Nelcio Antonio Tonizza de Carvalho Jlia G. Soares Entre las principales biotecnologas empleadas en las especies domsticas, po- demos mencionar la inseminacin artificial (IA) como una herramienta importante para la difusin de material gentico superior de origen paterno. Sin embargo, el uso de esta tcnica en la forma convencional, es decir, mediante la observacin del celo, tiene dos problemas importantes en bfalos. El primero est relacionado con el com- portamiento del celo en s, que en esta especie es ms discreto, lo que dificulta su de- teccin. El segundo, se relaciona directamente con el primer factor y se debe a la baja tasa de servicios obtenida en bfalas de agua sometidas a IA, lo que conlleva a que la eficiencia reproductiva del rebao se vea comprometida y a que el uso de la tcnica fracase. Adems, es importante destacar que los bfalos criados en regiones alejadas del ecuador son estacionales y solo muestran actividad reproductiva durante los me- ses de otoo e invierno. Por lo tanto, el uso de programas de manejo reproductivo que no requieren la deteccin del celo contribuye al aumento de la eficiencia de la AI, debido principal- mente a la facilidad de implementacin de esta tcnica. Los objetivos de estos progra- mas son la sincronizacin de la fase ltea, del crecimiento folicular y de la ovulacin, lo que permite que la IAse aplique a todos los animales de la finca, incluso en aquellos que manifiestan signos de ciclicidad o de estro. PROTOCOLOS DE SINCRONIZACIN DE LA OVULACIN El estro y/o la ovulacin puede ser inducida en los bfalos por medio de un tra- tamiento hormonal (ver revisin de Baruselli et al., 2007; Campanile et al., 2010). Ante este escenario, grupos de investigacin de todo el mundo llevaron a cabo diversos es- tudios para evaluar la eficacia de los protocolos de sincronizacin de la ovulacin para la IA a tiempo fijo (IATF) en bfalos (Baruselli, 1999a, 1999b; Campanile et al., 2005; Baruselli et al., 2007). El uso de IATF es una ventaja, ya que la IA puede programarse para momentos determinados del da, lo que simplifica el manejo empleado en los programas tradicionales de IA. Sin embargo, la cra estacional observada en los bfa- 765 Logros & Desafos de la Ganadera Doble Propsito. 2014 los puede interferir con la eficiencia de la sincronizacin de la ovulacin al utilizar los protocolos para IATF. Durante el periodo de anestro estacional, las bfalas no tienen comportamiento de estro ni ovulan, y por consiguiente, el ovario no produce progesterona (P 4 ), como tampoco se produce crecimiento de folculos ovulatorios. Adems, las vacas en anes- tro tienen insuficiente liberacin pulstil de la hormona luteinizante (LH) como para estimular las etapas finales del desarrollo folicular y la ovulacin (Yavas & Walton, 2000), lo que limita la eficacia de los protocolos de IATF(Baruselli et al., 2004). Por lo tanto, es importante dominar cuales de los diferentes protocolos deben ser usados de acuerdo con la temporada de reproduccin y con el estado de la ciclicidad de los reba- os bufalinos. Sincronizacin de la ovulacin e IATF durante la temporada de reproduc- cin (otoo e invierno) Se han desarrollado diversos estudios para evaluar la eficacia del protocolo Ovsynch en bfalos: da 0, hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH); da 7, prostaglandina F2alfa (PGF 2a ); da 9, GnRH; e IATF 16 horas despus de la segunda dosis de GnRH (Baruselli et al., 1999a, 1999b). En estos estudios, se confirm que los bfalos responden al tratamiento hormonal y que una nueva onda folicular emerge debido a la ovulacin del folculo dominante presente en el momento de aplicacin de la primera dosis de GnRH. En el da 7, los bfalos responden a la PGF 2a (lutelisis), y para el da 9, aproximadamente el 80%de los animales logran sincronizar la ovulacin dentro de 12 h. Tasas de preez de alrededor del 50% pueden ser obtenidas en los b- falas cclicas (con presencia de cuerpo lteo, CL); sin embargo, la tasa de preez se ve influenciada por la condicin corporal (CC) obtenindose buena eficiencia con una CC3,5 (en una escala de 1 a 5), al igual que por la paridad, al observar que las prim- paras son menos eficientes que las multparas, y tambin por la poca del ao, ya que en este protocolo las mejores tasas de preez se obtienen durante en el otoo y el in- vierno en comparacin con la primavera y el verano. Con el objetivo de evaluar nuevas alternativas para la sincronizacin de la ovu- lacin con gonadotropinas en bfalos, se han llevado a cabo otros estudios para estu- diar el efecto de la sustitucin de la segunda inyeccin de GnRH del protocolo Ovsynch por LH (Bereber et al., 2002) o por la hormona corinica humana (hCG) (Carvalho et al., 2004). Estas hormonas podran mejorar la ovulacin y por lo tanto la eficiencia del protocolo, ya que actan directamente sobre el folculo (GnRHestimula a la glndula hipofisiaria para que libere LHendgena). Si hay dficit de LHen la hi- pfisis, la GnRHno provocar la liberacin de LHy, por lo tanto, no habr ovulacin. En estos experimentos, no hubo diferencias en las tasas de preez despus de la IATF, tanto para la LH como para la hCG, en comparacin con el tratamiento con GnRH. Por lo tanto, no se confirm la hiptesis inicial. Otro estudio evalu la efectividad de un dispositivo intravaginal con P 4 asocia- do con el protocolo Ovsynch (Baruselli et al., 2003b). Se supone que el uso de P 4 exge- na podra mantener altas concentraciones plasmticas de P 4 durante el tratamiento, y por lo tanto, mejorar la sincronizacin de la ovulacin con un consiguiente aumento 766 / Nelcio Antonio Tonizza de Carvalho & Jlia G. Soares de la tasa de preez. No obstante, los autores encontraron que la adicin de P 4 al pro- tocolo Ovsynch no aument la tasa de preez en las bfalas inseminadas, por lo cual no fue confirmada la hiptesis inicial. En un intento de reducir los costos de tratamiento, se realiz un estudio para evaluar la eficacia de la aplicacin de dosis de PGF 2a en el protocolo Ovsynch (Ba- ruselli et al., 2003d). La tasa de preez no fue influenciada por la dosis de PGF 2a , ob- servndose que 88,6%de los bfalas del grupo que recibi dosis y 90,0%de las trata- das con la dosis total experimentaron lutelisis. De acuerdo con estos resultados, la dosis recomendada de PGF 2a se puede reducir en un 50%, lo que disminuye los costos del protocolo Ovsynch para IATF en bfalos. Sin embargo, el tamao correcto de la aguja y la jeringa, as como la precisin de la administracin de pequeas dosis de hor- monas pueden determinar la eficiencia del protocolo. En el mismo sentido, se reportaron mayores tasas de preez y nacimientos en las bfalas que recibieron una dosis de GnRH6 das despus de la IATFen el protoco- lo Ovsynch (Carvalho et al., 2007a) La administracin adicional de GnRH indujo la formacin de CL accesorios, que segn Campanile et al. (2010) y Marques et al. (2012) aumentaron la concentracin plasmtica de P 4 que result en un efecto positivo sobre la preez y nacimientos. Los estudios han demostrado que la P 4 controla la funcin y el sistema de secrecin glandular uterina (Spencer et al., 2004), que es importante para la nutricin y el desarrollo del embrin (Mann et al., 1999). Por lo tanto, la induccin de CL accesorios en las bfalas es una alternativa para aumentar la eficiencia del pro- tocolo Ovsynch. Sin embargo, cuando se utiliz el protocolo Ovsynch en primavera y verano, pe- rodo de alta incidencia de anestro en bfalas, se obtuvieron tasas de preez entre 6,9% (Baruselli et al., 1999b) y 28,2% (Baruselli et al., 2002), lo que indica una baja efi- ciencia del protocolo en esta poca del ao. Debido a estos resultados se llevaron a cabo otros estudios para viabilizar la utilizacin de un protocolo hormonal que au- mente la tasa de preez en bfalas en anestro estacional bajo IATF (Baruselli et al., 2002; 2003a; Bartolomeu, 2003; Porto Filho, 2004; Porto Filho et al., 2004a,b; Carval- ho et al., 2005; 2007a,b,c,d), Sincronizacin de la ovulacin e IATF durante la estacin reproductiva des- favorable (primavera y verano) El uso de progestgenos en protocolos de sincronizacin promueve un aumento en la frecuencia de pulso de LH durante y despus del tratamiento para inducir la ovulacin (Rhodes et al., 2002). El tratamiento de vacas en anestro con P 4 result en una mayor produccin de lquido folicular, mayores concentraciones circulantes de estradiol (E 2 ), incremento de la secrecin pulstil de LH y aumento de los receptores de LH en las clulas de la granulosa y una teca de folculos preovulatorios, en compa- racin con los animales no tratados (Rhodes et al., 2003). Adems, conociendo que un corto perodo con una concentracin elevada de P 4 durante el anestro es importante para la expresin del estro y para logar una funcin luteal normal (McDougall et al., 1992), se plante la hiptesis de que la exposicin de bfalas en anestro a la P 4 puede estimular el desarrollo y la maduracin de un folculo dominante, aumentando la li- Logros & Desafos de la Ganadera Doble Propsito. 2014 Inseminacin artificial en bfalas 767 beracin de LHy estimulando la expresin de receptores de LHy la secrecin de E 2 , y en consecuencia, promover la ovulacin. Existen varios dispositivos intravaginales de liberacin lenta de P 4 , con diferen- tes concentraciones (0,5 a 1,9 g de P 4 ) disponibles en el mercado. Estos dispositivos contienen P 4 natural y proporcionan concentraciones sanguneas de 4 a 5 ng/mLde P 4 durante su uso. Dosis bajas de progestgeno sinttico como 3 a 6 mg norgestomet, se han utilizado en implantes subcutneos, siendo ms potentes que la P 4 natural. No obstante, a pesar de que la P 4 es capaz de inducir la ciclicidad posparto, la efi- cacia de este tratamiento puede verse comprometido en rebaos con una alta propor- cin de vacas en anestro, con deficiente CC, o con ambas cosas. Por lo tanto, la admi- nistracin adicional de gonadotropinas con el fin de mejorar el soporte de LH podra incluirse en estos protocolos de sincronizacin. Por esa razn, la administracin de la gonadotropina corinica equina (eCG) en el momento del retiro de los dispositivos de P 4 tambin se ha sugerido como alternativa para aumentar la tasa de preez en los pro- gramas de IATF para bfalas con alta prevalencia de anestro (Baruselli et al., 2007; Carvalho et al., 2013). La eCGtiene actividad tanto de FSHcomo de LHy su administracin parente- ral estimula el crecimiento folicular y la ovulacin en el ganado bovino (Soumano & Price, 1997). La insercin de implantes subcutneos de norgestomet o de dispositivos intravaginales de P 4 , combinados con eCGen el momento del retiro de los implantes o de los dispositivos intravaginales han sido ampliamente utilizados en los rebaos Bos indicus con alta incidencia de anestro posparto (revisado por Baruselli et al., 2004). De ah que, la aplicacin de 400 UI de eCGal momento retirar la fuente exgena de P 4 dio lugar a aumentos en la ovulacin y en la preez en vacas sin CLal inicio del protocolo (Baruselli et al., 2003c, 2004; S Filho et al., 2010). Los protocolos desarrollados para bfalas con P 4 o progestgenos consisten en la insercin de un dispositivo intravaginal de P 4 o un implante auricular de norgesto- met, asociados con la inyeccin intramuscular de benzoato de estradiol (BE) en un da aleatorio del ciclo estrual (da 0). Posteriormente, el da 9, se retira el dispositivo o im- plante y se administran dosis intramusculares de PGF 2a y eCG. Luego de 48 horas, la ovulacin es inducida por la administracin de hCG o GnRH. La IATF se realiza 16 horas ms tarde (Baruselli et al., 2003a; Carvalho et al., 2007b). La combinacin de P 4 o progestgeno con BE el inicio del protocolo es efectivo para inducir la emergencia de una nueva onda folicular debido a la supresin de las hormonas FSH y LH, lo que posteriormente promover la atresia de todos los folcu- los presentes en los ovarios de las vacas (revisado por B et al., 2003) y de las bfalas (revisado por Baruselli et al., 2007). Para verificar la eficiencia y la importancia del uso de la eCGen el protocolo an- terior, se realiz un estudio con bfalas lactantes que recibieron o no una dosis de eCG, encontrando que el tratamiento con eCGen el momento de retirar el dispositivo intravaginal de P 4 proporcion una respuesta ovulatoria satisfactoria y aument la efi- ciencia reproductiva de las bfalas en anestro estacional (Carvalho et al., 2013). En otro estudio se demostr que tanto el dispositivo intravaginal de P 4 como el implante de norgestomet proporcionaron una satisfactoria respuesta folicular y de la 768 / Nelcio Antonio Tonizza de Carvalho & Jlia G. Soares tasa de preez en bfalas acclicas (Carvalho et al., 2007c). Sin embargo, la respuesta al tratamiento parece depender de algunos factores relacionados con la profundidad del anestro, como la estacionalidad, CC, edad y el intervalo entre partos. Adicionalmente, se ha observado que las concentraciones bajas de P 4 en los dis- positivos intravaginales reutilizados fueron eficaces para controlar el crecimiento fo- licular, al proporcionar satisfactorias tasas de preez en las bfalas sometidas a proto- colos de sincronizacin de la ovulacin e IATF (Carvalho et al., 2014). Con respecto a la induccin de la ovulacin en los protocolos de IATF en bfa- los, es conocido que el uso de GnRH reduce el costo del protocolo, en comparacin con la hCGy de la misma forma, el BElo es con respecto a la GnRH. Esa informacin, permiti estudiar la eficiencia de diferentes inductores de la ovulacin (hCG, GnRH o EB) sobre la dinmica folicular (Carvalho et al, 2005; 2012) y la tasa de preez (Car- valho et al., 2007b; 2012). Los resultados obtenidos indicaron que el uso de GnRH para reemplazar la hCG y de BE para sustituir la GnRH, proporcionaron satisfacto- rias respuestas foliculares y de la tasa de preez, adems de permitir reducir el costo del protocolo para la IATF. Sincronizacin de la ovulacin para IATF durante todo el ao en bfalos En la actualidad, es posible sincronizar la ovulacin para IATF durante todo el ao con una eficiencia satisfactoria, incluso en pases y regiones donde los bfalos presentan evidente estacionalidad reproductiva. Con el uso del protocolo Ovsynch durante la temporada reproductiva favorable y P 4 o progestgeno + BE + PGF2a + eCG+hCGo GnRHo BEcomo protocolo de desestacionalizacin para la estacin re- productiva desfavorable (anestro) es posible obtener aproximadamente el 50% de fer- tilidad, tanto en otoo e invierno como en primavera y verano. Esta tecnologa permi- te asociar el uso de la IAcon la desestacionalizacin de los partos, lo cual contribuye a evitar su concentracin y de la produccin de leche durante pocas determinadas, lo que afectara el abastecimiento de la demanda industrial de leche de bfala durante todo el ao. INSEMINACIN ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO EN NOVILLAS Aun cuando se han obtenido resultados prometedores con el uso de la IATF en bfalas adultas (primparas y multparas) son pocos los estudios que implican el uso de esta biotecnologa en novillas bufalinas (buvillas). En estudios recientes en bubil- las se utiliz un aplicador o pistoleta uterina desarrollada para la IAde ovejas y cabras (Carvalho et al., 2010a). Esta adaptacin se realiz debido al menor grosor de este ins- trumento en comparacin con el aplicador convencional. El dimetro del cuello del tero de las buvillas es muy pequeo, tanto que no permite el paso de los aplicadores convencionales de semen utilizados para vacas y bfalas adultas, lo que impide la IA de esta categora de animales. Este estudio demostr que el aplicador o pistoleta de se- men para ovinos y caprinos fue eficaz para atravesar el conducto cervical en el 100% de las buvillas, lo que posibilita su uso en esta especie. Asimismo, como el costo de este instrumento no impide su uso rutinario en el campo, es posible aplicarlo a gran escala, ampliando as esta lnea de investigacin recientemente iniciada. Logros & Desafos de la Ganadera Doble Propsito. 2014 Inseminacin artificial en bfalas 769 Carvalho et al. (2007a,d) evaluaron la efectividad del tratamiento con norgesto- met + BE, seguido de eCG + PGF 2a y GnRH en comparacin con el protocolo Ovsynch, demostrando que el protocolo para inducir la ciclicidad reproductiva resul- t satisfactorio en la respuesta folicular y la fertilidad en las buvillas sometidas a IATFdurante la temporada de anestro; sin embargo, tambin se confirm que el pro- tocolo Ovsynch no fue eficiente en las buvillas en esta temporada, confirmando lo ob- servado en las bfalas adultas. Al ser evaluada la utilizacin de un dispositivo intravaginal de P 4 y del implante subcutneo de norgestomet (Carvalho et al., 2011), se encontr que ambos protocolos hormonales proporcionaron una respuesta folicular y una tasa de preez satisfactorias en las buvillas manejadas bajo un programa de IATFdurante la temporada reproduc- tiva desfavorable. Asimismo, se evalu la eficiencia de diferentes inductores de la ovulacin (BE o GnRH) para su uso en protocolos de IATF (Carvalho et al., 2010b; Nichi et al., 2011); el tratamiento con P 4 +EB(da 0), seguido de la administracin de eCG+PGF 2a (da 9) y la induccin de la ovulacin con BEy GnRHen el da 11 (Carvalho et al., 2010b) o BEen el da 10 y GnRHen el da 11 (Nichi et al., 2011), resultaron en una satisfactoria respuesta folicular y de la tasa de ovulacin, por lo cual su uso est indicado en la sin- cronizacin de la ovulacin y la IATF en buvillas durante la temporada reproductiva desfavorable. CONCLUSIONES El uso de la IA hace posible la introduccin de material gentico mejorador en los rebaos bufalinos. Sin embargo, la estacionalidad reproductiva, adems del tiem- po y esfuerzo gastados para la deteccin del estro, limitan la aplicacin a gran escala y el xito de esta tecnologa. La incorporacin de tcnicas concebidas para controlar la dinmica de las ondas de crecimiento folicular y la ovulacin ha reducido los proble- mas asociados con la deteccin del estro. El desarrollo folicular puede ser controlado mediante tratamiento hormonal como el Ovsynch, cuyo protocolo ha producido tasas de preez satisfactorias despus de la IATF en las bfalas cclicas durante la temporada reproductiva favorable. Los protocolos para inducir la desestacionalizacin proporcionan la oportuni- dad para la aplicacin de la IATF en la estacin reproductiva desfavorable, promo- viendo la ovulacin y el reinicio de los ciclos estruales en las bfalas en anestro. En la actualidad, la IATF puede ser utilizada durante todo el ao, lo que ayuda a evitar la concentracin de los partos y de la produccin de leche en determinados perodos, fa- voreciendo el agronegocio con bfalos. El uso de esta biotecnologa en buvillas aumentar el progreso gentico en las operaciones bufalinas comerciales, ya que en un proceso continuo de seleccin y me- jora gentica, las vaquillas son consideradas de gran importancia en el rebao. Por lo tanto, el uso de la IATFen esta categora hace posible aumentar la velocidad de la me- jora gentica, representando un avance considerable en el mejoramiento gentico de la especie, como en las operaciones comerciales bufalinas. 770 / Nelcio Antonio Tonizza de Carvalho & Jlia G. Soares REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Bartolomeu CC. 2003. Estudo da dinmica folicular durante o tratamento comCIDR-Be Crestar visando a inseminao artificial emtempo fixo emfmeas bubalinas (Bubalus bu- balis). Faculdade Medicina Veterinria Zootecnia, Universidade So Paulo. Tese Douto- rado. 120 pp. Baruselli PS, Madureira EH, Barnabe VH, Barnabe RC, Visintin JA, Oliveira CA, Ama- ral R. 1999a. 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