FACULTAD DE PESQUERA

DEPART. DE ACUICULTURA E INDUSTRIAS PESQUERAS

CURSO: MICROBIOLOGIA PESQUERA
TEMA: Cultivo y Siembra de Microorganismos
PROFESOR: Ing. Nancy Martnez Ordinola
Ciclo: 2014-II
FECHA EJ ECUTADA: 15/09/14
FECHA ENTREGA:

APELLIDOS Y NOMBRES CDIGO
Jaramillo Diaz Lister 20111327


Lima Per
2014


INTRODUCCION

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo.
Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una
muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite
obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el
rea de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que stos penetren y contaminen los cultivos en estudio.
Por otra parte, para considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones
ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y
concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales como la temperatura,
aireacin la luminosidad.
La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos
mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el
estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y
cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.

Objetivo general

Determinar al el manejo y utilidad de los diferentes mtodos de siembra y cultivo de
microorganismos.
Objetivo Especifico
Realizar experimentalmente las distintas tcnicas de siembra para el aislamiento
microbiano.
Comparar la unidad practica de cada uno de los mtodos de siembra con respecto al
crecimiento observado tanto en medio slido como en lquido.
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de
bacterias.
















Revisin literaria

CULTIVO DE MICROORGANISMOS
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y
nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos
distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos
discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono
que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico
(microorganismos que fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono orgnico. (BROCK, T;
2002).

MTODOS DE AISLAMIENTO
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los
casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo
de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de
forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se
produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon
bacteriano).
Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son
cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrnsecas en el
cultivo (microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos
especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse
en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofa por ejemplo). Se estima que en slo en
torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables.
Existen procedimientos de enriquecimiento del nmero de bacterias de ambientes naturales
para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un
microcosmos para enriquecer el nmero de ciertos tipos de microorganismos presentes en
ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento (BROCK, T; 2002).

CONCEPTO DE CULTIVO PURO
Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos. Los
cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del
mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para poder
estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad.
Sin embargo, cada vez se va conoce ms sobre el funcionamiento de las comunidades
bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone
unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologa de los microorganismos en
ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros
(BROCK, T; 2002).






Medios slidos:
Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y sobre el
mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza para
microorganismos aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin. Una vez
solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la
capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este mtodo se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y micro aeroflicos.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido,
se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con ayuda de una esptula
de Drigalsky se extiende el inculo hasta su absorcin total por el medio de cultivo.
Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se
deja solidificar (Ortega; 2009).

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO
Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen
en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas
libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro
fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las
nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para
iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo
de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los
nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con los
modelos matemticos que describiremos a continuacin (BROCK, T; 2002).


Fuente: BROCK, T; 2002


TCNICAS DE SIEMBRA
A. El mtodo de siembra por estra en placa:
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un
asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen
estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas
Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van
haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del
medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin
donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma
tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces
se logra separar clulas individuales. A continuacin, las placas se incuban en un
lugar adecuado, permitiendo que las clulas aisladas experimenten un nmero
suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia
posiblemente representa un clon derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo.
Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica
colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axnico,
conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera
placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda seguridad,
cultivos axnicos. (Santambrosio, Ortega, Garibaldi; 2009).

Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa para obtener un cultivo axnico:
(a) Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero
(b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra.
(c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri.
(d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un
segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una
tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y
se separen clulas aisladas.
(e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de
que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia
aislada y sembrar por estras una segunda placa.

Fuente: Santambrosio, Ortega, Garibaldi; 2009



B. Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa
En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su
siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo,
una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para
obtener una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan
diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de
cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin
bacteriana a 9 ml (le medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita
vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario.
A continuacin, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el mtodo de vertido
en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa.
Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Las
colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo mtodo
(extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de
la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Digralsky de cristal estril. La
suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie.
En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el
mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen
en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el
mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las
dos tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un
mayor nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se
eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante este mtodo:

(a) Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener una muestra con
slo unos pocos cientos de bacterias.
(b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter el contenido en
una placa Petri.
(c) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms pequeas) y en su
superficie (ms grandes).

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de
nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo,
lquido o slido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios slidos se
hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos.

Observacin de las bacterias, Observacin macroscpica:
El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman
sobre medios slidos s son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de caractersticas
que nos ayudan a su identificacin. A nivel morfolgico, podemos estudiar la forma de las
colonias, su tamao, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.),
presencia de bri llo, col or, etc. Incl uso sobre medio lquido las bacter i as producen
modificaciones de i nters para su clasificacin y que tienen que ver
esencialmente con las caractersticas de su metabolismo. As se observa si la turbidez es
uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.


MATERIALES Y METODOS
A. TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE
Materiales:
Dos Tubos con agar nutritivo en posicin vertical
Dos Tubos con agar nutritivo en posicin inclinada
Dos Tubos con agar TSI (triple azcar hierro) en posicin semiinclinada
Dos con caldo nutritivo
Tubos con cultivos puros de m.o. de 18 a 24 horas: Bacillus subtil, Bacillus
aureus
Asa y aguja de kolle, esptulas drigalsky, plumn.
Modo operativo
Anotar el nmero o nombre de la cepa, nmero de mesa
Esterilizar la aguja o asa de kolle a la llama del mechero :

Tomar con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa, destaparlo:


Con los dedos meique y anular de la mano derecha que est sosteniendo el
asa de kolle esterilizado.
Flamear la boca del tubo
Introducir la aguja de kolle esterilizada en el tubo que contiene la cepa y
proceder a sacar inoculo (porcin de cultivo que se requiere repicar), luego
colocarle rpidamente su respectivo tapn:


Destapar el otro tubo de igual forma que el anterior e introducir rpidamente el
inoculo en el medio virgen, haciendo una picadura profunda en el agar en
posicin vertical, por estras en el agar inclinado, por suspensin en el medio
lquido y por estras y picadura profunda en el agar semiinclinado:


Flamear la boca del tubo y taponar.
Esterilizar la aguja o asa de kolle
Incubar en la estufa a 37C por 24 horas.

B. CULTIVO POR AISLAMIENTO

1) Aislamiento por agotamiento de superficie con aguja de kolle.
Materiales:
Placas con agar XLD (Agar xilosa lisina desoxicolato)
Cultivo impuro
Asa de kolle

Modo operativo:
Esterilizar a la llama, la aguja o asa de kolle
Tomar inoculo
Abrir la placa conteniendo el medio de cultivo, con la mano izquierda
Trazar sobre la superficie del medio, 4 lneas paralelas sin daar el agar
Esterilizar el asa de kolle a la llama y enfriar.
Luego sin tomar inoculo, trazar otras 4 rayas partiendo de los extremos de
las 4 primeras estras
Se esteriliza el asa de kolle y se realiza la operacin anterior.
Se realiza una sola estra hacia el centro
Cerrar la placa e incubarla (siempre invertida) a 37C x 18 a 24h.





2) Aislamiento por dilucin.

a) Por agotamiento en superficie
Materiales:
Placas con PCA (Plate count agar)
Tubos conteniendo diluciones hechas a partir de una muestra de
pescado
Pipetas serolgicas estriles de 1 ml.
Esptulas drigalsky

Modo operativo

Tomar 3 placas conteniendo el medio PCA sealarlas con las diluciones

10
1
, 10
-2
, 10
-3
Con una pipeta estril de 1 ml., tomar 0.1 ml. de la dilucin 10
-3
y
colocarla en la placa correspondiente, con la misma pipeta, tomar 0.1 ml
de la dilucin 10
-2
y colocarla en su respectiva placa y finalmente tomar
0.1 ml de la dilucin 10
-1
y colocarla en la placa respectiva.


Con la esptula de extensin esterilizada, extender el inoculo por toda la
superficie, empezando por la mas diluida (10
-3
).




Incubar las placas a 37C por 24 h.
b) Por derrame o vertido en placa
Materiales:
Medio PCA
Placas petri estriles
Diluciones a partir del msculo de pescado
Pipetas estriles

Modo operativo:
Sealar 3 placas estriles, identificando las diluciones y las respectivas
anotaciones
Con una pipeta estril de 1 ml., tomar 1 ml. de la dilucin 10
-3
y dejar
caer dentro de toda la placa estril


Con la misma pipeta, hacer lo mismo con las otras diluciones.
Colocar aprox. 15 ml. de medio PCA (debe estar a una
temperatura de 45C aproximadamente) dentro de las placas,
sobre el inoculo, mezclar bien mediante movimientos suaves.





Esperar que solidifique el medio
Colocar en la estufa de 37C por 24 horas
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentracin de
agua en el medio puede provocar condensacin durante la
incubacin y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando
un crecimiento confluente.


RESULTADOS
METODO DE SIEMBRA
CEPAS: M1-2, M2-7
A. TRANSPLANTE, RESIEMBRA O REPIQUE.
AGAR RECTO (SIEMBRA POR PICADURA PROFUNDA)
Desarrollo limitado
No hay desarrollo a travs del tubo
No hay cambio de coloracin
AGAR INCLINIDADO (SIEMBRA POR ESTRIAS)
cantidad : escaso
borde de crecimiento: irregular
consistencia: viscoso
no hay cambio de coloracin.
AGAR SEMIINCLINADO (SIEMBRA POR PICADURA PROFUNDA Y POR ESTRIAS)
No hay cambio de coloracin, por la parte vertical ni por la parte inclinado
CALDO NUTRITIVO
Cantidad: moderada
Distribucin del crecimiento: velo o pelcula
Color lechoso





B. CULTIVO POR AISLAMIENTO: (CUADRO N3)
1) Aislamiento
por dilucin:
Por
agotamiento
en superficie




2) Aislamiento
por dilucin:
Por derrame
o vertido en
placa

































DISCUCIONES DE RESULTADOS

El cultivo de microorganismos es una tcnica que puede llevarse a cabo al proporcionar a los
microorganismos un medio favorable para su crecimiento. Ello significa que las nuevas clulas
dispongan de los nutrimentos necesarios en forma adecuada para emplearlos como materiales
sintticos, una fuente de energa y temperatura, oxigeno y otros factores que sean
adecuados. (Carpenter, 1969).
La siembra en placa a partir de dilucin permite cultivar los microorganismos ya que posee los
nutrientes necesarios para su desarrollo. En el experimento realizado se pudo observar que a
mayor concentracin aumenta el desarrollo de los microorganismos.
En relacin a la elevacin se observo un desarrollo de colonia difuso, es decir no se pudo
detectar si estas eran aplanadas o elevadas. En cuanto a la estructura interna se aprecio el
desarrollo de colonias transparentes, es decir, que permiten el paso de la luz a travs de ella y
se observo colonias opacas que por lo contrario impiden el paso de la luz.
Las formas observadas fueron circular e irregular, de igual modo la superficie de las mismas, se
apreciaron lisas, rugosas y anillos concntricos.
No hay una explicacin adecuada para la variacin en la apariencia de las colonias, sin
embargo, parece que son consecuencia de la velocidad de crecimiento, la morfologa celular, la
tendencia para formar cadenas o filamentos (Walter, 1980).
El crecimiento bacteriano realizando la siembra por estra no fue claramente observable,
presentando por presentar, supuestamente, una forma de desarrollo en colonias separadas.
Cabe suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola clula y, por tanto un
cultivo puro (Pelczar, 1977).
Entre las principales caractersticas de las bacterias figuran su tamao, su forma, su estructura
y tipo de agrupacin. Estas caractersticas constituyen la morfologa de la clula bacteriana y la
definen en un grupo taxonmico. (Pelczar, 1977).
En la siembra en tubos se pudo permitir claramente el crecimiento de microorganismos
presentando forma de desarrollo filiforme y predominando la consistencia viscosa.
Un organismo mvil crece solamente siguiendo la lnea de inoculacin por picadura
(Carpenter, 1969).
En este tipo de siembra se observa el crecimiento de microorganismos mediante el
enturbiamiento del medio de cultivo, la formacin de sedimento, desarrollo floculante y
formacin de membrana.
Estas son caractersticas que evidencian el desarrollo de los microorganismos en medio lquido.
Un organismo se disemina de la lnea de inoculacin a toda la masa de Agar hasta la pared del
tubo de ensayo, con lo que se produce turbidez en el medio de cultivo. (Carpenter, 1969)











CONCLUSIONES


Por medio de esta prctica se logr utilizar las tcnicas aprendidas durante el
transcurso del curso. Se logr aprender a realizar algunos de los mtodos que existen
para cultivar bacterias y de esta manera observar sus caractersticas tanto
macroscpicas como microscpicas e interpretacin de las mismas, con lo que se
observ
El desarrollo de microorganismos anaerobios facultativos en un medio lquido se
manifiesta a travs de la turbidez.
El crecimiento bacteriano realizado en la siembra en placas por estra no fue
claramente observable.
El crecimiento microbiano obtenido en la siembra por puncin manifiesta la existencia
de microorganismos aerobios.
En la siembra por puncin y estra se desarrollo un tipo de crecimiento filiforme.
El desarrollo de colonias formadas a partir de las diluciones seriadas presentan
caractersticas que difieren en forma, borde, elevacin, superficie y estructura interna,
lo cual es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del
medio en el cual dichas colonias se desarrollan.



RECOMENDACIONES


Esterilizar el rea antes de iniciar el trabajo.
En el momento de realizar la siembra la aguja y asa de platino deben esterilizarse por
calentamiento hasta rojo vivo.
Debe asumirse que todas las superficies expuestas tales como la de las manos, las
mesas, instrumentos y aun los exteriores de los utensilios recin esterilizados estn
contaminadas.
Al salir del laboratorio lavarse las manos
Usar guantes y tapa boca para evitar contaminaciones.













Bibliografa

BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General. Canoabo
PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2
da
Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico.
BROOKS G. 2005. Microbiologa Mdica. 18va. Edicin. McGraw-Hill. Mxico.
BROCK, T. (2002). Biologa de los Microorganismos, Ed. Mxico, (decima edicin).
ORTEGA M. 2009. Siembra y recuento de Microorganismos. Universidad Tecnolgica
Nacional. Rosario-Argentina.
WALTER W. G. 1980. Introduccin a la Microbiologa. Editorial continental. Mxico.