UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Laboratorio de Bioqumica
Celular y de los Tejidos I
Grupo 2401 Q.F.B. 2014/2

Equipo 7:
Buenda Garca Josu Ivn
Cruz Espinoza Mariana Elizabeth
Murgua Muoz Gabriel Antonio
Ramos Serrano Melanie Vernica


Presentan:

SEPARACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS PLASMTICAS


Abril 7, 2014
Separacin y cuantificacin de protenas plasmticas
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|| OBJETIVOS ||
Separar albumina y globulina a partir de una muestra de sangre
Obtener muestra de sangunea por venopuncion
Determinar cuantitativamente por medio de una curva estndar la concentracin de
protenas totales, albumina y globulinas presentes en el plasma por el mtodo de
biuret

|| FUNDAMENTO DEL PROCESO ||


La sangre es el fluido corporal ms utilizado con fines analticos. Los tres procedimientos
habituales para obtener sangre son:

Puncin cutnea
Puncin venosa
Puncin arterial

La composicin de la sangre venosa segn la actividad metablica del organismo o tejido
perfundido por el punto en el que se extrae la muestra puede influir en la composicin de la
sangre venosa. La sangre venosa tiene menos oxigeno que la arterial, pero tambin se
diferencia de esta por el pH, su concentracin de dixido de carbono y su hematocrito. A veces
tambin varan las concentraciones de glucosa, cido lctico, cloro y amonio.

Las protenas plasmticas constituyen un grupo de aproximadamente cincuenta protenas
contenidas en el flujo sanguneo, para diferenciarlas de las que pueden aparecer de forma
transitoria deben cumplir los siguientes requisitos

Ser secretadas activamente a la sangre
No derivar de lesiones ni alteraciones de tejidos o clulas
Ejercer su funcin fundamental en el sistema vascular
Presentar mayor concentracin en el plasma que en cualquier otro tejido

La concentracin presente de cada una de las protenas plasmticas es muy variable oscilando
desde los 0.01g/100mL hasta los 5g/100mL, siendo el contenido total de protenas en el
plasma de 6-8 g/100mL. Las protenas plasmticas por su importancia se clasifican en tres
grupos principales:

Albumina, globulinas y fibringeno.
Para la obtencin y separacin de las protenas plasmticas se hace uso de varias tcnicas
basadas en sus propiedades inmunolgicas y carga elctrica, entre otras.
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De acuerdo a su patrn de agrupamiento en la migracin electrofortica, las protenas
plasmticas pueden agruparse en:

1. Albumina (constituye el 55% del total de las protenas plasmticas con una cantidad
aproximada de 4g/100mL).
2. globulinas
1
: globulinas
1
acida,
1
-antitripsina,
1
-fetoglobulina,
1
-
antiquimiotripsina, transcortina, inhibidor inter-
1
-de la tripsina, protena
transportadora de retinol,
1
-lipoproteinas,
1
-B y
1
-T glicoprotenas (5% del
total, de 0.3-0.6 g/100mL).
3.
2
-globulinas: haptoglobina,
2
-macroglobulina, ceruloplasmina, hemopexina y
tranferrina (9% del total, de 0.4-0.9 g/100mL).
4. -globulinas: -globulina ligadora de esteroides, -microglobulina, fibringeno,
-glicoproteina especifica del embarazo, -lipoproteinas y protenas C reactiva (13%
del total, de 0.6-1.1 g/100mL).
5. Y-globulinas: lgG, lgM, lgA, lgD, lgE (11% del total, de 0.7-1.5g/100mL)

La albumina se sintetiza en forma de proalbumina en el retculo endoplasmatico del hgado.
Transporta tanto sustancias anionicas como catinicas, entre las que cabe destacar la
bilirrubina, frmacos como el cido acetilsaliclico, aminocidos como el triptfano y algunas
hormonas esteroides y tiroides. Su otra gran funcin es la del mantenimiento del volumen
vascular, a ella se debe el 80% de la presin osmtica del plasma al existir unas 17 cargas
negativas en su estructura a pH fisiolgico. Las globulinas en conjunto representan
aproximadamente el 38% del total de las protenas plasmticas y entre sus funciones
destacan el transport de lpidos y la seleccin de anticuerpos.

El plasma es el componente lquido de la sangre de color amarillo translcido. La sangre
humana est compuesta de aproximadamente el 55% de plasma, y el plasma se compone de
90% de agua. El 10% restante contiene minerales, hormonas, electrolitos, residuos y
nutrientes para proporcionar energa para el cuerpo. Tambin, transporta los gases esenciales
en todo el cuerpo, incluyendo oxgeno, dixido de carbono, y nitrgeno. Contiene el suero
junto con elementos coagulantes, cuando estos ltimos son eliminados, el lquido restante es
el suero, es idntico en apariencia y composicin a la del plasma, que contiene los mismos
niveles de minerales y agua. La diferencia es un factor de coagulacin llamado fibringeno,
que carece en una muestra de suero.
Un anticoagulante es una sustancia de distinta naturaleza qumica que afecta al proceso de
coagulacin. Poseen un efecto biolgico, lo cual permite que se puedan dividir en dos tipos:
1. Anticoagulantes de accin indirecta: Este tipo de anticoagulantes son aquellos que por
medio de su intervencin con otras protenas alteran el funcionamiento de las cascadas de
coagulacin, esta accin tambin sucede cuando actan en otras vas metablicas.

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Entre los anticoagulantes de accin indirecta se encuentran:
Inhibidores medianos de antitrombina III
Inhibidores de sntesis de factores de coagulacin
Derivados del dicumarol
Heparina no fraccionada
Heparina de bajo peso molecular
Danaparoide sdico
2. Anticoagulantes de accin directa: Estos anticoagulantes son aquellos que son capaces de
inhibir la cascada de la coagulacin.
Entre los anticoagulantes de accin directa, se encuentran:
Inhibidores directos de trombina
Hirudina
Argatroban
Principales mtodos para la cuantificacin de protenas
Mtodo de Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos
NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de
coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la
reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del
mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).
Mtodo de Bradford Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva
Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja.
Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un
coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple,
rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.
Mtodo de BCA El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo
prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo
analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con
Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona
un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra
una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos.





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|| MATERIAL Y REACTIVOS||


Reactivos

Solucin de sulfato de sodio al 23% P/V en agua.
ter etlico
NaOH 0.1N
SOLUCION ESTANDAR DE ALBUMINA 350mg/100mL DE NaOH 0.1N
NaOH 1N
REACTIVO DE BIURET


Material

Probeta graduada de 10mL
Vasos de precipitados de 100mL gradilla
Termmetro
Tubo Vacutainer con anticoagulante (EDTA)
Aguja para Vacutainer.
Papel parafilm
Tubos de ensaye 13x100
Marcador indeleble de punta extrafina
Micropipetas p20. P200, p1000 y p5000.
Pipetas de 2, 1 y 5mL
Puntas nuevas para Micropipetas
Pipetas Pasteur
Centrifuga
Balanza analtica
Espectrofotmetro
Parrilla de calentamiento


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|| MTODO EJECUTADO ||
Obtencin de una muestra sangunea por venopuncion con un sistema Vacutainer usando como
anticoagulante (EDTA)
a) Se tuvo listo el material: tubos, ligaduras, torundas, jeringas, aguja estril y dispositivo
Vacutainer
b) Se identific el tubo
c) Se coloc adecuadamente el donador
d) Se solicit al donador que cerrara el puo para que las venas resultaran mas palpables
e) Se seleccion la vena adecuada para la puncin
f) Se limpi la zona de la puncin con una torunda humedecida con alcohol.
g) Se comenz en el punto de la puncin y se prosigui la limpieza hacia fuera siguiendo un
movimiento espiral.
h) Se aplic un torniquete a varios centmetros por encima de la zona de puncin. No se dej
ms de un minuto.
i) Se fij la vena tanto por encima como por debajo del lugar de puncin, con ayuda de los
dedos pulgar y medio o ndice y pulgar.
j) Se realiz la venopuncion, se penetro a la piel la aguja formando un ngulo de 15 grados
con el brazo y el bisel hacia arriba se sigui la direccin de la vena; se introdujo la aguja
con suavidad pero a la vez con rapidez para que se redujeran las molestias. No se enterr
la aguja. En cuanto la aguja penetro a la vena se dirigi el tubo todo lo posible hacia
delante apoyndose del dispositivo de sujecin. Al mismo tiempo se mantuvo firmemente
la aguja en su lugar. Una vez que lleno el tubo, se retir tomando por su extremo y tirando
suavemente de l. Se mezcl la sangre con el anticoagulante por inversin suave.
k) Cuando la sangre comenz a fluir se liber el torniquete. Una vez que se obtuvo la
muestra se le indico al donador que relajara el puo y que no bombeara con la mano.
l) Se coloc suavemente una torunda de algodn estril sobre el punto de puncin. Se
extrajo la sangre con movimiento rpido y se ejerci presin sobre la zona. No se aplic
masaje.
Realizacin de curva estndar
Se centrifugo el tubo de la muestra de sangre a 3000rpm durante 5 minutos y se separ
con cuidado el plasma
Se coloc el plasma en un tubo adicional con ayuda de una pipeta Pasteur. Se adiciono
4.57mL de sulfato de sodio al 23 %P/V. se tap por inversin tres veces. Se tom 1mL de
la suspensin y se coloc en un tubo. Se etiqueto como protenas totales. Se le agreg 3
mL de ter etlico al resto de la suspensin, se tap y se mezcl por inversin, no se agito,
se centrifugo a 2000rpm durante aproximadamente 10 minutos.
Despus de que se centrifugo ,se form 3 capas y se tom 1mL dela capa inferior y se
coloc en un tubo, que se etiqueto como albuminas
Se prepararon 7 tubos y se enumeraron de 1 al 6 y a otro se nombr como blanco y se
agreg cada tubo como lo indica la tabla.
Se tom lectura en el espectrofotmetro a 540 nm y se registr los valores.


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TABLA. Separacin y cuantificacin de protenas plasmticas
Tubo (mL) blanco 1 2 3 4 5 6 7
Solucin
patrn de
protenas
-- -- -- -- -- -- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Agua
destilada
1 0.5 -- -- 0.8 0.6 0.4 0.2 -- --
Solucin de
protenas
totales
-- -- 0.5 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
Solucin de
albuminas
(problemas)
-- -- -- -- 1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- --
Reactivo de
Biuret
2 2 2 2 2 2 2 2
Se coloc los tubos en bao mara a 30-35 C durante 10 minutos
Se dej reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos
Se determin la absorcin de cada uno de los tubos contra el blanco a 540 nm
Medidas de
absorbancia
0.00 0.148 0.164 0.074 0.158 0.226 0.282 0.379

o Solucin Patrn de protenas

350 mg 100 mL
X= 3.5 mg 1 mL

o Solucin problema de protenas totales

) (

x 25 = 2.8 mg/ mL

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Tubo Volumen patrn (mL) [ ] Protena (mg) Absorbancia
blanco 0.0 0.0 0.000
3 0.2 0.7 0.074
4 0.4 1.4 0.158
5 0.6 2.1 0.226
6 0.8 2.8 0.282
7 1.0 3.5 0.379

Protenas totales 0.148
Albumina 0.164

MNIMOS CUADRADOS:

A = 0.1056 (C) + 0.0017


y = 0.1056x + 0.0017
R = 0.996
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
A
n
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Concentracin (mg) Protena
Curva Estndar
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CONCENTRACIONES PROBLEMA

S A = 0.1056C + 0.0017

PARA PROTENAS TOTALES, CUANDO A = 0.148

C= (0.148 0.0017) / 0.1056 = 1.3854

PARA ALBUMINAS, CUANDO A = 0.164

C = (0.164 0.0017) / 0.1056 = 1.5369

I. CORRECCIN EN CONCENTRACIN

Protenas totales
1.3854/ 0.5 = 2.7708 mg/ mL
Albuminas
1.5369/ 1 = 1.5369 mg/ mL

II. MULTIPLICAR POR FACTOR DE DILUCIN

Factor de dilucin:
0.25mL + 4.8 mL / 0.2 mL = 25
Protenas totales
2.7708 (25) = 69.27 mg/ mL
69.27 mg/ mL (

) (

Albuminas
1.5369 (25) = 38.42 mg/ mL
38.42 mg/ mL(

) (

Globulinas = Protenas totales albuminas

6.927 g/100mL 3.842 g/ 100mL = 3.085 g/ 100 mL de Globulinas










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|| OBSERVACIONES||
Se trabaj con una reaccin cromognica, bajo el principio de Lambert-Beer,
y se pudo observar el gradiente de concentracin de forma ya cualitativa en
los tubos de ensayo en orden creciente con la cantidad de protenas
contenidas, siendo ms intensos los ms concentrados. La muestra de la
primera sangra realizada sufri una indeseable hemolisis que no permiti
trabajar apropiadamente con el plasma, se sabe que la muestra no recibi en
ningn momento agitacin indebida al homogeneizarse con el EDTA o alguna
vibracin brusca al centrifugarse. Se sospecha que una nfima cantidad de
etanol pudo lisar los eritrocitos. A pesar de ello, se volvi a realizar la
flebotoma con xito buscando continuar trabajando correctamente y en
efecto, se lograron resultados satisfactorios.

|| ANALISIS DE RESULTADOS||
La concentracin determinada experimentalmente en sta sesin de
protenas totales en plasma sanguneo se encuentra dentro de los valores de
referencia esperados para un adulto, que van de los 6.6 a 8.3 g/dL
(2)
. El
porcentaje de albmina e inmunoglobulinas tambin se encuentran en una
proporcin aceptable, lo que indica que el paciente no sufre ninguna de las
complicaciones fisiolgicas que alteraran sus concentraciones, y en general,
el paciente se encuentra en condiciones saludables.
Equipo 7





Fuente documental:
(1) Lehninger A. Principios de bioqumica. Barcelona: Omega; 2005.
(2) Devlin TM. Bioqumica. Libro de texto con aplicaciones clnicas. 3a ed. Madrid: Revert; 2000.
(3) Boyer R. Conceptos de bioqumica. Mxico: International Thomson Editores; 2000.