1. OBJETIVO Obtener el extracto proteico de un cultivo bacteriano empleando bolitas de vidrio.
2. MATERIALES Y REACTIVO. CLCULOS MATERIALES Tubos Eppendorf. Tubos de ensayo de 10 ml Centrfuga. Vrtex. Mcropipetas y puntas. Mechero.
REACTIVOS Muestra BL 21(estirpe de E.Coli sin plsmido) Medio LB Preparacin de 50 ml de medio LB Medio LB: 10 g Bactotriptona, 5 g extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 L de agua. Disolver y autoclavar. Para 800 ml: 8 g de triptona, 4 g de extracto de levadura, 4 g de NaCl Ampicilina 50 mg/mL. 2
Tampn TrisHCl 100 mM, NaCl 100 mM, glicerol 10% pH 7,5 (fro). Preparamos primero disoluciones concentradas de 1 M, y a partir de ellas las otras diluidas. Si queremos preparamos 100 ml de TrisHCl 1 M y NaCl 1 M. Se calcula la cantidad de soluto de cada uno y se diluye en por ejemplo 30 ml de agua destilada. Se mide el pH con el pHmetro, y se le aade HCl concentrado diluido en agua hasta alcanzar pH 7,8. Con estas disoluciones concentradas preparamos la disolucin TrisHCl 100 mM, NaCl 100 mM, glicerol 10% (50ml). C * V = C* V 1000 mM * V = 100 mM * 50 ml V = 5 ml En una probeta de 50 ml aadimos 5 ml de TrisHCl 1 M, 5 ml de NaCl, 35 ml de agua destilada y 5 ml de glicerol.
3. PROCEDIMIENTO 1. Partimos de un cultivo joven, realizamos una resiembra y con el asa de siembra inoculamos en 50 mL de medio LB con la estirpe de E.Coli correspondiente e incubamos o/n a 37C. Cogemos 100 l de cultivo o/n, centrifugar y eliminar el sobrenadante y guardar a -20C para visualizarlo en un gel de SDS-PAGE. 2. Tarar un tubo de centrfuga de 10 mL (los de tapn verde) y anotar su peso Recoger el cultivo en ese tubo (4000 rpm 3 minutos). Se realiza esta operacin 5 veces hasta centrifugar los 50 ml inoculados. 3
3. Lavar con 10 ml de la disolucin de TrisHCl, NaCl, glicerol pH 7,5 fra. Centrifugar 3 minutos a 4000 rpm y eliminar bien el sobrenadante y pesar el tubo. Por diferencia (T 2 T 1 ) se calcula el peso del pellet. 4. Resuspender en el tampn anterior a razn de 2,5 ml/g de clula. Primero se resuspende en el vrtex, se le aade un poco de tampn y se vuelve a resuspender as hasta el volumen total de tampn calculado. 5. Aadir 4 cucharadas de perlas de vidrio y romper las clulas mediante 10 ciclos de 30 segundos vrtex-hielo. 6. Pasar a un tubo Eppendorf y centrifugar 5 minutos a 14.000rpm y transferir el sobrenadante (protenas solubles) a un tubo Eppendorf nuevo. 7. Este extracto se va a cuantificar mediante el mtodo 8radford y se va a visualizar en un gel de SOS-PAGE. Cargaremos 20 l de muestra y 4 l de tampn de carga.
4. RESULTADOS E INTERPRETACIN Clculo del peso del pellet Tubo sin muestra = 6,7643 Tubo con pellet = 6,8038 Masa del pellet = 0,0395 g
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Tras la rotura se utilizan tampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que pueden desnaturalizarla: Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos). Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo ms corto posible. En ocasiones es necesario aadir al tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas. Por ejemplo el glicerol le confiere estabilidad a las protenas sobre todo cuando se congelan El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin (10.000-5.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. La fase soluble constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de inters objeto de la purificacin.