s o )enos co)plea. !n el caso del cultivo de protoplastos o clulas
aisladas se re"uerir* )ayor cantidad de co)puestos org*nicos. Los (idratos de
carbono constituyen una %uente de energa y las vita)inas act=an co)o catali'adores
de reacciones en'i)*ticas.
La consistencia de los )edios de cultivo in vitro puede ser l"uida o se)is&lida. !n el
=lti)o de los casos se adiciona a la %or)ulaci&n salina y co)puestos org*nicos un
agente geli%icante inerte. !l )*s usado es el agar-agar. !ste es soluble en agua a
/0>C# per)anece %undido (asta los 50>C# te)peratura por debao de la cual solidi%ica
en la %or)a de un gel transparente# )*s o )enos s&lido dependiendo de la
concentraci&n.
Los )edios de cultivo se)is&lidos son envasados en recipientes de vidrio resistente al
calor y esterili'ados por autoclave. Los )edios l"uidos se alicuotan en recipientes
graduados .!rlen)eyers0. Los cultivos de esta )odalidad se )antienen en agitaci&n
constante en un agitador con control de te)peratura para asegurar la adecuada
in)ersi&n de los e,plantos .suspensiones de protoplastos o clulas vegetales0.
!l %il) de polietileno a)plia)ente utili'ado para el cierre de los recipientes de cultivo
posibilita el interca)bio gaseoso y resulta relativa)ente i)per)eable para el vapor de
agua previniendo# de esta %or)a# la desecaci&n de cultivos a largo pla'o. La
transparencia de este %il) resulta una ventaa e,tra en le caso de cultivos "ue
re"uieran lu'.
!l p- de los )edios de cultivo deter)ina la disponibilidad de los co)puestos
os)&ticos y regula un a)plio rango de reacciones bio"u)icas "ue tienen lugar en las
clulas vegetales en cultivo. 9ie)pre debe tenerse en cuenta la posible )odi%icaci&n
del valor de p- luego de la esterili'aci&n por autoclave de los )edios# debida a las
elevadas te)peraturas. ?tras causas de )odi%icaci&n del valor de p- son el tipo de
(idrato de carbono adicionado# el agente geli%icante .)arca o stoc@0 y el uso de carb&n
activado. !n la actualidad resulta posible conseguir en el )ercado %or)ulaciones de
)edios de cultivo con una )ayor capacidad bu%%er de )anera de prevenir estas
variaciones indeseadas del p-.
!,iste en la literatura una gran variedad de %or)ulaciones de )edios de cultivo. La
elecci&n de una u otra %or)ulaci&n depender* del obetivo y la aplicaci&n particular de
alguna de las tcnicas del cultivo de teidos y de la especie o tipo de planta. Los
re"ueri)ientos nutricionales b*sicos del )aterial vegetal cultivado son si)ilares a los
de una planta a ca)po. Las %or)ulaciones detalladas en la tabla son las )*s
di%undidas y usadas. Los )edios de 9c(en@ y -iledebrandt .9-0# el de Aa)borg .BC0
y el de Duras(ige and 9@oog .D90 presentan una alta concentraci&n de
)acronutrientes )ientras "ue los restantes contienen considerable)ente )enos
co)puestos inorg*nicos.
!l ter)ino (or)ona se reserva para los co)puestos naturales "ue act=an co)o
reguladores del creci)iento vegetal. Los co)puestos sintticos "ue cu)plen esta
%unci&n son deno)inados reguladores del creci)iento. !l suple)ento de au,inas y
cito"uininas resulta %unda)ental para la regulaci&n de la divisi&n celular# el
alarga)iento y la di%erenciaci&n de las clulas en cultivo y la %or)aci&n de &rganos de
novo u organognesis. !l )aneo de di%erentes concentraciones relativas de estos
reguladores del creci)iento deter)ina las respuestas organognicas. Las giberelinas
se utili'an %unda)ental)ente en el cultivo de )eriste)as y en estudios de
di%erenciaci&n vascular. Actual)ente se considera la i)portancia de otros reguladores
del creci)iento co)o el etileno .iniciaci&n de ye)as0 y el *cido abscsico.
Las au,inas se solubili'an en Ea?- 1 E# a e,cepci&n del 2#5-3 "ue es soluble en
etanol o en di)etilsul%&,ido .3D9?0. !ste solvente debe ser )anipulado con
precauci&n ya "ue puede penetrar la piel y tiene e%ectos t&,icos.
!l AFA# au,ina natural# es %otosensible y se degrada por o,idaci&n en'i)*tica por lo
"ue se la adiciona a los )edios de cultivo en concentraciones relativa)ente elevadas
.1-30 )g:L0. Los restantes co)puestos au,nicos se utili'an# en tr)inos generales#
en un rango de concentraciones de entre 0#1 y 2 )g:L.
Las cito"uininas )*s usadas en cultivo de teidos son "uinetina# ben'iladenina y
'eatina. 9e las adiciona en relativa)ente baas del orden de 0#1 a 1 )g:L. 9on
solubles en -Cl 1 E. 1n co)puesto sinttico de )arcada acci&n cito"uinnica es el
t(idia'ur&n .T3G0# se trata de una %enilurea sustituida. !l agua de coco puede utili'arse
co)o %uente natural de cito"uininas concentraciones en una diluci&n en el )edio
sinttico de cultivo de 10-1CH .v:v0.
Las giberelinas al igual "ue el *cido abscsico son reguladores del creci)iento
ocasional)ente usadas en cultivo de teidos. Aeneral)ente el AA3 se utili'a para
pro)over el creci)iento de cultivos celulares de baa densidad# para %avorecer el
creci)iento de callos y para elongar los entrenudos de pl*ntulas o v*stagos in vitro.
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
Transparencias 23-26
+rincipales consideraciones y obetivos de cada una de las etapas detalladas7
!tapa 17 9eleccionar co)o planta )adre un individuo "ue re=na las caractersticas
varietales deseadas# "ue se encuentre en adecuado estado %itosanitario y "ue (aya
sido pre-tratada con%or)e a un progra)a de %ertili'aci&n y aplicaci&n de pesticidas.
Austar un protocolo de desin%ecci&n "ue per)ita obtener un gran porcentae de
e,plantos libres de conta)inantes super%iciales y end&genos.
!tapa 27 obtenci&n de ye)as y: o e)brioides y en su )ultiplicaci&n por repi"ues o
subcultivos sucesivos .cada 20-2C das0 a )edio %resco. !sta etapa deter)ina la
disponibilidad y a)pliaci&n del stoc@ co)ercial de plantas clonales. !l )aterial vegetal
puede )ultiplicarse y )antenerse bao condiciones de cultivo in vitro durante un
tie)po prolongado. $esulta de %unda)ental i)portancia el renovar el stoc@
introduciendo per)anente)ente )aterial vegetal %resco .nuevos e,plantos0 de )anera
de evitar la prdida de la e%iciencia y:o tasa de )ultiplicaci&n debida a la senescencia
de los e,plantos.
!tapa 37 trans%erencia de los brotes o ye)as obtenidos y a)pli%icados en la etapa
previa a un )edio de cultivo "ue pro)ueva la di%erenciaci&n de races adventicias para
la obtenci&n de plantas ntegras capaces de sobrevivir bao condiciones de cultivo en
tierra.
!tapa 57 trans%erencia de las plantitas clonales a tierra o sustrato )e'cla en )aceta o
terrinas bao condiciones controladas# en un invern*culo.
!lecci&n del e,planto7 cual"uier teido u &rgano vegetal puede ser usado co)o
e,planto iniciador del cultivo in vitro. !l grado de ,ito depender* del siste)a de
cultivo utili'ado# de la especie vegetal en cuesti&n y de la adecuada desin%ecci&n
super%icial inicial del )aterial vegetal. !l pri)er obetivo de la etapa F consiste en
obtener un gran porcentae de e,plantos libres de pat&genos super%iciales. Los
e,plantos )*s utili'ados para iniciar la propagaci&n clonal in vitro de una planta son
las ye)as apicales del v*stago# estacas uninodales portando ye)as a,ilares# discos
de (oa# secciones de ra' y )eriste)as.
Co)o paso preli)inar al uso de soluciones desin%ectantes resulta en )uc(os casos
ventaoso lavar el )aterial vegetal bao agua corriente .entre 30 )inutos (asta 2
(oras0 de )anera de reducir la posible carga de conta)inantes "ue portan los
e,plantos. !sto resulta particular)ente aconseable cuando se trata de e,plantos
pubescentes# &rganos de reserva .tubrculos# bulbos0 o races. !ste lavado puede ser
precedido por el uso de una soluci&n abonosa. ?tros desin%ectantes de a)plio uso en
cultivo de teidos vegetales son el per&,ido de (idr&geno y el nitrato de plata. La
elecci&n del orden de diluci&n del desin%ectante as co)o el tie)po de e,posici&n del
)aterial vegetal a dic(a soluci&n depender* del tipo de e,planto y de su estado
%itosanitario de partida .por ee)plo si se trata de )aterial "ue viene de ca)po o de
cultivo controlado bao invern*culo# etc.0. 1na ve' austadas estas variables de lograr*
La esterili'aci&n super%icial del )aterial a establecer in vitro. !n el caso de
conta)inaciones bacterianas end&genas resultar* necesario el uso de antibi&ticos
adicionados al )edio de cultivo.
1na ve' establecido el cultivo in vitro pueden esperarse di%erentes respuestas "ue van
desde la )uerte del e,planto por la utili'aci&n de un )edio de cultivo inadecuado8 la
conta)inaci&n del )aterial por sobre-creci)iento de alg=n )icroorganis)o end&geno
o por un de%iciente trata)iento de desin%ecci&n super%icial8 la regeneraci&n indirecta a
partir de la %or)aci&n de callo por proli%eraci&n de las clulas desdi%erenciadas#
resultado de sucesivas )itosis o# por =lti)o# la aparici&n de brotes o e)briones
so)*ticos directa)ente a partir del e,planto inicial sin previa %or)aci&n de callo. La
regeneraci&n de brotes# ye)as# pri)ordios de ra' o e)briones so)*ticos estar*
deter)inada %unda)ental)ente por el balance de reguladores del creci)iento
adicionados al )edio sinttico de cultivo.
Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis
Transparencias 2;-31
La deter)inaci&n de cual"uiera de estas dos vas )or%ogenticas7 la organognesis y
la e)briognesis so)*tica# no est* a=n clara)ente esclarecida. $esulta evidente "ue
se encuentran involucrados di%erentes %actores7 la edad del la planta )adre dadora de
e,plantos# el tipo de e,planto# el )edio de cultivo# los reguladores del creci)iento y las
condiciones arti%iciales de cultivo.
La pri)era respuesta estudiada in vitro %ue la organognesis en callos de tabaco. A
partir de estos estudios iniciales pudo conocerse "ue esta va est* "u)ica)ente
regulada. 1n balance relativa)ente alto de au,inas7cito"uininas induce la %or)aci&n
de races adventicias )ientras "ue una relaci&n baa .)enor a 10 de los )is)os
co)puestos %avorece la producci&n de brotes. Ade)*s de la relaci&n au,ina 7
cito"uinina# nu)erosos reportes indican "ue otros %actores est*n ta)bin involucrados
en la va organognica7 entre ellos otros reguladores del creci)iento tales co)o las
giberelinas ."ue supri)en la iniciaci&n de brotes o races0 y el etileno end&geno ."ue
blo"uea la iniciaci&n de la organognesis pero pro)ueve el creci)iento y
di%erenciaci&n de los pri)ordios de ye)as o races pree,istentes0.
+or otro lado# los )*s i)portantes %actores "u)icos involucrados en la va
e)briognica son las au,inas y los co)puestos nitrogenados reducidos .E-
5
Cl# urea#
*cido glut*)ico# gluta)ina0. !l suple)ento de los )edios de cultivo con carb&n
activado pro)ueve# en algunos casos# la e)briognesis al igual "ue el uso de
polia)inas end&genas .putrescina# esper)idina0. !n tr)inos generales se re"uieren
dos )edios de cultivo di%erentes para pro)over la e)briognesis so)*tica7 un )edio
de iniciaci&n de las clulas e)briognicas# conteniendo au,inas .2#5-30 y un segundo
)edio para la di%erenciaci&n de los e)brioides# sin agregado de au,inas o con un nivel
reducido de este tipo de co)puesto .no 2#5-30.
?rganognesis en Lotus tenuis7 di%erenciaci&n de ye)as a partir de (ipoc&tilos. 9e
observa el pri)ordio de una ye)a .d7 do)o )eriste)*tico# p7 pri)er par de pri)ordios
%oliares0. 9e observa la cone,i&n vascular de la ye)a con los restos del e,planto
original y la continuidad anat&)ica entre el e,planto y la neo%or)aci&n. 2oto de
e)bri&n so)*tico de Lotus tenuis7 se observa un e)bri&n en el estadio torpedo de
di%erenciaci&n. Eo e,iste cone,i&n entre el e)bri&n y las clulas paren"ui)*ticas "ue
%or)an parte del e,planto inicial.
istemas de micropropagacin vegetal: proliferacin de yemas a!ilares o
apicales
Transparencias 32-33
!l desarrollo de ye)as a,ilares y apicales puede ser pro)ovido in vitro por activaci&n
de )eriste)as "uiescentes. 1n e,planto "ue contiene una ye)a =nica puede# de
acuerdo con las condiciones nutricionales y (or)onales del )edio de cultivo y con la
especie en cuesti&n# desarrollar un s&lo brote o producir )=ltiples v*stagos. A )edida
"ue estos nuevos v*stagos crecen# van surgiendo nuevos )eriste)as a lo largo de su
ee# los "ue# a travs de repetidos subcultivos# dar*n lugar a )=ltiples brotes. La
proli%eraci&n de ye)as pree,istentes se %avorece adicionando cito"uininas en
concentraciones de entre 1-30 )g:L a los )edios sintticos de cultivo. La gran )ayora
de las especies vegetales puede ser propagada clonal)ente con ,ito por este
siste)a de )icropropagaci&n. !l )ayor potencial de este procedi)iento alcan'a a las
plantas le<osas en las cuales la e)briognesis so)*tica y la proli%eraci&n adventicia
de brotes no resultan ventaosas.
istemas de micropropagacin vegetal: proliferacin de tejidos
desdiferenciados
Transparencias 35-36
La proli%eraci&n adventicia de brotes y la %or)aci&n de callos a partir de los e,plantos
pueden deter)inar la prdida del potencial )or%ogentico de los cultivos o incre)entar
la variabilidad gentica. !,isten al )enos tres posibles e,plicaciones "ue e,plican esta
prdida de potencialidad7 a0 prdida de los centros )eriste)*ticos debido a "ue estos
son esti)ulados para producir brotes di%erenciados8 b0 variaci&n en los niveles
end&genos de reguladores del creci)iento "ue no pueden ser ree)pla'ados
e,&gena)ente y c0 acu)ulaci&n de anor)alidades cro)os&)icas tales co)o ca)bios
en el nivel de ploida o rearreglos de los cro)oso)as.
La transparencia 3C presenta de )anera es"ue)*tica las vas directa e indirecta de
regeneraci&n de brotes in vitro. +artiendo de di%erentes e,plantos iniciales .disco de
(oa# suspensi&n celular# )eriste)a# estaca uninodal# entre otros0# es posible
pro)over una u otra va en %unci&n de la co)posici&n del )edio de cultivo# el balance
de reguladores# las condiciones %sicas del cultivo y la especie en cuesti&n. La va
indirecta presupone la desdi%erenciaci&n total del e,planto# seguida de sucesivas
divisiones )it&ticas desordenadas "ue dan lugar a la proli%eraci&n de una )asa
a)or%a de clulas indi%erenciadas deno)inada callo. La regeneraci&n directa i)plica la
aparici&n de estructuras de novo# ya se trate de pri)ordios de ye)as o races
adventicias# a partir de clulas individuales o grupos de clulas parcial)ente
desdi%erenciados en el e,planto. Eo e,iste en este caso proli%eraci&n )asiva de
clulas desdi%erenciadas con potencialidad )eriste)*tica.
Las i)*genes contenidas en la transparencia 36 ilustran di%erentes etapas y siste)as
de )icropropagaci&n de plantas de inters co)ercial. La %oto superior i'"uierda
)uestra v*stagos de or"udea co)pletando su enrai'a)iento in vitro listos para su
rusticaci&n o pasae a )aceta. La %oto superior derec(a )uestra el procedi)iento
utili'ado para la )ultiplicaci&n de )aterial clonal de @iIi a travs del subcultivo de
estacas de uno o dos nudos. La %oto in%erior i'"uierda )uestra )=ltiples ye)as de
to)ate creciendo de )anera indirecta a partir de callos. La %oto in%erior derec(a
)uestra v*stagos de ooba en la etapa de enrai'a)iento.
istemas de micropropagacin vegetal: cultivo de meristemas
Transparencias 3;-50
!l cultivo de )eriste)as representa una )etodologa para el sanea)iento in vitro de
plantas in%ectadas. 9u)ados a la disecci&n y estableci)iento in vitro de los
)eriste)as .e,plantos0 de la planta )adre in%ectada resulta aconseable e)plear otros
trata)ientos7 la ter)oterapia y la "ui)ioterapia. !stos tres di%erentes procedi)ientos
pueden usarse por separado# pero incre)entan notable)ente su e%ectividad cuando
se los co)bina# trabaando in vivo e in vitro.
Los principales proble)as %itosanitarios se deben a la presencia de pat&genos cuya
eli)inaci&n# a travs del uso de antibi&ticos y %ungicidas# no resulta e%iciente. !s
conocido "ue no e,isten trata)ientos para eli)inar las en%er)edades de origen viral.
+or esto# resulta necesario co)ple)entar las tcnicas antes )encionadas. !l cultivo
de )eriste)as para el sanea)iento de plantas in%ectadas resulta alta)ente e%iciente
en el caso de plantas "ue se propagan vegetativa)ente. !n la )ayora de los casos la
reproducci&n se,ual constituye una barrera para la trans)isi&n de virus y bacterias.
!,isten e,cepciones .virus J del to)ate# a travs de las se)illas0

"iberacin de patgenos
Transparencias 51-CC
La ausencia de conta)inantes es un prerre"uisito "ue asegura el adecuado
creci)iento y alta productividad de las especies vegetales de inters co)ercial. La
propagaci&n clonal o )asiva de plantas puede constituir un )edio para la
dise)inaci&n de conta)inantes end&genos entre las plantas cultivadas. !,iste una
serie de consideraciones pr*cticas "ue )ini)i'an la posibilidad de conta)inaci&n del
)aterial vegetal bao cultivo in vitro. !ntre stas se incluyen la detecci&n te)prana y
adecuada caracteri'aci&n o identi%icaci&n de los posibles pat&genos# la cuidadosa
desin%ecci&n super%icial del )aterial vegetal y del instru)ental re"uerido para su
)anipulaci&n# la selecci&n de los e,plantos y el uso de agentes anti)icrobianos in vivo
o in vitro. !stos procedi)ientos y recaudos deber*n ser particular)ente considerados
para la preparaci&n y selecci&n de plantas )adres iniciadoras del stock co)ercial de
plantas )icropropagadas. !s de a)plia)ente conocido el (ec(o de "ue los
)eriste)as vegetales est*n libres de conta)inantes end&genos "ue a%ectan el resto
del cuerpo de una planta. !l cultivo de )eriste)as in vitro per)ite# en gran cantidad de
casos# el estableci)iento de cultivos libres de pat&genos. 1na ve' con%ir)ada la
sanidad de las plantas bao cultivo# resulta indispensable )onitorear regular)ente esta
condici&n.
Los principales proble)as %itosanitarios se deben a la presencia de pat&genos cuya
eli)inaci&n a travs del si)ple uso de co)puestos anti)icrobianos no resulta
e%iciente. Cuando se detecta la presencia de pat&genos o conta)inantes en el )aterial
vegetal propagado# resulta indispensable establecer una estrategia de sanea)iento
"ue conte)ple el trata)iento )*s adecuado o la su)a de varios trata)ientos. La
caracteri'aci&n preli)inar del tipo de )icroorganis)o resulta esencial para la
selecci&n adecuada del procedi)iento a seguir. !n el caso de la presencia de
bacterias u (ongos# deber* intentarse el aisla)iento de estos )icroorganis)os en
cultivos puros y deter)inar su sensibilidad a antibi&ticos o %ungicidas siguiendo
protocolos conocidos. !l antibi&tico y:o %ungicida seleccionado deber* ser agregado a
los )edios de cultivo o bien aplicado in vivo a la planta )adre# a partir de la cual se
aislar*n e,plantos o )eriste)as para iniciar el cultivo bao condiciones controladas in
vitro. !n el caso de la presencia de virus y viroides# el trata)iento con calor
.ter)oterapia0# aco)pa<ado del uso de agentes antivirales no espec%icos y de baa
%itoto,icidad co)o la ribavirina# resulta indispensable. La ribavirina presenta actividad
contra los virus de A$Esc# los "ue representan a la gran )ayora de virus
%itopatognicos. Ta)bin se (a reportado su acci&n in(ibitoria %rente a di%erentes
viroides. La e%iciencia de las )etodologas de sanea)iento )encionadas se
incre)enta notable)ente cuando los di%erentes trata)ientos se utili'an en %or)a
co)binada.
La ter)oterapia i)plica el trata)iento con altas o baas te)peraturas de plantas
in%ectadas con virus y:o viroides. La adecuada caracteri'aci&n del pat&geno presente
%acilitar* la elecci&n y auste del protocolo a seguir. La e%ectividad del trata)iento por
ter)oterapia depender* tanto del rango de te)peraturas seleccionado co)o del
tie)po o ciclos de e,posici&n de la planta conta)inada a las condiciones y
te)peraturas seleccionadas. $esulta %unda)ental )ini)i'ar el posible da<o
irreversible a la planta bao trata)iento. 1na ve' aplicado el protocolo y )onitoreada la
calidad %itosanitaria de la planta tratada# se proceder* a la disecci&n de los )eriste)as
co)o e,plantos iniciadores del cultivo in vitro.
!l trata)iento por "ui)ioterapia de plantas in%ectadas por di%erentes pat&genos resulta
una pr*ctica )uy di%undida# no s&lo bao condiciones de laboratorio e invern*culo# sino
incluso a ca)po. La e%ectividad de la aplicaci&n e,&gena de sustancias con probada
actividad anti)icrobiana# de alta especi%icidad o de a)plio espectro# depender* de la
adecuada identi%icaci&n del pat&geno# del uso de una dosis adecuada y del correcto
)aneo de la planta bao trata)iento. La aplicaci&n de los di%erentes agentes tales
co)o antibi&ticos# insecticidas# agentes antivirales# podr* reali'arse sobre la planta
)adre# bao condiciones de invern*culo o a ca)po# o bien durante el cultivo in vitro del
)aterial vegetal in%ectado# adicionando los )encionados co)puestos a los )edios
sintticos de cultivo. Cabe considerar "ue el uso repetido o a largo pla'o de un
co)puesto antibi&tico# insecticida o anti%=ngico puede desarrollar respuestas de
resistencia o tolerancia por parte del pat&geno a controlar.
La e%ectividad de la )etodologa de sanea)iento aplicada debe ser con%ir)ada a
travs del )onitoreo del estado sanitario de las plantas tratadas. !sta evaluaci&n
%itosanitaria puede llevarse a cabo por di%erentes )todos# dependiendo del tipo de
pat&geno a )onitorear# de la locali'aci&n del conta)inante dentro de la planta a
anali'ar# del tipo de snto)as "ue desarrolla el pat&geno# as co)o del tie)po y
recursos de "ue se disponga. !n el caso de bacterias end&genas# se proceder* a
cultivar di%erentes e,plantos de la planta tratada bao condiciones y )edios de cultivo
"ue propicien la proli%eraci&n del pat&geno con el %in de deter)inar su presencia. La
)icroscopa &ptica y electr&nica de trans)isi&n constituyen (erra)ientas valiosas para
la detecci&n de la presencia de )icroorganis)os intracelulares o de a"uellos "ue
coloni'an el espacio apopl*stico. !n el caso de (ongos# bacterias y virus "ue
desarrollan snto)as caractersticos en la planta bao cultivo# resulta v*lido conservar
plantas bao condiciones de invern*culo para )onitorear la aparici&n de los )is)os.
La posibilidad de usar plantas indicadoras co)o )todo de evaluaci&n sanitaria
depender* del siste)a (usped-pat&geno en cuesti&n. 3eber* contarse ade)*s con
individuos de una planta indicadora "ue sea alta)ente sensible y )ani%ieste snto)as
caractersticos de la presencia del pat&geno.
Duc(as en%er)edades de origen viral# bacteriano o %=ngico presentan snto)as
distintivos "ue pueden ser %*cil)ente reconocidos por el observador. La presencia de
dic(os snto)as constituye evidencia de la presencia de un pat&geno en particular.
3ebe aclararse "ue en algunos casos inter%iere la subetividad del observador# lo "ue
puede dar lugar a diagn&sticos err&neos. La aparici&n se snto)as y el aspecto de
stos puede variar con las condiciones )edioa)bientales y con la %enologa de la
planta. +or ello# resulta aconseable )antener las plantas a evaluar en invern*culo
bao condiciones controladas durante todo el )onitoreo.
Duc(as en%er)edades de origen viral# co)o el )osaico causado por el Tomato
mosaic virus# presentan snto)as distintivos# tales co)o )anc(as clor&ticas regulares
a nivel del %ollae y la epider)is de los %rutos )aduros. Erwinia carotovora es una
bacteria gra)-negativa "ue ataca a nu)erosas especies vegetales de i)portancia
co)ercial# entre ellas Solanum tuberosum. !ste pat&geno desarrolla di%erentes
snto)as de acuerdo con el &rgano vegetal "ue in%ecte. !n los v*stagos o tallos de
una planta de S. tuberosum in%ectada# se produce el deno)inado Kpie negroL. !sta
en%er)edad puede desarrollarse en cual"uier edad de la planta. Los tallos de una
planta in%ectada presentan el cuello o base .porci&n co)prendida entre el v*stago y la
ra'0 de color negro intenso. Al cabo de unos das se evidencia una )arcada clorosis
en las (oas seguida de la )arc(ite' de los tallos. Los teidos de conducci&n a nivel del
v*stago se ven ta)bin a%ectados# deter)inando %inal)ente la )uerte de la planta.
Los tubrculos de S. tuberosum in%ectados con Erwinia carotovora desarrollan la
deno)inada Kpodredu)bre blandaL. !sta en%er)edad puede )ani%estarse durante el
al)acena)iento de los tubrculos o en el suelo. Los snto)as distintivos incluyen la
)aceraci&n del parn"ui)a de reserva con la o,idaci&n de la porci&n peri%rica de la
lesi&n.
La gran )ayora de las en%er)edades causadas por (ongos presentan snto)as )uy
conspicuos y caractersticos. 1no los ee)plos incluidos en la transparencia C0 es la
antracnosis en Fragaria spp. producida por Colletotrichium fragariae, la %or)a ase,ual
de un (ongo asco)ycete. Las )ani%estaciones de la antracnosis en Fragaria consisten
en la aparici&n de lesiones necr&ticas en estolones y pecolos. !stas lesiones van
au)entando de ta)a<o (asta involucrar a todo el &rgano. +ueden aparecer ta)bin
lesiones %ir)es# redondeadas y ligera)ente depri)idas en la super%icie de los %rutos
)aduros. !stas *reas necr&ticas van incre)entando su ta)a<o (asta cubrir todo el
%ruto "ue ter)ina por secarse )o)i%ic*ndose. !l otro ee)plo "ue se presenta en la
transparencia C0# el owder! "ildew# es una en%er)edad "ue ataca el %ollae de
di%erentes especies vegetales y es causada por (ongos del gnero Er!siphe .%or)a
ase,ual de un asco)ycete0. !n etapas te)pranas de la in%ecci&n# se observan en
a)bas caras de la l*)ina de las (oas dep&sitos pulvurulentos blan"uecinos debidos a
la esporulaci&n del (ongo. !n etapas )*s avan'adas de la en%er)edad# se evidencian
*reas necr&ticas en las (oas. 2inal)ente se produce la abscisi&n de estos &rganos.
Los ne)*todos %itopat&genos son organis)os pe"ue<os observables al )icroscopio.
+resentan %or)a alargada# el cuerpo liso# no seg)entado y carecen de patas u otros
apndices. 9u ciclo de vida incluye cuatro etapas larvarias y se co)pleta en 3 & 5
se)anas. La )ayora de las especies de ne)*todos %itopat&genos vive libre)ente en
el suelo# ali)ent*ndose de las races y tallos subterr*neos de las plantas susceptibles.
La te)peratura# (u)edad y aireaci&n a%ectan a la supervivencia y a la )ovilidad de
estos organis)os en el suelo. La )ayor concentraci&n de ne)atodos en la regi&n
radical de la planta (ospedera se debe principal)ente a "ue es all donde encuentran
una )ayor disponibilidad de ali)ento# lo "ue %avorece su reproducci&n y creci)iento#
ade)*s del e%ecto de atracci&n "ue eercen sobre ellos deter)inadas sustancias
liberadas por la planta. Los ne)*todos se distribuyen con gran %acilidad a travs del
e"uipo agrcola# el siste)a de riego# las inundaciones# las patas de los ani)ales# los
productos agrcolas y las plantas provenientes de viveros. Ade)*s# su dispersi&n se
incre)enta cuando los &rganos de plantas in%ectadas entran en contacto con los de
plantas sanas. Al ali)entarse# los ne)*todos penetran en el espacio apopl*stico#
per%oran las paredes celulares# inyectan secreciones en las clulas y succionan parte
de sus contenidos. Los da<os provocados en los teidos de la ra' dis)inuyen su
capacidad de absorci&n# por lo "ue se desarrollan snto)as de de%iciencia de agua y
nutrientes en los &rganos areos de la planta. 2inal)ente# las lesiones producidas
constituyen puntos de entrada para otros pat&genos.
La )ayora de los snto)as producidos por los virus se ase)ean a los ocasionados
por insectos u otros pat&genos# o a los de ciertas de%iciencias nutricionales. La
deter)inaci&n certera de "ue deter)inados snto)as se deben a la presencia de un
virus incluye la e,clusi&n de otros posibles agentes causales de en%er)edad y la
trans)isi&n de virus a partir de plantas en%er)as. !ntre los )todos "ue se utili'an
para detectar virus %itopat&genos# se incluye la trans)isi&n del virus de una planta
en%er)a a una sana# ya sea por inerto# %rotaci&n o inyecci&n de e,tractos.
-ist&rica)ente# se (an utili'ado otros )todos de trans)isi&n co)o insectos vectores
o plantas par*sitas .co)o la cuscuta0. La prueba de%initiva de la presencia de un virus
en una planta la proporciona su puri%icaci&n# su observaci&n en el )icroscopio
electr&nico y las pruebas serol&gicas o )oleculares.
Cuando una protena de un virus o cual"uier otra protena e,tra<a .antgeno0 se
inyecta en un )a)%ero o en un ave# induce la %or)aci&n de anticuerpos en el suero
sanguneo# los cuales reaccionan espec%ica)ente con el antgeno inyectado. !l virus
y su anticuerpo se acoplan en varias %or)as siendo la )*s co)=n la reacci&n de la
precipitina. !n esta reacci&n# los anticuerpos y antgenos se )e'clan en soluci&n# se
acoplan en la inter%ase entre las dos soluciones separadas .prueba de la inter%ase0 o
bien se di%unden a travs de un gel y se precipitan en una 'ona en condiciones
apropiadas .prueba de ?uc(terlony0. !n ocasiones# el antgeno es adsorbido sobre la
super%icie de partculas grandes y stas se precipitan al a<adir los anticuerpos
.reacci&n de aglutinaci&n0. !n todas estas pruebas# la reacci&n puede observarse
co)o una precipitaci&n en un tubo de ensayo o la %or)aci&n de una banda en una
inter%ase.
La observaci&n directa de los posibles pat&genos en el espacio intra- o e,tracelular
resulta posible con el uso de la )icroscopa electr&nica. 9in e)bargo# a=n con este
instru)ento# las partculas virales no sie)pre son %*ciles de detectar. Los virus
%itopat&genos presentan di%erentes )or%ologas# co)o varillas# bacilos# %ila)entos#
es%eras# %or)as isodia)tricas e incluso polidricas. 9u ta)a<o ta)bin es variado#
desde 10 n) por 2000 n) .Triste#a mosaic virus0 a 16-60 n) de di*)etro .di%erentes
virus es%ricos o polidricos0.
Conservacin de germoplasma
Transparencias C6-63
La conservaci&n de la biodiversidad constituye un obetivo prioritario en un escenario
en "ue las relaciones entre el desarrollo tecnol&gico y la conservaci&n del a)biente
ocupan creciente)ente el debate p=blico. !n particular# la conservaci&n de los
recursos %itogenticos de inters para la agricultura es un %actor a)plia)ente
reconocido para contribuir al desarrollo sostenible de la )is)a y a la conservaci&n de
los recursos naturales. 1no de los ventaas )*s destacables del cultivo de teidos in
vitro es su posibilidad de propagar a gran escala cual"uier )aterial vegetal con )ni)o
riesgo de introducir o reintroducir pat&genos y con alto grado de estabilidad genotpica.
+or esta ra'&n# (an encontrado sus aplicaciones en la conservaci&n e interca)bio de
recursos %itogenticos se (a incre)entado acelerada)ente.
Tradicional)ente# la conservaci&n de recursos %itogenticos se (a basado en dos
)etodologas7 e$ situ e in situ. La conservaci&n e$ situ incluye al cultivo de clulas y:o
teidos vegetales .bancos de ger)oplas)a in vitro0. Los )todos de conservaci&n in
situ conte)plan la preservaci&n de las especies de inters en su (*bitat natural. La
criopreservaci&n consiste en la conservaci&n a te)peraturas ultra baas .-1/6MC0 en un
)edio criognico co)o el nitr&geno l"uido. 3urante las =lti)as dcadas se (a
avan'ado )uc(o en el estudio de la respuesta del )aterial vegetal a baas
te)peraturas. Co)o parte de ello# se (an estudiado los procesos %isiol&gicos y
bio"u)icos involucrados en la criopreservaci&n y se (an investigado las condiciones
"ue posibilitan la preservaci&n de la viabilidad del )aterial vegetal al)acenado por
este )todo.
Los bancos de ger)oplas)a in vitro posibilitan el )anteni)iento a largo pla'o de
)aterial vegetal en )edios sintticos de cultivo# bao condiciones controladas de lu'#
%otoperodo y te)peratura. !l )aneo de este )aterial no di%iere de)asiado de los
procedi)ientos generales utili'ados para la )icropropagaci&n vegetal. Ciertas
variables# tales co)o la concentraci&n de los co)puestos os)&tica)ente activos# la
concentraci&n del agente geli%icante inerte# la te)peratura de cultivo y la lu'# son
austadas de )anera de deter)inar una dis)inuci&n de la tasa )etab&lica del )aterial
vegetal. 3e esta )anera# se logra )ini)i'ar la )anipulaci&n y espaciar los
subcultivos# lo "ue contribuye al descenso de los costos de )anteni)iento. 1na
pr*ctica general consiste en dis)inuir la intensidad lu)nica y reducir la te)peratura.
Bao estas condiciones restrictivas .por ee)plo# en oscuridad y a 5MC0# es posible
conservar pl*ntulas de Fragaria $ ananassa .%rutillas o %resas0 durante a<os# con el
agregado espor*dico de gotas de )edio de cultivo %resco al )aterial en conservaci&n.
Las condiciones est*ndar de cultivo in vitro s&lo pueden utili'arse para conservaci&n a
)ediano pla'o de especies de creci)iento lento# co)o por ee)plo Coffea arabiga.
Las pl*ntulas de ca% )icropropagadas pueden ser conservadas en un )edio de
cultivo est*ndar a 26MC# sin necesidad de ser repicadas o subcultivadas
peri&dica)ente a )edio %resco# durante un a<o.
!ntre los )todos )*s conocidos de conservaci&n de recursos %ilogenticos e$ situ
se encuentran los bancos de se)illas. 1na gran proporci&n de especies vegetales de
i)portancia agron&)ica produce se)illas "ue pueden ser des(idratadas (asta un bao
contenido de agua de )anera de poder ser conservadas a baa te)peratura. !n este
siste)a de conservaci&n e,iste una situaci&n de co)pro)iso entre di%erentes %actores#
co)o el contenido de agua# la te)peratura# la longevidad de la se)illa y la
supervivencia del e)bri&n latente. !ste siste)a presenta i)portantes restricciones
para grupos de especies de inters co)ercial "ue no producen se)illas y se propagan
vegetativa)ente ."usa spp.0# "ue se propagan por tubrculos# ri'o)as o estolones
.Solanum tuberosum# Saccharum spp.0# cuya se)illa bot*nica presenta alta
variabilidad genotpica o "ue producen se)illas recalcitrantes .se)illas "ue no toleran
la des(idrataci&n ni la conservaci&n a baa te)peratura0. !ste =lti)o es el caso de
)uc(as plantas tropicales "ue producen se)illas de gran porte con alto contenido de
endosper)a l"uido .Cocos nucifera# ersea americana0.

!l pri)er reporte sobre el )anteni)iento en nitr&geno l"uido de &rganos o teidos
vegetales data de 1/6;. !n esta oportunidad# Nuatrano logr& preservar clulas de
Linum usitatissimum por esta tcnica# con el inters agregado de conservar di%erentes
genotipos. La )etodologa publicada en a"uella oportunidad no di%era del
procedi)iento ya conocido y puesto en pr*ctica para la conservaci&n de otros
)ateriales biol&gicos .se)en y teidos ov*ricos de vacunos0. !l procedi)iento
co)prenda el uso de sustancias crioprotectoras# el en%ria)iento y des(idrataci&n
lentas de la )uestra vegetal# el al)acena)iento en nitr&geno l"uido# y sucesivos
pasos de descongela)iento# lavado y recuperaci&n. !n la actualidad# se (a producido
una gran diversi%icaci&n de las tcnicas de crioconservaci&n. Las di%erentes opciones
)etodol&gicas dependen del tipo de )uestra biol&gica as co)o de las %acilidades e
in%raestructura disponibles.
Los pasos incluidos en la tcnica de criopreservaci&n pueden variar seg=n el tipo de
)aterial a conservar. Las sustancias crioprotectoras usadas e,itosa)ente en el caso
de teidos u &rganos vegetales pueden resultar t&,icas o inadecuadas para la
preservaci&n de otros tipos de e,plantos tales co)o suspensiones celulares o
protoplastos. !l congela)iento puede llevarse a cabo de %or)a lenta# gradual o de
)anera r*pida. La elecci&n de una u otra va depender* del tipo de )uestra. !n todos
los casos# se trata de evitar la %or)aci&n de cristales de agua intracelulares "ue
pudieran destruir las clulas y da<ar las )uestras a conservar. Eu)erosos estudios
(an de)ostrado "ue la tasa de congela)iento &pti)a para asegurar una elevada
supervivencia del )aterial conservado oscila entre O1MC a O2MC por )inuto. La edad
de las clulas vegetales en el )o)ento de su congela)iento constituye un %actor
i)portante "ue deter)ina su supervivencia. !sta condici&n se relaciona directa)ente
con el ta)a<o y contenido de agua celulares. !n el protocolo pueden introducirse
)odi%icaciones "ue incluyan la adici&n de co)puestos os)&tica)ente activos .)anitol#
sorbitol0 durante el precultivo del )aterial a conservar# de )anera de reducir el ta)a<o
celular y au)entar su tolerancia al congela)iento.
!l )aterial vegetal a conservar deber* ser preparado y preacondicionado con
sustancias crioprotectoras. !stas sustancias )ini)i'an el posible da<o a "ue est*n
e,puestos las clulas y teidos durante los pasos de en%ria)iento y congela)iento. La
elecci&n de los )edios crioprotectores depender* del tipo de )aterial a congelar.
Cuanto )enor sea el nivel de organi'aci&n del )aterial a preservar# )ayores deber*n
ser los recaudos "ue deber*n to)arse. 3urante el paso de congela)iento# la
eli)inaci&n del contenido de agua en las clulas y el estado del agua re)anente en el
interior de sta# resultan %actores crticos. Las )odernas tcnicas de crioconservaci&n
se basan en el %en&)eno de la vitri%icaci&n. La vitri%icaci&n consiste en la transici&n
directa del agua del estado l"uido al estado a)or%o o vtreo sin la %or)aci&n de (ielo
cristalino. !n este procedi)iento# las )uestras a congelar son previa)ente
des(idratadas por e,posici&n al aire o por el uso de los )edios crioprotectores antes
re%eridos. !stos pasos )ini)i'an la %or)aci&n de cristales intracelulares "ue da<aran
la integridad de las clulas vegetales a conservar.
!l descongela)iento puede acelerarse su)ergiendo las )uestras en un ba<o de agua
a 50>C# durante 1-2 )in y agregando gradual)ente )edio de cultivo para diluir las
sustancias crioprotectoras y evitar la plas)&lisis celular. !l )aterial congelado puede#
de lo contrario# dearse a te)peratura a)biente en el laboratorio# logr*ndose as un
descongela)iento lento. 1na ve' recuperadas las )uestras debe estudiarse su
viabilidad. !,isten di%erentes )todos o pruebas "ue per)iten esti)ar la viabilidad de
clulas y protoplastos. Las pruebas colori)tricas co)o el )todo del cloruro de
2#3#C-tri%enil tetra'olio .TTC0 y la tinci&n con diacetato de %luorescena .23A0 per)iten
distinguir las clulas vivas de las no viables por desarrollo de color o de %luorescencia.
!l )aterial vegetal descongelado viable podr* ser recultivado bao condiciones
controladas# (aciendo uso de los )is)os )edios y condiciones en "ue se lo cultivaba
antes de su criopreservaci&n.
!l congela)iento constituye el paso crtico de la crioconservaci&n. La elecci&n de
alguna de una de las tres )odalidades de congela)iento .r*pido# lento o escalonado0
depender* de las caractersticas del )aterial a preservar. 9i la )uestra es pe"ue<a
podr* practicarse un congela)iento r*pido# (aciendo uso de sustancias
crioprotectoras. !n el caso de )uestras de )ayor ta)a<o# podr* optarse por un
procedi)iento lento o gradual# dependiendo del contenido de agua del )aterial a
conservar. +ara )uestras de alto contenido de agua# el congela)iento escalonado
resulta aconseable luego de la des(idrataci&n cuidadosa de la )uestra. !l
congela)iento lento y el procedi)iento gradual aseguran un adecuado progreso del
congela)iento desde el interior de la )uestra (acia la super%icie e,terna.
La transparencia 63 )uestra un es"ue)a de los pasos i)plicados en la
crioconservaci&n de )eriste)as de soa. Los )eriste)as son diseccionados bao lupa
estereosc&pica y establecidos in vitro en un )edio conteniendo la %or)ulaci&n salina
de Duras(ige y 9@oog co)ple)entada con di%erentes reguladores del creci)iento.
1na ve' desarrollados los v*stagos o brotes# sus )eriste)as son nueva)ente
separados co)o e,planto a crioconservar. Co)o sustancia crioprotectora se utili'a
di)etilsul%&,ido .3D9?0 al CH. La tasa de congela)iento se austa a 0#;5 MC por
)inuto# de )anera de evitar la %or)aci&n de cristales intracelulares. 1na ve'
congelados# los )eriste)as son su)ergidos en nitr&geno l"uido y conservados a
largo pla'o a -1/6MC. La recuperaci&n del )aterial vegetal incluye su
descongela)iento a te)peratura a)biente# su lavado y su sie)bra en condiciones de
cultivo "ue incluyen )edios nutritivos ricos y reguladores del creci)iento. !stos
%actores %avorecen el desarrollo de nuevos v*stagos "ue crecer*n in vitro para dar
lugar a plantas co)pletas. ?tra posible va para la recuperaci&n del )aterial
conservado# consiste en la encapsulaci&n de los )eriste)as recuperados en c*psulas
de alginato para su )aneo co)o se)illa sinttica. !stas se)illas arti%iciales pueden
ser luego se)bradas en condiciones de ger)inaci&n adecuadas para obtener plantas
co)pletas.
Cultivo in vitro de clulas #aploides y embriones
Transparencias 65-60
Las clulas (aploides contienen un =nico uego de la dotaci&n cro)os&)ica# por lo
"ue constituyen una valiosa (erra)ienta para la selecci&n de caracteres deseables en
los progra)as de )eora)iento. !l %enotipo de las plantas derivadas de estas clulas
resulta de la e,presi&n de la =nica copia del )aterial gentico# por lo "ue no e,iste
en)ascara)iento de caracteres debido a e%ectos de do)inancia. !l obetivo del cultivo
de anteras y polen es producir plantas (aploides partiendo de esporas )onoploides#
ya sean stas granos in)aduros de polen o )icrosporas# )ediante la inducci&n de la
e)briognesis. !l co)ple)ento cro)os&)ico de estos (aploides puede ser duplicado
con el uso de colc(icina o a travs de la regeneraci&n de diploides (o)ocigotas
%rtiles.
Las anteras de nu)erosas especies vegetales# entre ellas el tabaco# pueden ser
cultivadas de )anera relativa)ente si)ple# en )edios conteniendo )inerales y
sacarosa. !n general# la %or)ulaci&n salina )*s utili'ada es la de Duras(ige y 9@oog
aun"ue# para el caso de algunas plantas# resulta conveniente )odi%icar el contenido
relativo de E-5. Algunas otras especies re"uieren la adici&n de co)puestos org*nicos
y (or)onas vegetales. La adici&n de reguladores del creci)iento del tipo de las
au,inas da lugar a la %or)aci&n de callos# lo "ue resulta desaconseable por"ue
pro)ueve la variabilidad gentica. !n 1/C3# Tulec@e observ& por pri)era ve' la
inducci&n de callos (aploides a partir de granos de polen )aduros de la gi)nosper)a
%!nkgo biloba en condiciones adecuadas de cultivo. -acia 1/66# Au(a y Da(es(Iuari
reportaron la observaci&n de divisiones repetidas de granos de polen de di%erentes
angiosper)as in vitro. !stos investigadores reali'aron e,peri)entos de cultivo de
granos de polen de Datura inno$ia .una planta solan*cea0 co)o )edio para el estudio
de los %actores reguladores de la )eiosis. !n el )arco de esta investigaci&n# lograron#
la obtenci&n de e)briones so)*ticos "ue dieron origen a plantas nor)ales con un
=nico uego de cro)oso)as.
!l estadio de desarrollo de las anteras en el )o)ento de inicio del cultivo resulta el
%actor )*s i)portante para la obtenci&n de una respuesta )or%ogentica. !n el caso
de las angiosper)as con un n=)ero indeter)inado de anteras# es conveniente
seleccionar botones %lorales con di%erente n=)ero de las )is)as en los distintos
estadios de )aduraci&n. !n el caso de especies con n=)ero deter)inado de anteras#
deber* e,a)inarse cierta cantidad de pi)pollos para contar al inicio del cultivo con
anteras en di%erentes estadios de )aduraci&n. La relaci&n entre el grado de desarrollo
y la respuesta al cultivo in vitro per)ite de%inir tres tipos de anteras7 a0 anteras pre-
)it&ticas8 son a"uellas "ue responden )eor al cultivo in vitro una ve' "ue las
)icrosporas (an co)pletado su )eiosis .ee)plo# &ordeum vulgare08 b0 anteras
)it&ticas8 son a"uellas "ue responden &pti)a)ente al cultivo cuando se las sie)bra
luego de la pri)era divisi&n )it&tica del grano de polen .ee)plo# 'icotiana tabacum0 y
c0 anteras post-)it&ticas8 son a"uellas "ue responden al cultivo cuando los granos de
polen ya (an alcan'ado su estado bicelular .ee)plo# (tropa belladona0. !l trata)iento
de anteras o panculas de arro' a 10>C durante ; d au)enta su respuesta al cultivo in
vitro# dis)inuye el albinis)o de los cereales y esti)ula la divisi&n )it&tica ecuatorial
de las )icrosporas androgenticas.
!n un progra)a de )eora)iento# el tie)po re"uerido para obtener una lnea
isognica se reduce de C:6 generaciones a 1:2 cuando se e)plea el cultivo de
(aploides in vitro. La duplicaci&n del )aterial gentico de los (aploides obtenidos se
logra tratando las anteras con colc(icina antes de la pri)era divisi&n )it&tica del
polen. 9e obtiene as una pri)era generaci&n de (o)ocigotas. Cuando el cultivo se
inicia a partir de )icrosporas no tratadas con colc(icina# las plantas producidas
resultan (aploides .y por lo tanto estriles0# pero pueden ser diploidi'adas
posterior)ente. La producci&n de (aploides in vitro no presenta li)itaciones una ve'
introducidos al protocolo los necesarios austes para cada especie de inters.
1n protocolo general de cultivo de granos de polen incluye los siguientes pasos7 a0
cultivo in vitro de las anteras durante 2-3 d8 b0 ruptura y sie)bra en )edio de cultivo
l"uido para obtener suspensiones de apro,i)ada)ente C,105 granos de polen8 c0
%iltraci&n y centri%ugaci&n de la suspensi&n8 d0 resuspensi&n del polen en )edio de
cultivo l"uido a la densidad deseada. Las condiciones generales de cultivo de los
granos de polen incluyen la %or)ulaci&n salina de 9underland y $oberts .1/660#
oscuridad .durante los pri)eros 1C d de cultivo0# y te)peratura de 2;MC.
!l cultivo in vitro de polen i)plica la interrupci&n del desarrollo nor)al de la ga)eta
)asculina# %or'ando la evoluci&n de estas clulas (acia la %or)aci&n de una pl*ntula
(aploide. +ara %avorecer esta di%erenciaci&n# los granos de polen deben ser aislados
de su )edio natural dentro de las anteras e incubados bao condiciones arti%iciales de
cultivo. Antes de iniciar el cultivo de polen# debe considerarse )uy cuidadosa)ente el
estado de la planta a partir de la cual se obtendr* el )is)o .planta dadora0. !sta
deber* )antenerse en condiciones %avorables de cultivo bao un rgi)en &pti)o de
ilu)inaci&n. 3urante el perodo de desarrollo del polen .andrognesis0 deber*n
e,tre)arse los cuidados de la planta )adre para evitar cual"uier condici&n de estrs
"ue resultara en un anor)al desarrollo de las clulas de inters. Antes de la re)oci&n
del polen del interior de las anteras# resulta aconseable )antener los botones %lorales
a te)peratura adecuada. !l %ro sincroni'a el desarrollo de los granos de polen#
pro)oviendo el cese de su actividad )etab&lica y prepar*ndolos para iniciar su
divisi&n vegetativa cuando se restablecen condiciones inductoras adecuadas .)edio
de cultivo# te)peratura# lu'0. !l e%ecto de la baa te)peratura puede co)pararse a una
vernali'aci&n o dor)ici&n inducida. !l rango de te)peraturas a utili'ar depende de la
especie vegetal en cultivo.
La polini'aci&n seguida de la %ertili'aci&n resulta en la %or)aci&n de un e)bri&n
contenido en una se)illa. !n la gran )ayora de las angiosper)as la autopolini'aci&n
se encuentra li)itada. Ade)*s# las (ibridaciones interespec%icas e intergenricas son
)uy poco %recuentes en la naturale'a. +or esta ra'&n# la polini'aci&n y la %ertili'aci&n
in vitro constituyen (erra)ientas )uy =tiles en los progra)as actuales de
)eora)iento. La gran )ayora de los e)briones obtenidos por estas vas no resultan
viables en condiciones naturales# por lo "ue deben ser rescatados# es decir cultivados
bao condiciones controladas in vitro# %uera de la se)illa.
!l cultivo de e)briones in)aduros consiste en la disecci&n de los )is)os bao
condiciones de esterilidad y en su trans%erencia a un )edio adecuado de cultivo bao
condiciones controladas. !n general# resulta %*cil obtener e)briones libres de
pat&genos# ya "ue se encuentran protegidos dentro del )edio estril del ovario. Antes
de la disecci&n y estableci)iento in vitro# se debe proceder a desin%ectar
super%icial)ente los ovarios# se)illas y:o %rutos "ue los contienen. !n el caso de
se)illas con tegu)entos duros o gruesos# se las su)ergir* en agua durante uno o
pocos das para luego utili'ar soluciones desin%ectantes. Las se)illas esterili'adas
deben ser abiertas dentro de un gabinete de %luo la)inar. Los e)briones in)aduros
se re)ueven de la se)illa y se sie)bran en )edio nutritivo estril. !n )uc(os casos#
la disecci&n de los e)briones se lleva a cabo bao una lupa estereosc&pica instalada
dentro del cuarto estril. 3urante la )anipulaci&n debe tenerse particular cuidado para
evitar da<os )ec*nicos o des(idrataci&n. !l aspecto )*s i)portante del cultivo de
e)briones es la co)posici&n del )edio sinttico de cultivo. Cuanto )*s oven o
in)aduro es el e)bri&n# )ayores son sus re"ueri)ientos nutricionales# re"uiriendo
sales inorg*nicas y una %uente de (idratos de carbono .sacarosa0# di%erentes
co)binaciones de vita)inas# a)ino*cidos# reguladores del creci)iento y# en algunos
casos# e,tractos naturales de endosper)o# tales co)o agua de coco. 3ado "ue en
general los e)briones in)aduros se encuentran natural)ente e)bebidos dentro del
endosper)o "ue los rodea# resulta reco)endable adicionar co)puestos
os)&tica)ente activos al )edio de cultivo .por ee)plo# )anitol0.
La tcnica de la polini'aci&n y %ertili'aci&n in vitro %ue desarrollada por investigadores
de la 1niversidad de 3el(i# Fndia# en los a<os 60 utili'ando co)o especie )odelo
apaver somniferum. !l ,ito de esta tcnica depende de dos %actores b*sicos7 a0 el
estado de los granos de polen y de los &vulos a utili'ar y# b0 la co)posici&n del )edio
nutritivo adecuado para la inducci&n de la ger)inaci&n del polen# el creci)iento del
tubo polnico y el desarrollo del e)bri&n. +ara el )aneo de estas condiciones# resulta
i)prescindible el conoci)iento de la biologa %loral de la especie de inters# lo "ue
i)plica poseer in%or)aci&n sobre los procesos de antesis# la de(iscencia de las
anteras# la polini'aci&n# la ger)inaci&n del polen y el desarrollo del endosper)a y del
e)bri&n.
emillas sintticas
Transparencias 61-65
La posibilidad de obtener e)briones so)*ticos a gran escala (a sentado las bases
para el desarrollo de la deno)inada tecnologa de las se)illas sintticas. La
producci&n de estas se)illas arti%iciales se (a convertido en una alternativa para el
)aneo e,tensivo de especies cultivables. Eu)erosas especies de inters agron&)ico
pueden (oy en da ser )ultiplicadas clonal)ente y se)bradas a ca)po utili'ando esta
tecnologa. !stas se)illas pueden ser )aneadas co)o si se tratara de se)illas
tradicionales# incluso con el au,ilio de )a"uinaria agrcola.
La transparencia 31 )uestra un es"ue)a de la va e)briognica iniciada a partir de
un tro'o de teido o de clulas vegetales en suspensi&n. 9e gra%ica la regeneraci&n
indirecta# "ue pasa por des-di%erenciaci&n del e,planto inicial y sucesivas divisiones
)it&ticas par dar lugar a la %or)aci&n de un callo. !n algunos casos# resulta posible
pro)over la regeneraci&n directa de e)briones so)*ticos .sin %or)aci&n de callo0#
)ini)i'*ndose de esta %or)a la posibilidad de variabilidad genotpica. Los e)briones
o e)brioides de origen so)*tico pueden )antenerse bao condiciones de cultivo in
vitro# subcultiv*ndolos en un )edio "ue propicie su ger)inaci&n# o bien pueden
encapsularse para la obtenci&n de se)illas sintticas. !n a)bos casos su ger)inaci&n
dar* lugar a una planta idntica a la planta )adre seleccionada.
+ara la obtenci&n de se)illas sintticas# los e)briones so)*ticos son encapsulados
en gotas de alginato de sodio al 2H. !,isten di%erentes procedi)ientos# incluso
)ecani'ados# para disponer los e)briones en el interior de cada gota. !l )*s sencillo
consiste en dispensar# )ientras la soluci&n de alginato se engloba por goteo# un
e)bri&n dentro de una gota en %or)aci&n con au,ilio de una pipeta o eringa. Las
gotas conteniendo los e)briones se agregan a rit)o lento en una soluci&n de E?
3
Ea
100 )D# lo "ue pro)ueve su geli%icaci&n y da lugar a la %or)aci&n de se)illas
sintticas .perlas de alginato conteniendo e)briones so)*ticos0.
Cultivo de protoplastos
Transparencias 6C-6/
La transparencia 66 )uestra una tpica suspensi&n de protoplastos de 'icotiana
tabacum. Los protoplastos son clulas vegetales desprovistas de pared celular. La
introducci&n en la dcada de los a<os 60 de )todos de aisla)iento de protoplastos
viables por trata)ientos en'i)*ticos posibilit& su obtenci&n a gran escala y su
utili'aci&n para estudios e,peri)entales. !n )edios nutritivos adecuados y bao
condiciones controladas de cultivo# los protoplastos pueden regenerar su pared celular#
dividirse y di%erenciarse dando lugar a plantas co)pletas.
Los protoplastos constituyen un e,planto ideal para di%erentes aplicaciones
biotecnol&gicas. La ausencia de pared celular rgida y la co)pleta e,posici&n de la
)e)brana plas)*tica (acen de los protoplastos un siste)a =til para el estudio de los
%en&)enos de transporte a travs de esta =lti)a. Eu)erosas investigaciones acerca
del proceso de in%ecci&n y replicaci&n de virus %itopat&genos se (an valido de los
protoplastos co)o (erra)ienta de indagaci&n. Ta)bin (an sido utili'ados para la
elucidaci&n de la especi%icidad y )odo de acci&n de pat&genos %=ngicos y bacterianos.
Los protoplastos aislados son capaces de incorporar organelas e,&genas# tales co)o
n=cleos y cloroplastos# as co)o ta)bin A3E# protenas# y otras )acro)olculas# lo
"ue posibilit& el desarrollo de ensayos de trans%or)aci&n gentica y de %usi&n. !stos
e,plantos pueden ser e)pleados con ,ito en ensayos de )utagnesis y la
regeneraci&n posterior de plantas transgnicas.
!l incre)ento en la variabilidad gentica puede inducirse en poblaciones (o)ogneas
de clulas vegetales# protoplastos o callos# )ediante la e,posici&n a agentes
)utagnicos %sicos o "u)icos. !stos agentes per)iten de incre)entar el aisla)iento
de variantes genticas cuando los cultivos son )antenidos bao condiciones selectivas
"ue per)iten la r*pida detecci&n de )utantes. Los principales tipos de )utantes son7
a0 au,otr&%icos8 a"uellos "ue re"uieren suple)entos nutricionales para su creci)iento8
b0 resistentes8 los "ue resisten a drogas espec%icas# anti)etabolitos o condiciones
nutricionales anor)ales y c0 autotr&%icos8 a"uellos "ue crecen y prosperan en )edios
de cultivo de%icitarios y son capaces de sinteti'ar co)puestos nor)al)ente re"ueridos
por las lneas wild t!pe.
La )ayor ventaa "ue o%rece el cultivo in vitro de protoplastos es la posibilidad de tratar
un gran n=)ero de clulas con los agentes )utagnicos y de seleccionar dic(os
e,plantos bao condiciones controladas. Los avances en las tcnicas de cultivo in vitro
(an posibilitado el per%ecciona)iento de este procedi)iento para la producir lneas
celulares# teidos y organis)os )utantes en %or)a )*s r*pida y e%iciente "ue los
procedi)ientos convencionales. Con la di%usi&n de la )utagnesis y cultivo in vitro# los
investigadores (an podido encarar el desarrollo de nu)erosas aplicaciones de inters
econ&)ico. !e)plos de ello son la selecci&n de lneas resistentes a estrs para
obtener plantas adaptadas a suelos salinos# la obtenci&n de plantas resistentes a
(erbicidas y pesticidas# la selecci&n de lneas celulares y plantas tolerantes al
anega)iento o a te)peraturas elevadas y la obtenci&n de plantas con alteraciones en
la sntesis de )etabolitos secundarios de valor co)ercial .pig)entos y alcaloides0.
La %usi&n de protoplastos posibilita el cru'a)iento de individuos "ue no son
co)patibles en la naturale'a y "ue no puede lograrse a travs de las tcnicas
tradicionales de )eora)iento. Los protoplastos pueden %usionarse espont*nea)ente
durante su aisla)iento o ser inducidos a ello por e,posici&n a condiciones especiales.
Los (eterocariontes resultantes pueden contener nu)erosos n=cleos. !stos
protoplastos )ultinucleados %or)an una nueva pared y sus n=cleos entran en )itosis
sincr&nica)ente. !l proceso )ei&tico contin=a y se sincroni'a en los (o)ocariontes.
Los productos de la %usi&n pueden ser estudiados por di%erentes )todos. La tinci&n
di%erencial de n=cleos per)ite )onitorear los productos de %usi&n. La relaci&n 171 entre
los n=cleos de cada especie resulta ser la )*s %recuente. Los protoplastos
)ultinucleados se deterioran )ientras "ue los productos de la %usi&n se recuperan del
trata)iento con polietilenglicol .+!A0 y %or)an su nueva pared dentro de las 25 (. La
producci&n de clulas (bridas entre di%erentes %a)ilias de plantas co)o tabaco y soa#
'ana(oria y cebada# to)ate y papa# entre otras# sugiere la ausencia de )ecanis)os
de inco)patibilidad entre las clulas so)*ticas. La naturale'a (brida de las progenies
celulares puede establecerse en base a estudios de ultraestructura# identi%icaci&n de
cro)oso)as# isoen'i)as# patr&n de polipptidos# )arcadores )oleculares# etc.
Variacin somaclonal
Transparencias ;0-;3
La variaci&n gentica espont*nea (a sido tradicional)ente utili'ada para desarrollar
nuevas variedades de plantas. 3urante el cultivo in vitro# cuando los teidos pasan por
%ases de des-di%erenciaci&n# se producen alteraciones "ue pueden originar ca)bios
genticos en las plantas regeneradas. !stos ca)bios se deno)inan variaci&n
so)aclonal y puede servir co)o %uente de variaci&n gentica para progra)as de
)eora)iento de plantas de i)portancia econ&)ica. Ta)bin puede ser utili'ada co)o
%uente para la obtenci&n de )utantes con caractersticas genticas# bio"u)icas#
%isiol&gicas y agron&)icas deter)inadas.
La %recuencia de aparici&n de variantes so)aclonales es general)ente )ayor en la
regeneraci&n indirecta .a"uella "ue pasa por la %or)aci&n de un callo0 y en los cultivos
celulares "ue incluyen alteraciones en el n=)ero de uegos cro)os&)icos
.poliploidia0# prdida de cro)oso)as .aneuploidia0# aberraciones cro)os&)icas
.deleciones# traslocaciones# inversiones0 o )utaciones puntuales. !sto (ace de los
cultivos de callos y clulas en suspensi&n siste)as interesantes y =tiles para el
aisla)iento# por )edio de distintas presiones de selecci&n# de clulas variantes o
)utantes con caractersticas espec%icas. +or ee)plo# la variaci&n so)aclonal puede
utili'arse para aislar clulas resistentes a sustancias t&,icas .(erbicidas# to,inas
)icrobianas# )etales pesados# etc.0 o a %actores abi&ticos co)o el %ro# la salinidad y la
se"ua.
3urante el cultivo in vitro de clulas y:o teidos vegetales puede ocurrir la obtenci&n de
regenerantes "ue presenten una alteraci&n espont*nea de su %enotipo. !n los
progra)as de propagaci&n clonal )asiva# esta variabilidad resulta desventaosa o
negativa# principal)ente cuando se origina a partir de )utaciones cro)os&)icas o
gen&)icas. 3ebido a "ue estos nuevos genotipos di%ieren del tipo varietal de la planta
)adre de origen# deben ser descartados y separados del cultivo. 9in e)bargo# en los
=lti)os a<os la variaci&n so)aclonal (a co)en'ado a considerarse una %uente valiosa
para el )eora)iento intra-cultivar. !ste tipo de variabilidad puede verse %avorecida
bao condiciones restrictivas o bao presi&n de selecci&n.
!n un protocolo de selecci&n de variantes so)aclonales# resulta %unda)ental aplicar la
presi&n de selecci&n adecuada durante el cultivo. !sta presi&n de selecci&n puede
estar dada por el agregado de deter)inados co)puestos al )edio de cultivo
.antibi&ticos# (erbicidas# etc.0# o por el au)ento o la )odi%icaci&n de la concentraci&n
relativa de algunos co)ponentes de la %or)ulaci&n salina .por ee)plo# alta
concentraci&n de ClEa0# por variaci&n de la te)peratura en la c*)ara de creci)iento#
o por la alteraci&n de las condiciones de ilu)inaci&n .intensidad o %otoperodo0# entre
otras.