La multirresistencia (MDR ) sigue siendo un reto importante para el tratamiento del cncer

hasta el momento. Doxorrubicina libre ( DOX , uno de los agentes de la quimioterapia ms

utilizados para el tratamiento del cncer ) por lo general cuenta con un gran valor de factor
de resistencia ( FR), que se considera como un parmetro importante para evaluar la
eficacia teraputica de la resistencia cruzada . Para abordar esta cuestin , que en el
presente documento presenta un tipo de nanocables de silicio ( SiNWs ) - basado
nanovehculos de drogas ( SiNW - DOX) , que es de alta eficacia para el tratamiento de
las clulas cancerosas resistentes a los frmacos . Normalmente , las clulas cancerosas
de resistencia a frmacos (por ejemplo , clulas MCF-7/ADR ) pueden ser inhibidos
significativamente por las nanovehculos SiNWsbased , mostrando la viabilidad celular
w10 % durante 72 h de incubacin con el SiNWs - DOX ( 80 mgml ? 1 DOX ), que est en
agudo contraste con las clulas tratadas con DOX gratuitas preservar la viabilidad celular
w40 %. Cabe destacar que el valor RF de SiNW - DOX es tan bajo como w2.0 , que es
mucho mejor que eso ( w300 ) de DOX libre en las mismas condiciones experimentales .
A lo mejor de nuestro conocimiento , es el valor ms bajo de RF jams reportada por
vehculos de frmacos basados en nanomateriales ( 3.3e24.7 ) .


La multirresistencia ( MDR) , asociado con la sobreexpresin de la P- glicoprotena ( P- gp
) y la acumulacin de bajada y la retencin de los frmacos en las clulas tumorales ,
sigue siendo un gran reto para el tratamiento del cncer hasta el momento [ 1E3 ] . Para
abordar esta cuestin , se requieren portadores de frmacos para mejorar la
concentracin del frmaco en la regin intracelular de las clulas tumorales [ 4E9 ] .
Factor de resistencia ( RF ) , determinado por la relacin de la concentracin inhibidora
halfmaximal ( CI50 ) valor para la lnea celular resistente a la que para la lnea sensible ,
se considera como un parmetro importante para evaluar la eficacia teraputica de
resistencia cruzada [ 7,10,11 ] . El valor de RF tiene una ubicacin ideal como 1 , lo que
indica la totalidad reverso de la resistencia a los medicamentos . Doxorrubicina libre (
DOX , uno de los agentes de la quimioterapia ms utilizados para el tratamiento del
cncer ) por lo general posee un alto valor de RF, que est previsto que sobreexpresan
del transportador de membrana que bombea activamente DOX fuera de las clulas [ 5E7 ,
12 ] . Portadores de frmacos Notablemente , los nanomateriales (por ejemplo ,
nanopartculas de slice mesoporosos (PN ), NP de oro (AuNPs ) y PN de xido de hierro ,
etc) con sede en con alta capacidad de carga del frmaco recientemente han desarrollado
para mejorar la acumulacin intracelular de los frmacos y reduciendo el valor de RF
[5E7]. La razn es que mientras que los nanomateriales pueden entrar en las clulas por
una va endocitosis, exocitosis de los nanomateriales es independiente de la va de P-gp,
lo que sugiere nanomateriales no son el sustrato de la P-gp [6,13]. Como resultado, en
comparacin con la de (varias decenas o cientos) de DOX libre [5E7, 12], el valor RF de
slice mesoporosa PN-, AuNPs-, o de xido de hierro nanovehculos drogas NPsbased
puede ser claramente reducido a 24,7, 4,67, o 3,3, respectivamente [5E7]. Sin embargo,
nanovehculos drogas de los valores de RF ms bajas siguen siendo en gran demanda
para satisfacer la creciente exigencia de tratamiento contra el cncer ofdrug resistente.

Nanoestructuras de silicio han demostrado una gran promesa para aplicaciones biolgicas
y biomdicas innumerables debido a sus propiedades pticas nicas / electrnicos /
mecnicos y biocompatibilidad favorable [14e26]. Adems, los materiales de silicio se
encuentran para ser fcilmente biodegradable y se elimina a travs del aclaramiento renal
de los ratones con la toxicidad indetectable [27,28]. Por otra parte, el silicio existe
naturalmente en numerosos tejidos como un elemento traza comn [27,28]. Los mritos
anteriores han motivado la investigacin intensiva de silicio
bioapplications basadas nanomateriales, incluyendo nuestro reciente xito en el diseo de
la plataforma basada en nanomateriales en silicio para el diagnstico de cncer y la
terapia [20,22,24 e26]. Cabe destacar que uno de nuestros ltimos estudios revelan que
las molculas de DOX pueden cargar fcilmente en nanocables de silicio (SiNWs) de
estructuras porosas de gran superficie, produciendo nanovehculos basadas SiNWs-
(SiNW-DOX) con capacidad drugloading alta (mg w20800 g? 1) [24]. Sin embargo, sigue
siendo desconoce si tales nanovehculos resultantes estn disponibles para aplicaciones
resistentes a mltiples frmacos.
En este trabajo actual, este tipo de nanovehculos basados SiNWs se emplea para la
investigacin MDR de una manera detallada. Significativamente, en base a estudios
sistemticos de comportamiento in vitro de los nanovehculos basadas SiNWs-, se
demuestra que tales nanovehculos que ofrecen un valor sumamente bajo de RF son
altamente eficaces para revertir la resistencia a los medicamentos. Nuestros resultados
sugieren que los nanovehculos basadas SiNWs-como nanoagents de alto rendimiento
para el tratamiento del cncer de resistencia a frmacos.

2. Seccin Experimental

2.1. Materiales y dispositivos
El cido fluorhdrico (? 40%), perxido de hidrgeno (? 30%), nitrato de plata (? 99,8%),
y cido ntrico (65e68%) se compr a Sinopharm Agentes qumicos Co., Ltd.
(Shanghai, China). Oblea de silicio (100, dopado con fosfato (tipo p), 0.01e0.02 U
sensibilidad) se compra a Hefei Kejing Materials Technology Co., Ltd. (China). DOX se
compra a Huafeng United Technology Co., Ltd (Beijing, China). Milli-Qwater (Millipore) se
emplea como disolvente para la preparacin de soluciones. UVevis absorcin y
fotoluminiscencia (PL) espectros se registran utilizando un PerkineElmer Lambda 750
Espectrofotmetro UVevis-infrarrojo cercano y una HORIBA JOBTN YVON FluoroMax-4
espectrofluormetro, respectivamente. La microscopa electrnica de barrido (SEM) y La
microscopa electrnica de transmisin (TEM) / TEM imgenes de alta resolucin son
capturados por Philips CM 200 microscopio de electrones y microscopa electrnica de
barrido (FEI Quanta 200F), respectivamente.

2.2. Sntesis y caracterizacin de SiNWs

Nanocables de silicio libre (SiNW) arrays se producen a travs de una asistencia del HF
mtodo de grabado tal como se describe en otro lugar [16e22, 24,25]. En nuestro
experimento, oblea de Si se trata en primer lugar por tratamiento con ultrasonidos durante
10 min en solucin de acetona, seguido de lavado con agua Milli-Q para 3 veces. A partir
de entonces, la oblea de silicio se sumergi en una solucin de mezcla (H2SO4 (98%)-
simo de H2O2 (30%), v / v 3:01) para la mitad de una hora, despus de lavado con
agua Milli-Q para tres veces. Despus, el Si resultante oblea se trat con HF ( 5 % )
solucin durante 30 min , produciendo el hydrogenterminatedOblea de Si (Hesi oblea) . El
Hesi oblea como preparada se sumerge inmediatamente en una solucin mixta (HF
AgNO3 ( 10 %) ) con agitacin lenta durante 6 min para producir matrices SiNW en la
superficie de la oblea de Si . Tratamiento por ultrasonidos se realiza entonces de separar
las SiNWs como preparados, que se recogen para la administracin de frmacos en los
siguientes experimentos. SEM, TEM y HRTEM imgenes muestran que el dimetro y la
longitud de SiNW son sobre nm w100 y w500 nm .



2.3. DOX Loading

Para cargar DOX en SiNWs , SiNWs ( 200 mg mL ? 1 disperso en agua) a diferentes
valores de pH se dispersa en varias concentraciones de la solucin de DOX y se agit
durante 12 h, seguido de centrifugacin y lavado tres veces con tampones de fosfato (PB)
a eliminar el exceso de DOX no unido y obtener los SiNWs cargadas de frmaco ( SiNW -
DOX ). El SiNW - DOX son luego re - suspendi y se almacen a 4 C. El DOX carga en
SiNWs se determina por mediciones de espectroscopia de absorbancia de UV - vis - NIR
por la pico de absorbancia a 490 nm . El pico de absorbancia 490 nm con una extincin
molar coeficiente de 0,762 ? 104M ? 1 $ cm ? 1 (calculado a partir de la curva de
calibracin estndar, La figura . S1) se utiliza para determinar la concentracin de DOX .
Cantidad de carga de drogas es calculada de acuerdo con la siguiente ecuacin [ 24 ] :

Capacidad de carga de frmacos = W
inicial DOX
W
DOX en sobrenadante
/ (W
SiNWs
)

Donde W inicial DOx es el peso de DOX inicial aadi, WDOx en el sobrenadante es el
peso de DOX en el sobrenadante y WSiNWs es el peso de SiNWs.

2.4. DOX Liberar complejo SiNW-DOX prepar en el pH de = 9 condiciones se re-
suspendi en soluciones de PB a diversos valores de pH (5, 7, y 9) durante diversos
tiempos (1, 2, 3, 5, 7, 14, y 21 h) a temperatura ambiente. DOX separado de las
superficies SiNWs se recogen a travs de la centrifugacin, cuya concentracin se
determina por el espectro de absorcin UVevis-NIR.

2.5. Cultivo de clulas MCF-7 y MCF-7/ADR lneas celulares, sirvieron como clulas
cancerosas sensibles a frmacos y resistentes a los frmacos, se cultivan en medio
RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) bovino fetal inactivado por calor (FBS) al suero
y 1% (v / v) solucin de penicilina-estreptomicina.
La lnea celular se incuba en una atmsfera de CO2 al 5% a 37 C y 100% de humedad.
Para formacin de imgenes confocal, ensayo de FACS, y de MTT, las clulas se cultivan
en 24 -, 6 -, y 96-as placas (Corning Incorporated, Corning, NY, EE.UU.),
respectivamente. Tres independientes Los ensayos se realizan por triplicado para todas
las mediciones. Las clulas se tratan con conexin SiNWs, DOX libre y SiNW-DOX
complejo para diferentes perodos antes bioqumica anlisis.

2.6. Experimento captacin celular

Clulas MCF-7 y MCF-7/ADR se cultivan en placas de 24 pocillos con tapa se desliza en
1.5? 105/pocillo a 37 C en 5% de CO2 durante 12 h. A continuacin, las clulas se
cultivan en DOXor libre SiNW-DOX-que contiene el medio (que contiene 2 mg ml? 1 DOX)
a 37 C durante 3, 6, 12, y 24 h. Despus, las clulas se lavan con PBS durante tres
veces para eliminar completamente no especfica absorbida de drogas. Para determinar la
localizacin intracelular, Hoechst 33258 se utiliza para la tincin de las clulas durante 30
min. A partir de entonces, se montan las clulas tratadas en las diapositivas en
Fluoromount (Sigma, F4680) con cubreobjetos. Imgenes celulares se realizaron usando
un microscopio de escaneo lser confocal de fluorescencia (Leica TCS-SP5 ) equipado
con varias lneas de lser de argn (458, 476, 488 y 514 nm) y el lser de diodo (405 nm).
Hoechst se excita por el poder el 3% del lser de diodo (lexcitation 405 nm), y DOX son
excitado por el poder el 20% de lser de argn (lexcitation 488 nm). Las ventanas de
emisiones se establecen como los rangos de 420e480 o 550e620 nm para Hoechst 33258
o DOX, respectivamente. Todas las imgenes son capturadas bajo la misma
configuracin instrumental y procesada con el software de anlisis de imagen.

2.7. Dependiente de las vas de energa

Las clulas de siembra densidad se mantiene a 105 clulas / pocillo en placas de 24
pocillos. Para el reducedtemperature condiciones, las clulas se mantienen a 4 C
durante 30 min. Despus de los tratamientos, la DOX libre o complejo SiNW-DOX son co-
cultivadas con clulas durante 1 hora a 4 C. para imagen confocal, cubreobjetos se fija
mediante 4% de paraformaldehdo-4% de sacarosa y montados en portaobjetos de vidrio.

2.8. Fluorescencia clasificacin de clulas activadas (FACS)

Fluorescencia clasificacin de clulas activadas (FACS Calibur de Becton, Dickinson y
Empresa) anlisis se utiliza para cuantificar la fluorescencia de la MCF-7 y MCF-7 /
Clulas ADR tratados con DOX libre o complejo SiNW-DOX, similar a las manipulaciones
para formacin de imgenes confocal como se mencion anteriormente. El DOX libre o
SiNW-DOX complextreated a continuacin, las clulas se trataron con tripsina y se
recogieron en tubos Eppendorf y se lavaron con PBS. Para determinar la fluorescencia
celular, la mezcla se centrifug a 1000 rpm durante 3 min a disponer DMEM y PBS. Las
clulas resultantes, finalmente, se recogen para FACS anlisis. FlowJo software se utiliza
para analizar los datos.

2.9. Localizacin subcelular de DOX

Clulas MCF -7 y MCF-7/ADR se cultivan en placas de 24 pocillos con tapa se desliza en
1.5 105/pocillo a 37 C en 5 % de CO2 durante 12 h . Posteriormente, las clulas se
cultivan enlibre DOX- o SiNW - DOX- que contiene medio (que contiene 2 mgml ? 1 DOX )
a 37 C durante 24 h , seguido por lavado con PBS por tres veces para eliminar
completamente no especfica absorbida de drogas . Para determinar la localizacin
intracelular, las clulas se tieron con Hoechst 33258, y se incubaron con 100 nM
LysoTracker verde DND - 26 ( 30 min ) a visualizar los lisosomas . Luego, las clulas MCF
- 7 y MCF-7/ADR se montan en portaobjetos en Fluoromount con cubreobjetos. Las
clulas se observaron con el microscopio lser confocal. Hoechst se excita por el poder el
3% del lser de diodo ( lexcitation 405 nm ); DOX son excitados por energa 20 % de
lser de argn ( lexcitation de 488 nm ) , y la LysoTracker NOM -26 verde se excita por
el poder el 30% de lser de argn ( lexcitation 476 nm ). La ventanas de emisin se
establecen como 420e480, 550e620 o 500e550 nm para Hoechst 33258, DOX o
LysoTracker Verde DND -26, respectivamente. Todas las imgenes son capturadas bajo
la misma configuracin instrumental y analizadas con el software de anlisis de imagen.

2.10. Ensayo de MTT
Un colorimtrico estndar de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT,
SigmaeAldrich) ensayo se lleva a cabo para determinar la citotoxicidad en nuestro
experimento. En detalle, las clulas MCF-7 y MCF-7/ADR se siembran en Cultivo celular
de 96 pocillos placa a 1? 104/pocillo, seguido de incubacin a 37 C bajo 5% de CO2
durante 12 h. Despus, las clulas se incubaron con concentraciones en serie de DOX
libre, SiNWs, o SiNW-Dox. A continuacin, 20 ml de stock de MTT (5 mg ml? 1) se aade
a cada pocillo, y las clulas se cultivaron a 37 C durante 4 h. Acidificado dodecil sulfato
de sodio (SDS) se utiliza para lisar las clulas. La absorbancia a 570 nm se prob
utilizando el lector de microplacas (Bio-Rad 680, EE.UU.). Tres ensayos independientes
se realizaron por triplicado para todas mediciones.

2.11. Clculo de IC50 y los valores de RF
Los valores de IC50 y de RF se calculan a travs de mtodos bien estudiados, como se
describe en los informes anteriores [7]. La viabilidad celular se determin a las 72 h
utilizando el ensayo MTT. Un paquete de software de origen establecido se emplea para
calcular los valores de IC50 sobre la base de curvas dosis-respuesta. La RF se calcula a
partir de los valores de CI50 en el punto de tiempo de 72 h dividiendo la IC50 de clulas
MCF-7/ADR porque de las clulas MCF-7 clulas.

2.12. La formacin del citoesqueleto de la clula

Clulas MCF-7 y MCF-7/ADR se cultivan en placas de 24 pocillos con tapa se desliza en
1.5? 105/pocillo a 37 C en 5% de CO2 durante 12 h. A continuacin, las clulas se tratan
con medio RPMI-1640, libre de DOX (2 mg ml? 1), o complejo SiNW-DOX (2 mg ml? 1
DOX) durante 24 h. Despus del tratamiento, las clulas se fijaron con paraformaldehdo
al 4%-4% de sacarosa durante 20 min y se bloquearon con PBS que contena BSA al 4%
durante 40 min. El citoesqueleto est marcado con faloidina marcada con FITC 300 nM
(Sigma, EE.UU.) durante 30 min, seguido de lavado con PBS que contena 0,1% de
Tween 20 por 3 veces. Hoechst 33258 (3 mg ml? 1) se utiliza para la tincin de los
ncleos durante 5 min.

3. Resultados y discusin

3.1. Sntesis de complejo de SiNW - DOX Un mecanismo convencional de la MDR se
ilustra en la figura. 1a. En breve, las molculas de DOX libre difunden directamente a
travs de las membranas celulares intactas, y luego son bombeados rpidamente fuera
de las clulas cancerosas resistentes a los frmacos con sobreexpresan de P - gp. Como
resultado, las molculas de DOX libre apenas se acumulan en los ncleos de clulas,
conduciendo a alta RF y pobre eficacia teraputica [5E7] . En nuestro modelo (Fig. 1b) la
prueba de concepto, se propone complejo SiNW - DOX acceder al citoplasma a travs de
endocitosis, produciendo endo / lisosoma distribuido con el SiNW - DOX (Paso 1).
Despus, las molculas de DOX cargados en los SiNWs se liberan de manera eficiente en
la endo / lisosoma que ofrece ambiente cido (Paso 2). Tales molculas de DOX liberados
a partir de entonces penetrar a travs del medio intracelular, llegando finalmente a los
ncleos de las clulas y de intercalacin entre pares de bases de ADN. Por lo tanto,
funcin de plantilla de ADN y, posteriormente, ARN y la sntesis de protenas se inhiben
de manera eficiente, lo que lleva a la destruccin distinta de las clulas cancerosas [29].

En nuestro experimento, el complejo SiNW-DOX se prepara fcilmente a travs de la
interaccin de las molculas de DOX con superficie porosa de SiNWs y las interacciones
dbiles de DOXeDOX (Ver caracterizaciones en la informacin de apoyo, fig. S2E5),
como se describe en el protocolo se inform anteriormente [24]. La figura. 1c presenta
una imagen de microscopa tpico electrnica de transmisin (TEM) del complejo SiNW-
DOX preparado, que muestra una capa obvia DOX en la superficie SiNW. Como se
presenta en La figura. 1d, similar a la solucin acuosa dispersa con DOX pura, la solucin
SiNW-DOX resultante presenta una solucin transparente de color rojizo; por el contrario,
la solucin SiNWs puros es turbia debido a la escasa capacidad de dispersin acuosa.
Estos resultados indican absorbancia xito de DOX en la superficie SiNWs y excelente
capacidad de dispersin acuosa de la SiNW-DOX, que se atribuye a las molculas de
DOX hidrfilos masivos adsorbidos sobre SiNWs.

La figura. 1e y f muestra la carga y la liberacin de los comportamientos de DOX en
SiNWs a valores de pH variaron. Una curva estndar establecida (Fig. S1) se emplea para
el measurment de la concentracin de DOX . Especficamente, la capacidad de carga de
DOX (definido como relacin en peso de DOX / SiNW ) aumenta a medida que aumenta
el valor de pH de 5 , 7 , a 9 en los tampones de carga (Fig. S6). Por otra parte, la eficacia
de carga de DOX se estudia en trminos de diversas concentraciones de DOX bajo la
misma concentracin de SiNWs ( 200 mg ml? 1 ) . La figura. 1e muestra que, una
eficiencia de carga mxima se destapa cuando la concentracin de DOX es mayor que
320 mg ml? 1 bajo la condicin de carga actual. El perfil de liberacin de frmaco de
complejo SiNW -Dox se investig a diferentes valores de pH, mediante la incubacin de
complejo SiNW - DOX en el pH 9, 7, y 5. Las concentraciones de DOX liberado se miden
por UV-vis medicin de sobrenadantes de complejo SiNW - DOX. Aproximadamente el 10
% de DOX se libera de SiNWs a pH 7 o 9, que est en agudo Contrato a W50 % de DOX
liberada a un pH de 5 a 20 h, lo que indica que DOX separa gradualmente del complejo
SiNW - DOX como disminuciones de pH (Fig. 1f) . Del mismo modo, dentro de las clulas,
como endo / lisosoma convertido acidifica, la interaccin entre DOX y la superficie SiNWs
debilita, lo que permiteDOX que se publicar en el endo / lisosoma.

3.2. Internalizacin y liberacin del frmaco intracelular de SiNW - DOX

complejo Interrogar internalizacin y comportamientos de liberacin de frmacos
intracelulares del complejo SiNW - DOX , tratamos a las clulas cancerosas ( DOX-
sensibles) MCF- 7 y las clulas MCF-7/ADR ( contraparte DOX- resistente ) con DOX libre
y complejo SiNW - DOX , y la imagen de las clulas en diferentes puntos ( 3 , 6,12 y 24 h )
despus del tratamiento con lser de barrido microscopa confocal ( LSCM , . Fig. 2aed) .
DOX con seales rojas son monitoreados por LSCM. Tpicamente, para la clula de DOX
- sensible MCF 7 lnea (Fig. 2a ) , libre de DOX muestra una tincin exclusivamente
nuclear, mientras que las clulas MCF-7/ADR DOX resistentes muestran meramente dbil
DOX seales (Fig. 2b ) . En agudo contraste, DOX fluorescencias en tanto clula lneas
tratadas por el complejo SiNW - DOX muestran patrones similares (Fig. 2c y d) , es decir ,
de DOX de fluorescencia es ms intensa en el citoplasma que en el ncleo , sin embargo,
con una prominente tincin nuclear . Los resultados muestran que las clulas tratadas con
el SiNWDOX complejo para 3 o 6 h retener el componente nanocompuesto de de
incubacin, que isw5-veces mayor que (w20) de la clula MCF-7/ADR tratado por DOX
libre en las mismas condiciones del experimento, lo que se atribuye a la distribucin
dominante de molculas de DOX entregados desde el complejo de SiNW-DOX, as
coherente con la resultados observados en LSCM (Fig. 2d). Para asegurarse de que la
absorcin de complejos SiNW-DOX es impulsado por endocitosis activa, tratamos las
clulas con el SiNW-DOX bajo una temperatura no fisiolgica de 4 C y evaluamos
acumulacin DOX por LSCM. Como se muestra en la figura. 3, para las clulas tanto
MCF-7 y MCF-7/ADR, seales coloreadas distintas de DOX son detectables en el
citoplasma cuando se incubaron con complejo SiNW-Dox a 37 C durante 1 h (Fig. 3a).
En agudo contraste, la incubacin del complejo SiNW-DOX a 4 C durante 1 h muestra
poca tincin de DOX en ambas lneas celulares (Fig. 3b). Tal internalizacin deprimido
significativa de DOX a 4 C de incubacin sugiere que complejo SiNW-DOX entra en las
clulas a travs de endocitosis dependiente de la energa.

3.3 . Localizacin subcelular de complejo SiNW - DOX

Lisosomal inducida pH de liberacin eficiente intracelular de DOX de las SiNWs se conoce
como un tema crtico para el tratamiento del cncer de alta eficiencia. Para ilustrar este
problema, se incuban las clulas MCF -7 y MCF-7/ADR con 2 mgml ? 1 de DOX libre o
complejo SiNW - DOX durante 24 horas y luego vuelva a colocar el medio de cultivo con
una nueva. Las clulas se tieron con LysoTracker verdes DND - 26 (seales verdes) y
Hoechst - 33258 (seales azules) para observaciones LSCM. Como se muestra en la
figura. 4a, para tratados con DOX MCF - 7 clulas libres, molculas de DOX se
distribuyen predominantemente en los ncleos, y se detecta una pequea cantidad de
DOX en el citoplasma despus de 24 h de incubacin. En el caso de las clulas MCF-
7/ADR, se observan seales dbiles de molculas de DOX despus de 24 h de
incubacin, que es el resultado de los efectos de flujo de salida de la Pgp ( fig. 4b ) . En
agudo contraste, para las dos lneas de clulas tratadas por el complejo SiNW - DOX , la
fluorescencia intracelular DOX ( rojo ) se puede observar claramente en el citoplasma ,
lisosoma , y los ncleos , as colocalized por LysoTracker verde y Hoechst - 33258 (Fig.
4C y d). Estamos razn de que el ambiente cido (pH 5.0) del lisosoma conduce a la
liberacin de gran eficacia de DOX del complejo SiNW-DOX, que posteriormente son
objeto de trata en los ncleos, bien apoyado por los resultados como se explica en la
figura. 2c y d (por ejemplo, molculas de DOX reside gradualmente en los ncleos de
clulas durante 12 - y 24-h de incubacin). Por lo tanto, persistente y suficiente
concentracin de DOX, el resultado de la acumulacin prolongada y ms lento observado
de DOX en los ncleos, facilita el tratamiento de alta eficacia de las clulas tumorales de
una manera a largo plazo.

3.4. Efecto de complejo SiNW - DOX en el citoesqueleto de la clula

Para averiguar el mecanismo de aumento de la citotoxicidad, la organizacin del
citoesqueleto en clulas MCF - 7 o MCF-7/ADR se evala por la formacin de actina
como se determina por tincin con faloidina marcada con FITC. Como se muestra en la
figura. 5a y b, ambos grupos de control , es decir , las clulas MCF - 7 y MCF-7/ADR sin
ningn tratamiento , muestran una red de fibras de estrs bien formadas de morfologa
filamentosa normal. Protenas actina estn bien organizadas en haces gruesos forman las
fibras de estrs que se extienden entre la superficie de la clula y el citoplasma (Fig. 5a,
izquierda). Comparativamente, la actina en clulas MCF-7 tratadas por DOX libre o SiNW
- DOX est completamente perturbado y desorganizada, lo que lleva a la agregacin y la
formacin de puntos obvios como las estructuras (Fig. 5a, centro y derecha). Para las
clulas MCF-7/ADR, no hay distintos cambios en la organizacin de la actina en el
citoesqueleto de las clulas MCF-7/ADR en presencia de 2 mg ml? 1 DOX (Fig. 5b,
medio), similar a la de grupo de control. En marcado contraste , el grupo tratado con
SiNW - DOX aparece parcialmente despolimerizada con fibras de estrs incompletas en la
mayora de las clulas , lo que indica una mayor citotoxicidad considerablemente debido a
la absorcin de DOX mejora en las clulas MCF-7/ADR (Fig. 5b ).

3.5. La superacin de la MDR para aumentar la eficacia teraputica

En el seguimiento de los estudios, verificamos ms SiNW-DOX complexinduced mejora
clara de la eficacia contra el cncer. La figura. 6 Muestra que tanto SiNW - DOX y DOX
libre produce toxicidad severa a clulas MCF-7 , cuya viabilidad celular se claramente
reducida a < 30 % en 20 mg ml ? 1 DOX de 72 h de incubacin. En fuerte contraste, las
viabilidades de clulas MCF-7/ADR no muestran una disminucin significativa de la
incubacin con 20 mg ml? 1 DOX libre, y alrededor de 86 % de supervivencia de las
clulas MCF-7/ADR pueden mantenerse incluso a las 72 h Debido de funcionamiento P-
gp en la modulacin de flujo de salida de drogas (Fig. 6b). De particular inters, en
trminos de clulas MCF-7/ADR tratados con SiNW - DOX ( 20 mg ml ? 1 DOX) , la
viabilidad de las clulas disminuye significativamente tow30 % a 72 h de incubacin ,
similar a la de las clulas MCF - tratada SiNW - DOX -7 clulas . Estos resultados
demuestran que la entrega de DOX SiNWs mediada muestra significantenhancement de
la eficiencia contra el cncer de DOX libre, ya que el complejo SiNW - DOX puede omitir
la bomba de eflujo de P-gp y se acumulan en las clulas , lo que lleva a una acumulacin
de la concentracin de frmaco en las clulas thewhole . Vale la pena sealar que SiNWs
puros sin DOX carga no muestra citotoxicidad significativa a MCF- 7 o MCF-7/ADR
clulas incluso en 72 h de incubacin (Fig. 6a yb ) , lo que sugiere que se trata de la DOX
entregado por los SiNWs que deberan ser responsables de la citotoxicidad .

Los valores de IC50 y de RF se calculan sobre la base de investigacin de la citotoxicidad
inducida por variadas concentraciones de DOX en una manera detallada. La figura. 6c
muestra que la viabilidad celular de clulas MCF-7 se aprieta en gran medida cuando son
tratados por el complejo SiNW-DOX o DOX libre.

Tpicamente , la viabilidad celular se obviamente reduce a W55 % o W30 % cuando las
clulas se tratan con baja concentracin del complejo SiNW - DOX o DOX libre (por
ejemplo , 1.25e2.5 mgml ? 1 DOX ) durante 72 h , y nuevas cadas a w20e30 % o w15e30
% a concentraciones altas (por ejemplo, 5e20 mg ml ? 1 DOX ) , respectivamente . La
relativamente mayor toxicidad de DOX libre se debe a la difusin rpida de DOX libre de
la membrana celular a la ncleo ; en contraste , para las clulas tratadas complejas -
SiNW - DOX , DOX molculas deben ser puestos en libertad por primera vez para la
SiNW - DOX distribuidos en lisosoma [ 7,12 ] . Sobre la base de la discusin anterior,
junto a los resultados se muestra en la figura . (Por ejemplo, tratados con DOX MCF- 7
clulas libres S7 exhiben w95 % la viabilidad celular a 0,08 mg ml ? 1 , que se reduce
gradualmente a W60 , W35 , W35 , W30 o % acompaado con la concentracin de DOX
pasando de 0,16 , 0,32 , 0.625e1.25 mg mL ? 1 , respectivamente) , que por lo tanto
deducir fcilmente el valor IC50 de SiNW - DOX o DOX libre es 2.83? 0,37 0,20 ? 0,02
mg ml? 1, respectivamente. Para MCF-7/ADR clulas, la viabilidad no muestra una clara
disminucin durante el tratamiento por DOX libre a bajas concentraciones ( 1.25e10 mg
mL? 1 DOX). Mientras De concentracin de DOX nuevos aumentos de 20 a 80 mg ml ? 1
, de clulas viabilidad preserva > 40 % ( lnea azul en . Fig. 6d), que se atribuye a P - gp
funcionamiento en la modulacin de eflujo de frmaco. En agudo contraste, la Complejo
SiNW - DOX causa mejorado sustancialmente la citotoxicidad a MCF-7/ADR clulas,
dando lugar a disminucin significativa de la viabilidad celular en concentraciones DOX de
serie (es decir, w70 , w60 , w50 , w45 , w35 , w25, W15, orw10% de la viabilidad celular
corresponde a 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, o 80 mg ml? 1 de las concentraciones de DOX,
respectivamente). Los resultados sugieren que, en el caso de las clulas MCF-7/ADR, el
valor IC50 de SiNWDOX o DOX libre es igual a 5,65? 0,99 o 61,46? 2,54 mg ml? 1,
respectivamente. Sobre la base de una ecuacin bien establecida como sigue [30],

RF= IC50
sublinea resistente
/ IC50
linea de celula aprental


Donde sublnea resistente IC50 IC50 o lnea celular parental representa el valor de la
concentracin inhibitoria halfmaximal para la lnea celular resistente o la lnea celular
sensible, respectivamente, el valor RF de DOX libre por lo tanto es igual a w300 en
nuestro clculo, que es comparable a la reportada en publicaciones anteriores (por
ejemplo, Nel y compaeros de trabajo describen valor RF de DOX libre como w250 [12].).
De particular importancia, el valor de RF del complejo SiNW-Dox se calcula como 2.0,
mucho menor que la de DOX libre o portadores se inform anteriormente basados
nanomateriales con las drogas (3.3e24.7) [5E7].