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DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
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MANUAL
PRCTICAS DE
LABORATORIO
DE BIOQUMICA
HERMINSUL DE JESS CANO CALLE
STELIA CAROLINA MNDEZ SNCHEZ
JENNIFFER CRUZ LAITN
ESCUELA DE QUMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

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MANUAL
PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA
HERMINSUL DE JESS CANO CALLE
STELIA CAROLINA MENDEZ SANCHEZ
JENNIFFER CRUZ LAITN
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
2013

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Contenido
Introduccin
Pg.
1. Espectroscopa y diluciones
6
2. Determinacin experimental del pH y soluciones amortiguadoras.
13
3. Soluciones amortiguadoras II
20
4. Anlisis estructural de protenas
26
5. Mtodo de cuantificacin de protenas: mtodo de Bradford, Biuret y Lowry.
31
6. Fraccionamiento de las protenas de la leche por pI y precipitacin salina.
40
7. Separacin de protenas sricas por electroforesis en acetato de celulosa
48
8. Purificacin y caracterizacin del ADN de la cebolla
58
9. Electroforesis de cidos nucleicos en gel de agarosa
64
10. Carbohidratos
XX
11. Extraccin e identificacin cualitativa de Lpidos
XX
12. Peroxidasa
XX
13. Amilasa salival
XX
14. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XX
15. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XX

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Introduccin
Este curso intenta introducir al estudiante a algunos de los procedimientos experimentales ms ampliamente
usados en bioqumica. Incluye anlisis de macromolculas como carbohidratos, lpidos, protenas y cidos
nucleicos; purificacin y caracterizacin de protenas, ensayos de enzimas y cintica enzimtica, aislamiento y
manipulacin de ADN y otros. El estudiante tambin se familiarizara con algunos de los equipos ms
frecuentemente usados en las prcticas de bioqumica.
Pocos artculos en la literatura estn escritos por un solo autor; la mayora tienen al menos dos autores y algunos
hasta ms de diez. Es as, que las prcticas sern llevadas a cabo en grupos de dos o tres estudiantes. Usted
puede escoger compaeros, o puede preguntar para que lo asignen a un grupo.
Antes de cada periodo de laboratorio, el estudiante necesita gastar algn tiempo leyendo la prctica, esta
lectura proveer informacin y entendimiento sobre los procedimientos a ser desarrollados. Si esto no se hace,
usted desperdiciara mucho tiempo de clase, y perjudicara a los dems estudiantes y al profesor. Tambin
encontrara difcil responder las preguntas de la prctica que deben ser entregadas cada da.
ASPECTOS FILOSOFICOS: La investigacin cientfica involucra una exploracin de lo desconocido. En
algunos casos, una pregunta tiene una respuesta correcta, la cual es conocida por el profesor e impartida a los
estudiantes. En investigacin, por otro lado, la respuesta correcta es raramente conocida de antemano y debe
siempre ser deducida de los resultados experimentales. Los investigadores deben por lo tanto acostumbrarse a
algn nivel de incertidumbre sobre la respuesta correcta a una pregunta experimental, y debe siempre
permanecer abierto a la evidencia experimental que contradice una hiptesis que ha surgido de experimentos
previos. Su trabajo como cientfico ser considerar sus datos, y tratar de interpretarlos. En este contexto,
respuestas equivocadas son respuestas que son contradichas por sus datos o que no producen una conclusin
lgica de los datos que usted ha recolectado. As, usted debe ser muy cuidadoso cuando reporte datos o
resultados de lo que usted hizo u observo, especialmente si usted observa algo inesperado. Fraude cientfico, en
la cual personas intencionalmente reportan datos falsos, es considerado muy en serio porque esto resulta en una
creencia difcil de sobreponer ya que es un estamento que entra en conflicto con la verdad. En algunas ocasiones
vemos en la literatura retractaciones, en la cual un cientfico publica un estamento de una informacin dada en
un articulo previo como el resultado de un artefacto y no como una reflexin de la respuesta correcta. Evitando
as la pena de publicar una retractacin y ser visto como una persona que no es cuidadosa en el desarrollo de
experimentos y en la interpretacin de resultados.
Otro asunto crtico es la apropiada citacin de las fuentes de informacin que usted usa para escritos cientficos.
Se debe siempre referenciar apropiadamente los autores de artculos y libros que usted consulta. Si usted no lo
hace, estar reclamando crdito por trabajo desarrollado por otros.

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1. ESPECTROSCOPA Y DILUCIONES
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
No presenta indicadores de peligro
1.1. Objetivos
Adquirir habilidades y competencias bsicas en el desempeo dentro de un laboratorio de bioqumica.
Determinacin cuantitativa de la concentracin de CuSO4 en una muestra problema mediante
espectroscopa de absorcin molecular UV-VIS.
Comprender y aplicar los conceptos de molaridad, normalidad, porcentajes de peso a peso y dilucin.
1.2. Conceptos relacionados
Absorbancia, ley de Lambert-Beer, dilucin, espectrofotometra.
1.3. Fundamento terico
1.3.1. Espectroscopa
Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solucin. La absorbancia es una
medida cuantitativa til y est relacionada con la concentracin a travs de la ley de Beer-Lambert, la cual
establece lo siguiente:
Donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda dada, es el coeficiente de extincin del
compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (Mcm)-1, c es la concentracin molar de la especie que
absorbe, y l es la longitud de paso de la celda que contiene la solucin donde se realiza la medicin y est dada
en cm. As, si el coeficiente de extincin es conocido, la absorbancia de la solucin puede ser usada para
calcular la concentracin de la especie en solucin (asumiendo que la nica especie que absorbe es el
compuesto de inters).
La explicacin anterior de por qu medimos la absorbancia no explica lo que significa la absorbancia en s. Otra
definicin ms precisa est dada por la expresin (2):

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( )
Donde I0 es la cantidad de luz que entra a la muestra, e I es la cantidad de luz que sale de la muestra. La
absorbancia es por lo tanto una medida de la porcin de luz que llega al detector. De lo cual se deduce que
cuando la absorbancia vale 1, solo el 10% de la luz alcanza el detector, y cuando es 2, solo el 1% de la luz
alcanza el detector.
Figura 1. Arreglo interno tpico de una cubeta de en el espectrofotmetro.
Valores de absorbancia mayores de 2 no son confiables porque muy poca luz est alcanzando el detector para permitir
mediciones acertadas. Cuando se realizan las mediciones, si el valor de absorbancia es mayor de 2, se debe diluir la
muestra y realizar las mediciones nuevamente.
Un espectrofotmetro interpretar huellas presentes en las caras pticas de la cubeta, como tambin burbujas
de aire o presencia de slidos en la solucin, afectando los valores reales de la medicin. Antes de colocar la
cubeta se deben tener en cuenta estos aspectos.
Algunas cubetas estn diseadas para luz visible nicamente. Cuando el espectrofotmetro est en modo de
ultravioleta (340 nm o menos) asegrese que su cubeta no tiene gran absorbancia cuando solamente contiene
agua.
El trmino espectroscopia proviene de la palabra espectro que originalmente se refera a los mltiples
colores de luz que aparecan al analizar luz blanca a travs de un prisma. Implica por lo tanto, el uso de mltiples
longitudes de onda de luz.
Los espectrofotmetros tienen entonces la habilidad de medir absorbancia a valores especficos de longitud de
onda. El mtodo usado ms comnmente involucra un monocromador que permite descomponer la luz
incidente en sus componentes con diferentes longitudes de onda y de esta forma escoger una longitud de onda a
la cual una muestra dada absorbe con mayor intensidad. La habilidad para medir la absorbancia a diferentes
longitudes de onda es muy til porque el coeficiente de extincin vara al variar la longitud de onda. Adems, el

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espectro de absorbancia puede variar dependiendo de la composicin qumica del compuesto y el ambiente
(solvente) alrededor de este.
La figura 2 muestra el espectro de absorbancia de una protena. Esta tiene un valor muy alto de absorbancia de
alrededor de 280 nm, y muy bajo a mayores longitudes de onda. Para esta protena, los nicos cromforos que
absorben a esta longitud de onda son los anillos aromticos de los aminocidos tirosina y triptfano. Como estas
protenas absorben en el ultravioleta, son incoloras. Sin embargo, hay otras protenas que absorban en la regin
visible como lo son la Hemoglobina que posee un grupo (Hemo) que absorbe fuertemente en esta regin.
Figura 2. Espectro absorcin ultravioleta de una protena.
El coeficiente de extincin de una molcula a una longitud de onda dada puede ser calculado utilizando la ley de
Beer-Lambert para medidas de absorbancia de soluciones de concentracin conocida.
1.3.2. Diluciones
Muchas soluciones usadas en bioqumica son preparadas por dilucin de una solucin estndar. Para esto se
necesita considerar la concentracin final deseada y el volumen requerido del material diluido, esto se puede
hacer utilizando la ecuacin (3).
Donde C1 en la concentracin inicial, V1 es el volumen inicial, V2 es el volumen del material diluido y C2 en la
concentracin final del material diluido.
Consideremos un ejemplo. Se necesita preparar unas diluciones para una curva de calibracin. Se tiene una
solucin estndar de 1000 g/mL de un compuesto y se necesita preparar 200 L de una solucin 20 g/mL. El
clculo entonces es:

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V1=?
C1= 1000 g/mL
V2=200 L
C2= 20 g/mL
( )
(
)
Esto quiere decir que se toman 4 L de la solucin inicial, se le adiciona 196 L de disolvente para obtener la
solucin final de concentracin conocida.
Otro factor importante es la nomenclatura para las diluciones la cual se muestra como una relacin. Por
ejemplo: Una relacin 1:2 quiere decir que a un volumen inicial se le agrega otro volumen de solvente para
lograr el volumen final. Una relacin 1:5 quiere decir que a un volumen inicial se le agregan 4 volmenes de
solvente. Otras veces la nomenclatura est dada en valores de X, por ejemplo una solucin 10X. Si se quiere
preparar de esta una dilucin 1X se necesitara una relacin 1:10 para prepararla. De la misma forma se pueden
preparar otras diluciones para realizar una curva de calibracin. En este experimento, se aprender cmo
preparar diluciones, cmo usar el espectrofotmetro y cmo interpretar los datos.
1.4. Materiales
Pipetas
Puntas para pipetas
Papel parafinado
1.5. Equipos
Espectrofotmetro UV-Vis
1.6. Sustancias
Sulfato de cobre (CuSO4) 0,1 M
Solucin problema de CuSO4
1.7. Procedimiento
1.7.1. Dilucin simple 1

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Colocar la longitud de onda a un valor de 700 nm y calibrar un blanco a cero con agua.

Preparar 3 mL de las siguientes diluciones de CuSO4 usando agua destilada: 1:2, 1:5, 1:10, 1:50, y 1:100.

Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para cada dilucin.
1.7.2. Dilucin simple 2

Asumiendo que la solucin estndar de CuSO4 es 5X, preparar las siguientes diluciones: 0,5X, 1X, 2X.

Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para cada dilucin.
1.7.3. Diluciones en serie

Preparar las siguientes diluciones de CuSO4 usando dilucin en serie: 1:5, 1:25, 1:125, y 1:625.

Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para cada dilucin.
1.7.4. Aplicacin experimental

Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para las soluciones o diluciones de
concentracin desconocida.
1.8. Disposicin de los residuos
Tabla. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Recipiente rotulado
Todos sern descartados en el recipiente indicado
Residuos acuosos
1.9. Consultar antes de la prctica
a) Una disolucin que contiene 4.48 ppm de KMnO4 presenta una transmitancia de 0.309 en un cubeta de
1.00 cm a 520 nm. Calcular la absortividad molar del KMnO4.
b) El complejo FeSCN+2, cuya longitud de onda de mxima absorcin es 580 mn, tiene una absortividad molar
de 7.00 X 103 L cm-1 mol-1. Calcular:

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1. La absorbancia a 580 nm de una disolucin del complejo 2.50 X 10-5M,si se mide en una cubeta de
1.00 cm
2. La absorbancia de una disolucin del complejo cuya concentracin es el doble de la del apartado
anterior.
3. La trasmitancia de las disoluciones descritas en los apartados 1 y 2.
4. La absorbancia de una solucin cuya transmitancia es la mitad de la descita en el apartado 1.
c) La constante de equilibrio del par cido/base conjugado:
Es 8.00 X 10-5. A partir de la siguiente informacin
Especie
Mximo de absorcin,
nm
Absortividad Molar
430 nm
600nm
HIn
430
8.04X103
1.23X103
In-
600
0.775X103
6.96X103
1. Calcular la absorbancia a 430 nm y a 600 nm de las disoluciones de indicador con las siguientes
concentraciones: 3,00 x 10-4 M; 2,00 X 10-4; 1,00 X 10-4 M; 0,500 X 10-4 M y 0,250 X 10-4 M.
2. Representar grficamente la absorbancia como funcin de la concentracin de indicador.
Referencias bibliogrficas
1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA.
Bioqumica: aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega. Captulo 3
(2006).
3) Skoog D. A., West D. M. y Holler F.J., "Fundamentos de Qumica Analtica". Ed. Reverte.
Barcelona. 1997.

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2. DETERMINACIN EXPERIMENTAL DEL pH Y
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
No presenta indicadores de peligro
2.1. Objetivos
Determinar el pH de una solucin utilizando mtodos colorimtricos o
potenciomtricos.
Reconocer la capacidad tampn de aminocidos y protenas
Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de las soluciones tampn
de importancia biolgica.
2.2. Conceptos relacionados
Concepto de cido-base, ionizacin del agua, definicin de pH y pKa, ecuacin de
Henderson-Hassenbalch, capacidad tampn, valores de pKa de aminocidos.
2.3. Fundamento terico
El pH de una solucin acuosa se define como el logaritmo negativo de la concentracin
molar de hidrogeniones (H3O+). La determinacin de pH es muy importante, ya que
influencia de manera directa en la carga de la molcula y en su actividad biolgica. El
producto
inico del agua es la base de la escala del pH propuesta por Srensen (:kW=[ H+] [ OH -] =
10-14, pH = -log [ H+]).
La escala de pH permite expresar la concentracin de iones hidronio (protn
hidratado) comprendida entre 1M y 1X10-14 M, extremos que corresponden a pH 0 y 14, la
neutralidad es igual a pH 7.0.
La manera mas conveniente y exacta de determinar el pH es usando un electrodo de vidrio.
Este electrodo depende del intercambio de iones en las capas hidratadas formadas sobre
la superficie del electrodo de vidrio.

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Generalmente se utiliza vidrio compuesto de aproximadamente 22% de Na2O, 6% de
CaO y 72% de SiO2. Este vidrio muestra una especificidad hacia los iones hidrgeno hasta
un
pH de cerca de 9; a valores mayores de pH, la membrana se vuelve sensible a iones
sodio y otros iones alcalinos. Esto se evita empleando membranas construidas con vidrio en
que el sodio se remplaza por litio. El electrodo de vidrio debe mantenerse en agua
destilada o en solucin de KCl saturada para evitar el crecimiento de microrganismos.
En el electrodo de vidrio est presente un electrodo de referencia interno de
plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) rodeado por un electrolito de HCl 0.1M. Este electrodo de
referencia interno produce un potencial estacionario.
El electrodo de vidrio acta como una batera cuyo voltaje depende la actividad del H+ de la
solucin en que est sumergida. En el pHmetro, el electrodo de vidrio y el electrodo de
referencia de calomel, estn diseados para que a pH 7 d un potencial cero. Antes de
medirse el pH de una solucin desconocida el pHmetro se estandariza con soluciones
amortiguadoras de pH conocidos.
El voltaje depende de la temperatura, por lo que los potencimetros tienen un control de
ajuste para la temperatura de la solucin. Los electrodos de vidrio son frgiles y caros, por
lo
tanto deben manejarse con cuidado. Si se mide el pH de soluciones de protenas, se puede
formar una capa delgada en el electrodo la cual puede removerse sumergiendo en HCl
0.1N, y despus limpiando con detergente diluido y enjuagando con agua.
Por otro lado, las soluciones amortiguadoras (buffers o soluciones tampn), son aquellas
capaces de mantener el pH dentro de un rango de variacin mnima. Estn formadas
generalmente por un cido dbil y su base conjugada cuando se trabaja a pHs por debajo de
7. En el caso de pHs alcalinos se usa una base dbil con su cido conjugado respectivo. La
eficiencia de una solucin reguladora est regida por dos factores: (a) La concentracin
total
del regulador (suma de las concentraciones del cido dbil y de la sal). Cuanto ms
concentrado sea un regulador, ms tolerante ser a la adicin de cidos o bases fuerte. (b)
Por la relacin existente entre la base conjugada y el cido. Cuando esta relacin es igual a
1,
la solucin reguladora tiene su mxima eficiencia.

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Este valor se alcanza cuando el pH del regulador es igual al pKa de cido. La
E=ecuacin de Henderson y Hasselbalch, es muy til para la preparacin de las soluciones
amortiguadoras. (pH = pKa + log [sal]/ [cido]). El pH mas adecuado para que una
solucin amortiguadora funcione eficientemente, es cuando se encuentra en un rango de
pH igual a su pKa 1.
2.4. Materiales
2.5. Equipos
PHmtro
2.6. Sustancias
Soluciones tampn de pH 3,5,7,9 y
10
Indicador universal
cido brico
Fosfato de sodio monobsico
(NaH2PO4)
NaOH 0.1 M
cido ortofosfrico
HCl O.1 M
cido actico glacial
Fosfato
de
sodio
dibsico
(Na2HPO4.7H2O)
2.7. Procedimiento
1.
Determinacin del pH mediante el mtodo potenciomtrico.
1) Preparacin de soluciones en un rango de pH de 3-10:
Pesar 0.5 g de cido brico y disolver en un 100mL de agua destilada, adicionar 560 L de
cido ortofosfrico y 480 L de cido actico glacial, completar hasta 200 mL de agua
destilada. El pH de la solucin da alrededor de 1.9.
8 tubos de ensayo
Pipetas (5-10 mL)
Varillas de agitacin
3 vasos de precipitados (50 o 100
mL)

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A partir de esta solucin, a 25 mL de la solucin anterior adicionar NaOH 0.2 M, con ayuda
de una bureta, para obtener diferentes pHs. Realizar los clculos tericos del volumen de
NaOH para obtener soluciones a pH 3,5, 7,9 y 10. Comparar estos datos con los obtenidos
experimentalmente.
2) Preparacin de una solucin tampn de fosfato 0.1M a pH 7.0
A) Pesar 2.78 g de fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4) y disolver en agua en un baln
volumtrico de 100 mL, para obtener una solucin de 0.2M.
B) Pesar 5.365 g de fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4.7H2O) o 7.17g
(Na2HPO4.12H2O) y disolver en agua en un baln volumtrico de 100 mL, para
obtener una solucin de 0.2M.
Mezclar 9,75 mL de la solucin A con 15,25 mL de la solucin B y diluir hasta 50 mL para
obtener una solucin tampn de fosfato 0.1M a pH=7.0.
La tabla 1 contiene los volmenes de las soluciones A y B necesarios para obtener
soluciones tampn de fosfato a diferentes pHs. Determinar el pH terico y experimental.
Tabla 1. Relacin entre los volmenes de las soluciones A y B para obtener diferentes
pHs.
A (mL) B(mL) pH
A(mL) B(mL) pH
23.5
1.5
16
9
23
2
15
10
22,5
2,5
14
11
22
3
13
12
21.5
3.5
12
13
21
4
11
14
20.5
4.5
10
15
20
5
9
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18
18
7
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8
3
22
2. Determinacin del pH mediante el mtodo colorimtrico.
1) Preparacin de las soluciones con papel universal:
Pesar 0.05g de naranja de metilo, 0,15g de rojo de metilo, 0.30g de azul de bromotimol,
0.35g de fenolftalena y el 66% de alcohol etlico a un litro.
Escala estndar
Preparar una batera de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo de ensayo 1mL de las
soluciones preparadas en un rango de pH de 3-10. Adicionar 5 gotas de indicador universal
y 9 mL de agua destilada.
Experimentacin
Experimento 1: Determinacin del pH.
Tubo 1: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 2: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Tubo 3: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 4: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Determinar el pH de cada solucin y anotar los resultados en una tabla
Experimento II: Capacidad amortiguadora
Tubo 1: Adicionar una gota de NaOH 0.1M + 9 mL de agua destilada
Tubo 2: 9 mL de solucin amortiguadora a pH= 7.0+ una gota de NaOH 0.1M

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*Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.
Soplar por 15 segundo el tubo 1 y por un minuto el tubo 2. Observar el cambio de color,
determinar el pH (pHmetro) y anotar en una tabla.
Tubo 3: 9 mL de agua destilada+ 2 gotas de HCl 0.1M +
Tubo 4: 9 mL de solucin amortiguadora a pH= 7.0+ 2 gotas de HCl 0.1M
Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.
Continuar adicionando gota a gota HCl 0.1M al tubo 4 hasta obtener el mismo color del
tubo
3. Determinar el nmero de gotas. Qu pueden concluir?.
2.8. Disposicin de los residuos
Tabla 2. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Recipiente rotulado
Todos sern descartados en el recipiente indicado
Residuos acuosos
2.9. Consultar antes de la prctica
1) Colocar en orden decreciente de acidez las siguientes soluciones: CH3COOH 1M,
agua, NaOH 1M y HCl 1M.
2) Calcular la [H+] y [OH-] que estn presentes en una solucin de HCl 1 mM.
3) Calcular la concentracin de protones, en mol/L, de una solucin de cido actico 1M,
sabiendo que la Ka del cido actico a 25C es de 1.86*10-5.
4) Calcular el punto isoelctrico de la Glicina sabiendo sus valores de pKa1=2.4 y
pKa2=9.7.
5) Calcular el valor del pH de una solucin de a) 1mM de H2SO4, b) 1mM de NaOH,
asumiendo que en ambos los solutos estn completamente ionizados. Cul sera el

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valor del pH de la solucin resultante de la mezcla de 25 mL de H2SO4 con 20 mL de
solucin de NaOH?
Referencias bibliogrficas
1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry.
Fifth edition. Cambridge University Press.
2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA.
Bioqumica: aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
3. Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega.
Captulo 3 (2006).
4. Observaciones Oveimar

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3. DISEO DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS II
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
3.1. Objetivos
Explorar las caractersticas de los sistemas amortiguadores y la forma como
mantienen valores constantes de pH.
Determinar la Ka para un cido dbil o Kb para una base dbil.
Preparar una solucin amortiguadora de un pH determinado.
Predecir la magnitud del cambio de pH cuando se adiciona acido o base a una
solucin amortiguadora.
3.2. Conceptos relacionados
Soluciones tampn, equivalentes cido-base, equilibrio inico, producto inico del agua,
contante de disociacin del agua, capacidad amortiguadora.
3.3. Fundamento terico
Las soluciones amortiguadoras son crticas en los procesos biolgicos y en general los
seres vivos utilizan diferentes tipos de soluciones amortiguadoras para controlar el pH a la
cual se llevan a cabo las reacciones.
Una solucin amortiguadora es una sustancia que mantiene constante el pH despus de la
adicin de pequeas cantidades de cido o base. Un sistema de este tipo, consiste de un
cido o base dbil y su respectiva sal, por ejemplo el cido carbnico y el bicarbonato de
sodio son un sistema amortiguador.

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El pH de una mezcla amortiguadora se puede conocer mediante la ecuacin de
Henderson-Hasselbalch:
A partir de esta frmula se pueden deducir fcilmente las propiedades de los
amortiguadores:
1.- El pH de una disolucin amortiguadora depende de la naturaleza del cido dbil que lo
integra (de su pKa), de modo que para cantidades equimoleculares de sal y de cido, el pH
es justamente el pKa de este cido. Dicho de otra forma, se puede definir el pKa de un
cido dbil como el pH del sistema amortiguador que se obtiene cuando [sal] = [cido]
(Figura de la derecha).
2.- El pH del sistema amortiguador depende de la proporcin relativa entre la sal y el
cido, pero no de las concentraciones absolutas de estos componentes. De aqu se
deduce que aadiendo agua al sistema, las concentraciones de sal y cido disminuyen
paralelamente, pero su cociente permanece constante, y el pH no cambia. Sin embargo, si
la dilucin llega a ser muy grande, el equilibrio de disociacin del cido se desplazara
hacia
la derecha, aumentando la [sal] y disminuyendo [cido], con lo cual el cociente aumenta y
el pH tambin, de forma que se ira acercando gradualmente a la neutralidad (pH 7).
3.- Cuando se aaden cidos o bases fuertes a la disolucin amortiguadora, el equilibrio se
desplaza en el sentido de eliminar el cido aadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la
base aadida (hacia la derecha). Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de
sal y cido en el equilibrio. Como el pH vara con el logaritmo de este cociente, la
modificacin del pH resulta exigua hasta que uno de los componentes est prximo a
agotarse

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Como ejemplo de lo anterior, la adicin de 10 mL de una solucin 0,10 m de NaOH a 1 L
de agua destilada incrementa el pH de en 4 unidades (de 7 a 11). Para una solucin que
contiene 0,20 mol/L de cido etanoco (CH3COOH) y etanoato de sodio (CH3COONa)
su pH es de 4,76.
Cuando se le agregan cantidades moderadas de un cido o una base a esta ltima solucin,
el pH experimenta pocos cambios; as tendremos que la adicin de 10 mL de una solucin
de NaOH 0,10 M en un litro de la solucin de cido etanoco (CH3COOH) y etanoato de
sodio (CH3COONa), incrementa el pH en 0,01 unidades, es decir el nuevo pH de la
solucin es 4,77.
Por lo que tendremos que una solucin amortiguadora es capaz de resistir cambios en el
pH en comparacin al agua pura, o en comparacin con un cido al cual se le agrega cierta
cantidad de base, o lo contrario, una base a la cual se le agrega cierta cantidad de cido.
Por ejemplo la solucin amortiguadora preparada entre cido etanoco (CH3COOH) y
etanoato de sodio (CH3COONa):
El cido etanoico y su anin CH3COO- reacciona con los iones H+ u OH- que puedan ser
agregados a la solucin. Cuando un cido se aade a esta solucin, el ion etanoato
reacciona formando cido etanoco, el cual no se disocia completamente en agua
(electrolito dbil) de acuerdo a la siguiente reaccin:

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De esta forma el pH de la solucin no cambia.
Cuando una base se aade a esta solucin, el cido etanoico reacciona con los iones OH-,
de acuerdo a la siguiente reaccin:
Debido a que el ion etanoato no es una base lo suficientemente fuerte para aceptar iones
H+ del agua, el pH de la solucin no presenta cambios significativos.
Una solucin amortiguadora no puede actuar de forma eficiente si se adiciona cido o
base es adicionado al sistema. La cantidad de cido o base que se puede agregar a una
solucin amortiguadora antes de cambiar de forma significativa su pH de denomina
capacidad de amortiguacin o capacidad buffer.
Ejemplos de soluciones amortiguadoras importantes corresponden al sistema cido
carbnico anin bicarbonato, responsable de mantener el pH de la sangre dentro del
intervalo pequeo de variaciones, indispensable en los humanos.
3.4. Materiales
Esptula
Erlenmeyer de 250 mL
pH metro
Pipeta de 10 mL
Vaso de preciptado de 250 mL

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3.5. Sustancias
Cloruro de sodio (NaCl) 0,1 M
Hidrogenosulfato
de
sodio
(NaHSO4)0,1 M
Acetato de sodio (CH3COONa)
0,1 M
cido actico (CH3COOH) 0,1 M
Carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M
Hidrogenocarbonato de sodio
(NaHCO3)0,1 M
Hidrxido de sodio (NaOH) 0,1 M
cido clorhdrico (HCl) 0,1 M
3.6. Procedimiento

Escribir las ecuaciones netas para soluciones de NaCl, NaHSO4, CH3COONa,
CH3COOH, Na2CO3, y NaHCO3 0,1 M, y calcular los valores de pH de forma
terica.

Usar un pH metro para medir los valores de pH de las soluciones anteriores.

Preparar soluciones amortiguadoras 0,1 M de: CH3COOH, CH3COONa, Na2CO3
y NaHCO3. Realizar los clculos tericos de pH y compararlos con los resultados
experimentales obtenidos.

Tomar 25 mL de la solucin cida y mezclarla con 25 mL de la sal. Medir el pH de
la solucin amortiguadora. Escribir las reacciones respectivas y realizar los clculos.

Dividir la solucin anterior en 2 volmenes iguales. Adicionar 1 mL de NaOH 0,1
M a una mitad y HCl 0,1 M a la otra mitad. Registre el pH de estas soluciones
despus de la adicin.

Poner 25 mL de agua destilada en dos erlenmeyers y medirles el pH. Adicionar 1
mL de NaOH 0,1 M a uno y HCl 0,1 M al otro. Registrar el pH de estas soluciones
despus de la adicin.

Preparar una solucin amortiguadora mezclando 1 mL de la solucin cida y 10 mL
de la base conjugada. Medir el pH. Calcular con estos datos el pKa y el Ka del cido.

Preparar una solucin amortiguadora mezclando 10 mL del cido y 1 mL de
solucin de la base conjugada. Medir el pH y calcular con estos datos el pKa y el Ka.
Comparar resultados con el punto anterior.

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3.7. Disposicin de los residuos
Tabla. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Recipiente rotulado
Todos sern descartados en el recipiente indicado
Residuos acuosos
(Buffer)
3.8. Consultar antes de la prctica
1. Porque el pH del potencimetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10?
2. Porque el electrodo se tiene que mantener en una solucin de KCl
saturado? En caso de no contar en el laboratorio con KCl, Que otros
compuestos pueden usarse?
3. Si quisieras preparar un buffer de fosfatos de potasio pH 11, Qu sales
seleccionaras?
4. El buffer de acetato de sodio que preparaste est a un pH que se puede
considerar adecuado para servir como solucin reguladora? .Explica tu
respuesta.
5. En la preparacin del acetato de sodio, cual es el cido y cual la base
conjugada.
Referencias bibliogrficas
1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical
Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice.
1st edition. Waveland Press, Inc. USA.
3. Douglas A. Skoog and Donald M. West.1971. Principles of Instrumental
Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc.
4. Rodney F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The
Benjamin/Cummings
Publishing
Company,
Inc.

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4. ANLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEINAS
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
3 horas
Ninguna
4.1. Objetivos
Obtener la estructura primaria de protenas de bases de datos
Analizar la estructura secundaria y terciaria de protenas obtenidas en bases de datos.
Usar visualizadores de protenas.
4.2. Conceptos relacionados
Pptidos, estructura secundaria, protenas, -hlice y hoja .
4.3. Fundamento terico
Los pptidos (del griego , pepts, digerido) son un tipo de molculas formadas por la
unin de varios aminocidos mediante enlaces peptdicos.
Figura 1. Reaccin de formacin del enlace peptdico.
El enlace peptdico es un enlace covalente entre el grupo amino (NH2) de un aminocido
y
el grupo carboxilo (COOH) de otro aminocido. Los pptidos y las protenas estn
formados por la unin de aminocidos mediante enlaces peptdicos. El enlace peptdico

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implica la prdida de una molcula de agua y la formacin de un enlace covalente CO-NH.
Es,
en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir aadiendo aminocidos al pptido,
pero siempre en el extremo -COOH terminal.
Los pptidos, al igual que las protenas, estn presentes en la naturaleza y son responsables
por un gran nmero de funciones, muchas de las cuales todava no se conocen.
La unin de un bajo nmero de aminocidos da lugar a un pptido, y si el nmero es alto, a
una protena, aunque los lmites entre ambos no estn definidos. Orientativamente:
Oligopptido: de 2 a 9 aminocidos.
Polipptido: entre 10 y 100 aminocidos.
Protena: ms de 100 aminocidos.
Las protenas con una sola cadena polipeptdica se denominan protenas monomricas,
mientras que las compuestas de ms de una cadena polipeptdica se conocen como
protenas
multimricas.
La estructura secundaria de las protenas es el plegamiento regular local entre residuos
aminoacdicos cercanos de la cadena polipeptdica. Se adopta gracias a la formacin de
enlaces de hidrgeno entre los grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos
involucrados en las uniones peptdicas de aminocidos cercanos en la cadena. Estos
tambin
se los encuentra en forma de espiral aplana.
Hlice alfa: En esta estructura la cadena polipeptdica se desarrolla en espiral sobre s
misma
debido a los giros producidos en torno al carbono beta de cada aminocido. Esta estructura
se mantiene gracias a los enlaces de hidrgeno intracatenarios formados entre el grupo el
grupo -C=O del aminocido "n" y el -NH del "n+4" (cuatro aminocidos ms adelante en la
cadena). Un ejemplo particular es la Hlice de colgeno: una variedad particular de la
estructura secundaria, caracterstica del colgeno, protena presente en tendones y tejido
conectivo.Existen otros tipos de hlices: Hlice 310 (puentes de hidrgeno entre los
aminocidos "n" y "n+3") y hlice (puentes de hidrgeno entre los aminocidos "n" y
"n+5"), pero son mucho menos usuales.
Hoja plegada beta o -plegada: Cuando la cadena principal se estira al mximo que
permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuracin espacial denominada cadena

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beta. Algunas regiones de protenas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre s
estableciendo uniones mediante enlaces de hidrgeno intercatenarios. Todos los enlaces
peptdicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo as gran estabilidad a la
estructura. La forma en beta es una conformacin simple formada por dos o ms cadenas
polipeptdicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en
direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrgeno y
diversos arreglos entre los radicales libres de los aminocidos. Esta conformacin tiene una
estructura laminar y plegada, a la manera de un acorden.
Giros beta-: Secuencias de la cadena polipeptdica con estructura alfa o beta, a menudo
estn conectadas entre s por medio de los llamados giros beta. Son secuencias cortas, con
una conformacin caracterstica que impone un brusco giro de 180 grados a la cadena
principal de un polipptido.
Figura 2. Principales estructuras secundarias de las protenas: (A) -plegada, Tachiplesina
I;
(B) -hlice, Magainina 2, (C) Giros beta-. [4-6]
4.4. Materiales
4.5. Equipos
Computador con conexin a internet.
Secuencias de protenas obtenidas
de bases de datos.
(C)

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4.6. Sustancias
No sern usadas sustancias en este
laboratorio por tratarse de una
prctica de bioinformtica.
4.7. Procedimiento
Existen muchas bases de datos en donde se pueden encontrar las secuencias en aminocidos
y cidos nucleicos de protenas.
Para esta prctica usted har uso de estas bases de datos y escoger 4 secuencias problema
(de 4 proteinas diferentes) a las cuales les deber realizar los anlisis descritos desde el tem
b
al f.
a. Ingrese a la pgina de protein data bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
En esta pgina puede buscar protenas por palabras claves. Escoja 4 protenas
diferentes.
b. Descargue la secuencia de la protena en formato FASTA y en formato PDB.
c. Reporte el nmero de residuos de aminocidos, punto isoelctrico, el nmero de
hojas y de -hlices.
d. Descargue un visualizador de protenas, en internet se encuentran varios para esta
prctica
se
recomienda
uno
de
los
ms
sencillos
http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm, siga las instrucciones e instale el
programa.
e. En el visualizador RasMol abra cada una de las protenas descargadas en el tem a (en
formato PDB), resalte las estructuras secundarias y juegue con el visualizador.
4.8 Responda las siguientes preguntas:
a. Qu informacin adicional es reportara en la pgina de la protein data bank?
b. De dnde sale la informacin reportada en la pgina?

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Referencias bibliogrficas
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M. Principles of Biochemistry, Worth Publishers,
2 edicin, 1997.
2. D.Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial Mdica
Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid, 2007.
3. Eric Martz. University of Massachusetts, Amherst MA USA. July 12,
2008. http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm.
4. Lamberty M, Caille A, Landon C, Tassin-Moindrot S, Hetru C, Bulet P, Vovelle F.
Solution structures of the antifungal heliomicin and a selected variant with both
antibacterial and antifungal activities. Biochem 2001; 40(40):1199512003.
5. Haney F, Hunter H, Matsuzaki K, Vogel H. Solution NMR studies of amphibian
antimicrobial peptides: Linking structure to function?. Biochim Biophys Acta 2009;
1788(8):1639-55.
6. Koradi R, Billeter M, Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of
macromolecular structures. J Mol Graph 1996;14(1):2932.

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5 MTODOS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS: Mtodo
de Bradford, Biuret y Lowry.
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
No presenta indicadores de peligro
5.1. Objetivos
Comparar los mtodos de cuantificacin de protenas.
Determinar el rendimiento y pureza de una protena: Casena.
Apreciar el uso de las tcnicas espectrofotomtricas para la cuantificacin de material
biolgico.
5.2. Conceptos relacionados
Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva de calibracin,
casena,
reactivo de Lowry.
5.3. Fundamento terico
Para el estudio de la estructura de una protena, de la actividad de una enzima o el
contenido
protenico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentracin de las
protenas.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la
formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de formar
complejos.
Entre los mtodos que se basan en la formacin de complejos colorimtricos entre las
protenas y reactivos especficos se encuentran: