Laboratorio 3: Antioxidantes como parte fundamental de productos

funcionales




OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con trminos como: radicales libres, antioxidantes, aditivos y productos funcionales.
Reconocer la vitamina C como una molcula antioxidante y su mecanismo de accin a nivel celular.
Cuantificar la vitamina C en algunos frutos y productos enriquecidos con la misma, para corroborar su importancia
como aditivo funcional.


INTRODUCCION
La capacidad de utilizar el oxgeno a provedo a los
humanos beneficios como metabolizar las grasas, las
protenas y los carbohidratos para obtener energa; sin
embargo, el oxgeno es altamente reactivo que es capaz
de ser parte de molculas potencialmente nocivas
conocidas comnmente como radicales libres. Los
radicales libres son capaces de atacar las clulas
saludables de un organismo, causando que ellas pierdan
su estructura y funcin. El dao celular causado por los
radicales libres parece ser el mayor contribuyente para el
envejecimiento y enfermedades degenerativas tales
como cncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas,
daos en el sistema inmune y disfuncin cerebral.
Afortunadamente, la formacin de radicales libres es
naturalmente controlada por varios compuestos
benficos conocidos como antioxidantes. Los
antioxidantes son capaces de estabilizar, o desactivar los
radicales libres antes que ataquen las clulas. Los
antioxidantes son absolutamente crticos para el ptimo
mantenimiento celular, la salud sistmica y el bienestar
celular. Entre los antioxidantes encontramos:
antioxidantes derivados de nutrientes: vitamina C,
vitamina E, carotenoides, y otros compuestos de bajo
peso molecular (glutatin y cido lipoico); enzimas
antioxidantes: superoxido dismutasa, glutatin
peroxidada, glutatin reductasa; proteinas de unin a
metales: ferritina, lactoferrina, albmina y ceruplasmina
que secuestran iones cobre y hierro libres que son
capaces de catalizar reacciones oxidativas, entre otros
(Percival M. 1998).

Antioxidantes
Los antioxidantes son considerados aditivos y estn
regulados bajo el Acta Federal de Drogas, Alimentos y
Cosmticos. Este cdigo los define como sustancias
para preservar el alimento del deterioro, rancidez o
decoloracin debido a la oxidacin (21 CFR 170.3). No
deben exceder el 0.2% por peso basado en el contenido
de grasa del alimento. Los antioxidantes se pueden
dividir en dos grupos: aquellos que inhiben la formacin
de radicales libres como donantes de hidrgeno y los que
interfirieren en la cadena de radicales libres al formar
compuestos ms estables. Los antioxidantes pueden
actuar en diferentes etapas de las reacciones de
oxidacin y se diferencian en el modo de accin. Se
pueden clasificar de acuerdo al modo de accin en
antioxidantes primarios o antioxidantes secundarios. Los
antioxidantes primarios son aquellos que reaccionan con
los radicales y forman productos ms estables. Los
antioxidantes secundarios o preventivos reducen la
velocidad de la reaccin de iniciacin mediante varios
mecanismos que incluyen inactivacin de iones
metlicos, descomponedores de hidroperxidos,
secuestradores de oxgeno y sinergistas (Eskin y
Przybylski, 2000).

Existen diversos mtodos para evaluar la actividad
antioxidante, ya sea in vitro o in vivo. Una de las
estrategias ms aplicadas en las medidas in vitro de la
capacidad antioxidante total de un compuesto, mezcla o
alimento, consiste en determinar la actividad del
antioxidante frente a sustancias cromgenas de
naturaleza radical; la prdida de color ocurre de forma
proporcional con la concentracin

Vitamina C (cido Lascrbico)
Entre los antioxidantes naturales se encuentra el cido
ascrbico o vitamina C. Este antioxidante es un agente
reductor debido a los grupos hidroxilo adyacentes que
pueden perder hidrgeno formar un radical
semideshidroascorbato y oxidarse a cido
deshidroascrbico (figura 1).


El cido ascrbico tiene tambin la habilidad de
secuestrar oxgeno. Se necesitan aproximadamente 3.5
mg de cido ascrbico para secuestrar el oxgeno en un
cm
3
de headspace de un envase (Cort, 1982).
Actualmente el cido ascrbico posee un estatus de
GRAS (Generally Recognized As Safe.) como
preservativo qumico y no tiene restricciones en cuanto a
su uso en diferentes niveles de concentracin (21 CFR
182.3013). El cido ascrbico se ha utilizado contra la
oxidacin en vinos, cerveza, frutas, vegetales, bebidas,
carnes curadas y productos de pescado.

El cido ascrbico puede actuar como prooxidante o
promover la autoxidacin a causa de su grupo orto
dihidroxi (Harris y Tall, 1999). Se sugiere que puede
promover la oxidacin de lpidos, dependiendo de su
concentracin, ya que puede reducir metales catalticos
como Fe
3+
y Cu
2+
, regenerando Fe
2+
y Cu
+
que
intervienen en la oxidacin (Decker y Hultin, 1992). Las
condiciones antioxidantes o prooxidantes del cido
ascrbico dependen de la concentracin a la que est
presente.

Alguna literatura reporta que altas concentraciones de
cido ascrbico en alimentos sugieren un efecto
antioxidante, por el contrario bajas concentraciones
sugieren un efecto prooxidante (Hultin, 1992; Fennema,
1996; Decker y Hultin, 1992).

La ingesta de alimentos ricos en sustancias antioxidantes
como vitaminas C y E, carotenoides o compuestos
fenlicos, previene o disminuye el desarrollo de estas
enfermedades. Se cree que la dieta aumenta la defensa
antioxidante del organismo evitando el dao oxidativo
(Kuskoski et al., 2005). La guayaba destaca su contenido
en vitamina C; concentra unas siete veces ms que la
naranja. Aporta en menor medida otras vitaminas del
grupo B (sobre todo niacina o B3).

Si la pulpa es anaranjada, es ms rica en provitamina A
(carotenos). Ambas vitaminas, cumplen adems una
funcin antioxidante. Respecto a los minerales, destaca
su aporte de potasio. Los frutos muy maduros pierden
vitamina C. Su aporte de fibra es elevado por lo que
posee un suave efecto laxante y previene o reduce el
riesgo de ciertas alteraciones y enfermedades. Es de
bajo valor calrico, por su escaso aporte de hidratos de
carbono y menor an de protenas y grasas (FNFH,
2003).

La vitamina C ha sido reconocida como un nutriente
importante en varios productos alimentarios. La accin de
la vitamina C es suministrada por el cido L-ascrbico
(AA) y su forma oxidada, el cido deshidroascrbico
(DHAA). En humanos ambas formas son biolgicamente
activas, definindose as la vitamina C total como la
suma de las dos (Ledezma-Gairaud, 2006). Existen
diferentes mtodos analticos utilizados para la
determinacin de la vitamina C, dentro de los cuales
tenemos los siguientes: el de valoracin con el 2,6
dicloroindofenol; el colorimtrico utilizando 2,4
dinitrofenilhidrazina; el microfluoromtrico y varios
mtodos por cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC). Los primeros dos mtodos carecen de
especificidad y estn sujetos a interferencias de la matriz,
produciendo as alteracin de la exactitud, y el tercero es
especfico para vitamina C total y se utiliza en productos
considerados como buenas fuentes de esa sustancia
(Ledezma-Gairaud, 2006)

Las reacciones de degradacin del cido ascrbico se
dan con rapidez a pH bsico y con catalizadores
metlicos siendo ms lentas a pH cido. Por eso en la
elaboracin de zumos de frutas, la acidez asegura la
estabilidad de la vitamina, as como la presencia de
citratos y flavonoides que acomplejan los iones
metlicos. Como aditivo en la alimentacin, tiene gran
aceptabilidad debido a su bajo precio y su inocuidad en el
organismo. Se utiliza como antioxidante para evitar las
reacciones de pardeamiento enzimtico, tambin se
utiliza en productos crnicos curados como reductor,
para disminuir la concentracin de nitritos necesarios
para conseguir el color rosceo tpico de la carne.

Los mtodos de determinacin de vitamina C, se basan
en la capacidad reductora del cido ascrbico. As el
mtodo de Mohr consiste en la formacin de 2
nitrofenilhidrazina del cido oxlico por tratamiento del
cido ascrbico con la 2nitroanilina diazotada; este
compuesto en presencia de NaOH forma una sal sdica
que da coloracin morado que se puede medir
espectrofotomtricamente.

MATERIALES Y REACTIVOS
Solucin 2-nitroanilina
Solucin nitrito de sodio
Patrn de vitamina C
Etanol Absoluto
cido oxlico
Agua destilada
Material vegetal
2 Micropipetas
Vortex
13 tubos de ensayo
Mortero
Matraz
Espectrofotmetro

La preparacin de las soluciones se puede ver en el
Anexo 2.

PROCEDIMIENTO
Preparacin de la solucin patrn
Preparar una solucin al 10% del vegetal a estudiar, de la
siguiente manera: pesar 10 gramos del vegetal bien seco
y picado, macerarlo en 100ml de cido oxlico y luego
filtrarlo, el filtrado se recibe en un matraz cubierto
totalmente con papel aluminio. Luego se determina la
densidad pesando un mililitro del filtrado.

Se preparan dos soluciones problema, una sin diluir y
otra diluida. Para realizar la sin diluir se coge 1ml del
filtrado y se agregan 9ml de cido oxlico; para la diluida
se cogen 100l del filtrado y 9,9ml de cido oxlico. (La
prueba para el tubo P, que se explica a continuacin se
realiza por triplicado para cada uno).

Preparacin de la curva de calibracin
La concentracin de cido ascrbico presente en la
solucin problema se determina
espectrofotomtricamente utilizando los mismos reactivos
y procedimiento para la curva patrn trabajando en las
mismas condiciones experimentales. Por tal motivo se
realiza dicho tratamiento (P) junto con la curva de
calibracin, (se aade 1 ml del filtrado en lugar de la
solucin patrn, se determina la absorbancia y se
extrapola la concentracin con base en la curva de
calibracin).

La curva de calibracin se prepara de la siguiente forma
(los tubos deben encontrarse cubiertos con papel
aluminio):

Tabla 1: Volmenes de reactivos (2-nitroanilina y nitrito de sodio) para
preparar curva de calibracin
R
e
a
c
t
i
v
o

B 1 2 3 4 5 6
P
1 2 3 4 5 6
2
-
n
i
t
r
o
a
n
i
l
i
n
a

(
m
l
)

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
N
i
t
r
i
t
o

d
e

s
o
d
i
o

(
m
l
)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Mezclar bien y asegurarse de que el medio este acido
(pH < 4,0). Dejar en reposo por 10 min. Aadir luego lo
siguiente a cada tubo

Tabla 2: Volmenes de reactivos (etanol absoluto, patrn cido
ascrbico y cido oxlico) para preparar curva de calibracin
R
e
a
c
t
i
v
o

B 1 2 3 4 5 6
P
1 2 3 4 5 6
E
t
a
n
o
l

a
b
s
o
l
u
t
o

(
m
l
)

3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8
P
a
t
r

c
i
d
o

a
s
c

r
b
i
c
o

(
m
l
)

- 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - - - - - -
F
i
l
t
r
a
d
o

(
m
l
)

- - - - - - - 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

c
i
d
o

o
x

l
i
c
o

(
m
l
)

1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 - - - - - - -

Mezclar bien y esperar 20 minutos para agregar los
siguientes reactivos, pues es necesario tener un pH
bsico para observar color.

Tabla 3: Volmenes de reactivos (NaOH y Agua destilada) para preparar
curva de calibracin
R
e
a
c
t
i
v
o

B 1 2 3 4 5 6
P
1 2 3 4 5 6
N
a
O
H

1
0
%

(
m
l
)

1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
A
g
u
a

d
e
s
t
i
l
a
d
a

(
m
l
)

3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7

Se mezcla bien el contenido de cada tubo, se observa
que el pH es bsico y se mide absorbancia con
espectrofotmetro a 540nm.

CUESTIONARIO

1. Hacer la curva y calcular la concentracin de la
muestra problema expresndola:
a. mg de cido ascrbico/100 ml de zumo.
b. mg de cido ascrbico/100 g de zumo.

2. Comparar los datos obtenidos con los de las tablas
de nutricin.
3. Expresar os resultados en unidades internacionales
de vitamina C.


BIBLIOGRAFIA

Cort, W. M. 1982. Antioxidant Properties of Ascorbic Acid
in Foods. En: P.A. Seib y B. M. Tolbert (eds.). Advances
in Chemistry Series, Ascorbic Acid: Chemistry,
Metabolism and Uses. American Chemical Society,
Washington, D.C.

Decker, E. A. y H. O. Hultin. 1992. Lipid Oxidation in
Muscle Foods via Redox Iron. En: A. J. St. Angelo (ed.).
Lipid Oxidation in Food. American Chemical Society,
Washington, D.C.

Eskin, N.A.M. y R. Przybylski. 2000. Antioxidants and
Shelf Life of Foods. En: N. A. M. Eskin y D. S. Robinson
(eds.). Food Shelf Life Stability: Chemical, Biochemical
and Microbiological Changes. CRC Press, Boca Ratn,
Florida

Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry. Marcel Dekker,
Inc., New York

FNFH. 2003. Fondo Nacional de Fomento Hortcula.
Frutas y hortalizas de Colombia para el mundo.

Harris, P. y J. Tall. 1999. Rancidity in Fish. En: J. C. Allen
y J. H. Hamilton (eds.). Rancidity in Foods. Aspen
Publishers, Inc., Maryland.

Hultin, H. O. 1992. Lipid Oxidation in Fish Muscle. En: G.
J. Flick y R. E. Martin (eds.). Advances in Seafood
Biochemistry: Composition and Quality. Technomic
Publishing Company, Inc., Pennsylvania

Kuskoski E, Asuro A, Troncoso A, Fett R, Mancini-Filho J.
2005. Aplicacin de diversos mtodos qumicos para
determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos.
Sevilla, ES.

Ledezma-Gairaud M. 2006. Validacin del mtodo:
Determinacin de vitamina C total por cromatografa
lquida de alta resolucin HPLC. Tecnologa en marcha.
Vol. 17-4.

Percival M. 1998. Antioxidants. Clinical Nutrition Insights.
Nut031 1/96 Rev. 10/98.

ANEXO
Solucin de 2 nitroanilina:
0.15 g de nitroanilina
5 mL de Acido actico glacial
5 mL de HCl 37%
90 mL de Agua

Solucin de Nitrito de sodio:
0.080 g de nitrito de sodio
100 mL de agua

Patrn de vitamina C:
500 mg de vitamina C
1 L de cido oxlico al 0.15%


Corregido por: Diana Ximena Hurtado Varela