REVISIONES DE GENTICA Bases cromosmicas de las alteraciones genticas humanas * Composicin de la Comisin: V. Daz Golpe (Presidente), C. Alonso Cerezo, M. Baiget, C. Caadas Castaeda, A. Carrillo, O. Dez Gibert, B. Ezquieta, M. Lucas, J. Molano, A. Snchez de Abajo, J. Oriola, A. Romero Alfonso 1 Unidad de Gentica Servicio de Anlisis Clnicos Hospital Universitario de La Princesa. Madrid Comisin de Gentica Molecular* Preparado por: C. Alonso Cerezo 1 NDICE 1. Introduccin 2. Ciclo celular 3. Alteraciones cromosmicas 3.1 Anomalas numricas de los cromosomas 3.2. Anomalas estructurales de los cromosomas 4. Tcnicas de estudio de los cromosomas: citogentica 4.1 Citogentica convencional (cariotipo de bandas G) 4.2. Citogentica molecular (hibridacin in situ con fluorescencia) 4.3 CGH (hibridacin genmica comparada) 4.4 Cariotipo multicolor (SKY-FISH) 5. Origen y consecuencias de las alteraciones cromosmicas 5.1. No disyuncin en la mitosis 5.2. No disyuncin en la meiosis 5.3 Reordenamientos estructurales 1. INTRODUCCIN Los cromosomas son estructuras filiformes formadas por cromatina presentes en el ncleo de las clulas. Cuando la clula se divide, la cromatina nuclear se condensa y toma la apariencia de orgnulos en forma de bastoncillo que se denominan cromosomas (Chroma, color y soma, cuerpo) porque se tien con algunos colorantes biolgicos. La cromatina est formada por cido desoxirribonucleico (ADN) y complejos de protenas. Los genes se encuentran a lo largo de los cromosomas en un locus o posicin concreta. La citogentica humana estudia las caractersticas de los cromosomas, su estructura y su herencia. El conjunto de los cromo- somas constituye el cariotipo. En 1956, en Zaragoza, Tjio y Levan establecieron el nmero de cromosomas de las clulas somticas humanas: cuarenta y seis cromosomas, que se dividen en cuarenta y cuatro autosomas, iguales en hombres y mujeres, y dos cromosomas sexuales, XY en hombres y XX en mujeres. Los cromosomas homlogos o miembros de un par contienen los mismos loci genticos en la misma secuencia. En condiciones normales, se hereda un miembro de cada par cromosmico del padre, y el otro de la madre. El cromosoma tiene una morfologa linear con dos cromtides que se unen por el centrmero y le divide en un brazo corto o brazo p (petite) y un brazo largo o brazo q. Los extremos de cada cromosoma se denominan telmeros. Algunos cromosomas pre- sentan satlites en el brazo corto (figura 1a). Los cromosomas poseen un patrn de bandas caractersticas que se ubican en regiones y se enumeran desde el centrmero hacia el telmero del brazo correspondiente. Una banda se define por el nmero de cromosoma, el smbolo del brazo, el nmero de la regin y el nmero de la banda dentro de la regin (figura 1b). Se ha estanda- rizado la descripcin del cariotipo normal y patolgico a travs del Sistema Internacional de Nomenclatura para la Citogentica Hu- mana (ISCN) (1). Esta clasificacin se basa en el tamao de los cromosomas y en la posicin del centrmero. Si el centrmero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos presentan aproxi- madamente igual longitud se denominan metacntricos. Cuando la longitud de un brazo del cromosoma es algo menor que la del otro se denominan submetacntricos. Cuando un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q) se denominan acrocntricos. En la especie humana no existen los cromosomas telocntricos, con el centrmero en un extremo. As pues los cromosomas se clasifican en siete grupos (tabla I). 2. CICLO CELULAR El ciclo celular (2,3) es el proceso ordenado y repetitivo en el tiempo en el que la clula crece y se divide en dos clulas hijas. La clula puede encontrarse en dos estados claramente diferenciados: la interfase y el estado de divisin celular (figura 2). La interfase es el estado de no divisin en el que la clula realiza sus funciones especficas. Si va a avanzar a la divisin celular, comienza por realizar la duplicacin de su ADN. En un tpico cultivo celular en crecimiento esta fase es la ms larga del ciclo celular ocupando un total de 16 a 24 horas, mientras que la divisin celular slo dura 1 a 2 horas. La interfase comprende tres etapas o fases: G1, S y G2. Figura 1. a) Morfologa de los cromosomas. b) Patrn y definicin de las bandas del cromosoma 1 Qumica Clnica 2007; 26 (4) 225 Bases cromosmicas de las alteraciones genticas La divisin celular es la parte del ciclo celular en la que una clula madre o inicial se divide en dos para formar dos clulas hijas. Existen dos tipos de divisin celular: la mitosis y la meiosis. Durante la divisin mittica en las clulas somticas se generan dos clulas hijas con la misma dotacin cromosmica y gentica que la clula madre. Durante la divisin meitica en las clulas germinales se produce la formacin de clulas reproductivas (gametos) con 23 cromosomas: 22 autosomas y un cromosoma sexual (X o Y). Las clulas somticas son diploides, tienen 46 cromosomas, mientras que los gametos son haploides, tienen 23 cromosomas. Las alteracio- nes numricas o estructurales de los cromosomas debido a errores en la divisin celular pueden ocurrir en las clulas somticas o en los gametos pudiendo producir alteraciones importantes desde el punto de vista clnico como malformaciones congnitas, retraso mental, infertilidad, abortos o cncer. En la divisin mittica o mitosis se produce el reparto idntico del material gentico en cada clula hija, duplicado en la fase S de la interfase. Se distinguen cinco etapas: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. El proceso de divisin se completa mediante la citocinesis o divisin del citoplasma que se produce despus de la cariocinesis, divisin del ncleo, obteniendo dos clulas hijas genticamente iguales. La divisin meitica o meiosis es un proceso en el que una clula diploide (2n), experimenta dos divisiones celulares sucesi- vas (meiosis I y meiosis II) y genera gametos haploides (n). Ambas comprenden varias fases: profase, metafase, anafase y telofase. Durante la meiosis I el nmero de cromosomas disminuye de diploide a haploide por la unin de los homlogos en la profase y su segregacin en anafase. En la meiosis II las cromtidas se separan y se distribuyen en los ncleos de cada clula hija. Durante la meiosis I, en la lnea germinal de los vulos humanos se produce un estado de latencia hacia el sptimo mes del desarro- llo embrionario, y su proceso de meiosis continuar cuando se alcance la madurez sexual. A esta pausa se le denomina dictiotena. Cada clula hija tiene la mitad del nmero de cromosomas con dos cromtidas hermanas cada una. Durante la citocinesis en la espermiognesis el citoplasma se divide en partes ms o menos iguales mientras en la ovognesis casi todo el citoplasma va a una clula hija resultando un oocito secundario que despus formar el vulo, y otra clula hija se transforma en el corpsculo polar. Durante la meiosis II se distinguen cinco etapas similares a una mitosis estndar: interfase II, profase II, metafase II, anafase II y telofase II. Al final de la meiosis se forman nuevas membranas nucleares y se produce la citocinesis. En las clulas hijas de los gametos de los varones, el citoplasma se reparte de forma equita- tiva, mientras que en gametos de las mujeres el citoplasma se divide de forma desigual formando otro oocito y otro corpsculo polar. A veces, el corpsculo polar que se ha formado durante la meiosis I, tambin se divide y se obtienen tres corpsculos polares al final de la meiosis. 3. ALTERACIONES CROMOSMICAS Se estima que la frecuencia de las alteraciones cromosmicas en la poblacin es 9,2 por cada 1000 nacimientos (4), en los abortos espontneos de un 50% y en los nacidos muertos de un 5% (5). Las alteraciones cromosmicas pueden ser numricas o estructurales. 3.1 Anomalas numricas de los cromosomas Entre las anomalas numricas cromosmicas se encuentra la poliploida y la aneuploida. La poliploida consiste en la presencia de un grupo completo de cromosomas mltiplo de 23 adicionales en la clula. La triploida (69 cromosomas) y la tetraploida (92 cromosomas) producen abortos espontneos y todas son incompatibles con una superviven- cia a largo plazo. La aneuploida se define como aquellas clulas que contienen un nmero de cromosomas no mltiplo de 23 y presentan ganancia o prdida de cromosomas. Se trata de monosomas o trisomas que afectan a un cromosoma aunque puede implicar a ms de uno. Pueden afectar a los autosomas o a los cromosomas sexuales. Las monosomas autosmicas son casi siempre letales. En la trisoma 13 o sndrome de Patau y en la trisoma 18 o sndrome de Edwards se producen abortos de forma espontnea en el 95% de los fetos afectados. La trisoma 21 o sndrome de Down es compatible con la vida. Respecto a las aneuplodas de los cromosomas sexuales son compatibles con la vida excepto la completa ausencia del cromosoma X. Pueden ser monosoma del cromosoma X (sndrome de Turner), XXY (sndrome de Klinefelter) y trisoma X. 3.2. Anomalas estructurales de los cromosomas Entre las alteraciones estructurales encontramos diversas ano- malas: translocaciones, inserciones, inversiones, isocromosomas, A 1 y 2 Metacntricos 2 Submetacntrico B 4 y 5 Submetacntricos C 6 al 12, X Submetacntricos D 13 al 15 Acrocntricos E 16 Metacntrico 17 y 18 Submetacntrico F 19 y 20 Metacntrico G 21 y 22 Acrocntricos Y Submetacntrico Tabla I. Clasificacin de los cromosomas en grupos segn el Sistema Internacional de Nomenclatura para Citogentica Humana (ISCN) (2) Grupos Cromosomas Posicin del centrmero Figura 2. Ciclo celular. Fases. S, sntesis de ADN, M , mitosis. 226 Qumica Clnica 2007; 26 (4) Qumica Clnica 2007; 26 (4) 224-228 REVISIONES DE GENTICA duplicaciones, deleciones y reordenamientos complejos. Algunas abreviaturas citogenticas utilizadas siguiendo la nomenclatura ISCN (2) se indican en la tabla II. 4.1 Citogentica convencional (cariotipo de bandas G) El anlisis citogentico convencional consiste en el estudio de las alteraciones cromosmicas en las metafases de las clulas obtenidas tras el cultivo in vitro y la adicin de un mitgeno especfico para los linfocitos T, la fitohemaglutinina. En las clulas obtenidas se pueden estudiar la morfologa de los cromosomas pudiendo detectar tanto las alteraciones numricas como las es- tructurales presentes en todo el genoma despus de teir con tripsina-giemsa (bandas G). 4.2. Citogentica molecular (hibridacin in situ con fluorescencia) Las tcnicas de hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) se basan en la hibridacin de una sonda de ADN marcada con una sustancia fluorescente sobre su secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosmica o en el ncleo de la interfase. Pueden utilizarse para identificar los reordenamientos cromosmicos particulares o bien para diagnosticar la existencia de aneuploidas con rapidez. Solamente detecta aquella alteracin para la cual est diseada la sonda de ADN marcada con fluores- cencia. Existen sondas de ADN de distintos tipos: centromricas (mar- can nicamente las zonas centrmericas), de secuencias especfi- cas de locus (marcan regiones cromosmicas de secuencia nica) o de pintado cromosmico (marcan todo un cromosoma). 4.3 CGH (hibridacin genmica comparada) Se desarroll a principio de los aos noventa. No es necesario obtener clulas en crecimiento porque esta tcnica emplea ADN tumoral. Se basa en la hibridacin competitiva de dos ADNs, (tumoral y control normal) marcados con distintos fluorocromos, sobre cromosomas normales y permite, por tanto, la deteccin de ganancias y prdidas de regiones cromosmicas en todo el genoma del tumor por la comparacin de las intensidades de las seales de hibridacin. En un tumor sin alteraciones cromosmicas, el resul- tado da lugar a cromosomas amarillos debido a que la cantidad de ADN marcado en rojo (ADN no patolgico) y verde (ADN tumoral) es la misma (mezcla 1:1 de rojo y verde). Si el tumor tiene una delecin o prdida, aparece en rojo debido a que hay ms cantidad de ADN normal para hibridar en esa regin cromosmica. Si el tumor contiene alguna ganancia cromosmica, la cantidad de ADN tumoral para hibridar es mayor, y esa zona se hibridar en una mayor proporcin de fluorocromo verde del tumor (7). 4.4 Cariotipo multicolor (SKY-FISH) El cariotipo multicolor SKY es una tcnica de citogentica molecular, y de momento slo se utiliza en el campo de la investigacin. Este mtodo se basa en la utilizacin de 24 sondas de ADN (una para cada cromosoma humano) marcadas con una combinacin de diferentes fluorocromos y en la aplicacin de complejos sistemas de anlisis de imagen. La tcnica de SKY, mediante la tecnologa espectral, analiza el espectro de emisin de cada uno de los pxeles de la imagen y asigna un color artificial a cada pxel dependiendo de su espectro para lograr la imagen multicolor (8). Se utiliza para caracterizar correctamente translocaciones complejas, y tambin para detectar alteraciones cromosmicas crpticas en cariotipos aparentemente normales. Abriviacin Significado del delecin der cromosoma derivado di cromosoma dicntrico dup duplicacin i isocromosoma ins insercin inv inversin mar cromosoma marcador rcp translocacin recproca rob translocacin robertsoniana t translocacin upd disoma uniparental Tabla II. Abreviaturas citogenticas segn el Sistema Internacional de Nomenclatura para la Citogentica Humana (ISCN) (2) Se define como una translocacin al intercambio de material gentico entre cromosomas no homlogos. Tiene una prevalencia de 1/500 individuos. Pueden ser recprocas o robertsonianas. Se denominan translocaciones recprocas cuando las roturas suceden entre cromosomas diferentes y se produce un intercambio de material. Las translocaciones robertsonianas ocurren entre los cromosomas acrocntricos no homlogos que pierden los brazos cortos (son muy cortos y contienen material gentico no esencial) y los brazos largos se unen por los centrmeros. Estos individuos presentan 45 cromosomas. La ms frecuente es la translocacin robertsoniana de los cromosomas 14 y 21. Los portadores de translocaciones robertsonianas suelen tener fenotipos normales pero sus descendientes pueden presentar un fenotipo anormal por presentar una monosoma o trisoma parcial, o un brazo largo de un cromosoma acrocntrico de ms o de menos (6). La insercin es una anomala cromosmica en la que el material de un cromosoma se inserta en otro cromosoma no homlogo. La inversin consiste en dos roturas en un cromosoma y se inserta el fragmento perdido en sentido inverso. Pueden ser pericntricas, si incluyen el centrmero, o paracntricas si no incluyen el centromro. Los isocromosomas resultan de la divisin de un cromosoma por el eje perpendicular a su eje de divisin habitual y consiste en que un brazo est duplicado (y forma dos brazos de igual longitud, con los mismos loci en secuencias invertidas) y el otro brazo est delecionado. Las deleciones o duplicaciones consisten en una prdida (delecin) o ganancia (duplicacin) de un segmento cromosmico que genera un desequilibrio cromosmico. Los reordenamientos complejos se producen cuando se implican tres o ms cromosomas y son raros en personas con fenotipo normal. 4. TCNICAS DE ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS: CITOGENTICA Se denomina citogentica al rea de la gentica que se dedica al estudio de los cromosomas, su estructura y su herencia. Tjio y Levan desarrollaron tcnicas efectivas para el estudio cromosmico. Desde entonces se han desarrollado diversas tcnicas que se utilizan en la clnica habitualmente. Qumica Clnica 2007; 26 (4) 227 Bases cromosmicas de las alteraciones genticas 5. ORIGEN Y CONSECUENCIAS DE LAS ALTERACIONES CROMOSMICAS 5.1. No disyuncin en la mitosis Las lneas celulares se establecen en el individuo durante el desarrollo embriolgico y forman parte de su constitucin cromosmica. Se denomina mosaicismo, la coexistencia en un mismo individuo de dos o ms lneas celulares con diferente dotacin cromosmica. Se puede producir una situacin indistinguible del mosaicismo debido a la unin de dos concepciones diferentes coexistiendo una o ms lneas celulares en un individuo. Este suceso se denomina quimerismo. Una causa frecuente de mosaicismo es la no disyuncin en una divisin mittica temprana. La no disyuncin se define como el fallo de los cromosomas homlogos para segregar simtricamente en la divisin celular. Si ocurre en un cigoto inicialmente normal (46N), genera mosaicismo con lneas celulares trismicas y monosmicas, as como lneas celulares normales. Si la no disyuncin poscigtica ocurre en un cigoto trismico para un autosoma, entonces la copia del homlogo de ms se pierde y la clula trismica se convierte en 46N. La mayora de los mosaicos trismicos/dismicos 13, 18, 21 y X se producen de esta forma (9). Cuando la conversin de trisoma a monosoma ocurre en fases muy tempranas de la gestacin, la prdida de un cromosoma puede ocasionar un embrin dismico biparental normal o disoma uniparental (UPD). A este evento se le denomina correccin o rescate poscigtico. La disoma uniparental supone la presencia de una pareja de cromosomas homlogos, ambos procedentes del mismo progenitor en un individuo o lnea celular dismica. Puede ser isodisoma, cuando existen dos copias exactamente iguales del padre o de la madre, o heterodisoma, cuando existen dos copias diferentes de un par cromosmico del padre o de la madre (10,11). El rescate o correccin poscigtica se puede diagnosticar en el estudio prenatal, si el cariotipo de la muestra de vellosidades corinicas presenta una trisoma y la muestra de lquido amnitico presenta disoma. Caso clnico: mujer recin nacida que presenta pabellones auriculares pequeos, hueso occipital plano, hendiduras palpebrales con ligera inclinacin hacia arriba. Se realiza un cariotipo en sangre perifrica presentando en el 50% de las metafases 47 cromosomas con 3 cromosomas 21 de estructura aparentemente normal y frmula sexual XY; el otro 50% de las metafases presentan 46 cromosomas con frmula sexual XX. Resultado: 47,XX,+21/46,XX, sndrome de Down en mosaico. Se confirma mediante la tcnica de FISH (figura 3). 5.2. No disyuncin en la meiosis Si se produce un fallo en la separacin de los cromosomas homlogos en la meiosis I, una clula hija tendr dos cromo- somas (dismica) y la otra no tendr ninguno (nulismica). Si la meiosis I ocurre de forma normal y la no disyuncin ocurre en la meiosis II, las cromtides no se separan. Despus de la fertilizacin, si asumimos que el otro gameto es normal, el cigoto ser trismico o monosmico. Si los padres tienen una dotacin cromosmica normal, la descendencia trismica o monosmica se denomina trisoma o monosoma primaria. Caso clnico: varn de 32 aos, que presenta infertilidad desde hace 6 aos y 2 seminogramas con el resultado de azoospermia. Presenta un fenotipo de 1 metro 95 cm de estatura, delgado, piernas largas y signos de hipogonadismo. Al realizar el estudio del cariotipo en sangre perifrica presenta 47 cromosomas de estruc- tura aparentemente normal y frmula sexual XXY en las 20 metafases estudiadas. Resultado: 47,XXY sndrome de Klinefelter (figura 4). Figura 3. a) Cariotipo en sangre perifrica del sndrome de Down, 47,XX+21. b) Hibridacin in situ con fluorescencia mediante la utilizacin de la sonda centromrica del cromosoma 21 Figura 4. Sndrome de Klinefelter 47,XXY. 5.3 Reordenamientos estructurales Los reordenamientos estructurales de los cromosomas se pueden producir durante la meiosis cuando los cromosomas homlogos se alinean de manera inapropiada. Tambin se pueden producir roturas cromosmicas durante la meiosis o mitosis. Cuando las roturas se mantienen o se reparan de forma inapropiada se altera la estructura del cromosoma. Las anomalas estructurales pueden ser equilibradas (balanced), si no existe prdida ni ganancia de material gentico, o desequilibrada (unbalanced) si existe prdi- da o ganancia de ste. Los reordenamientos estructurales surgen de novo en un individuo cuando sus progenitores no son portadores de la alteracin, o bien puede ser heredada de alguno de sus progeni- tores. Caso clnico: se trata de una pareja que acude a la consulta por tener tres abortos. El varn tiene tres hijas de una pareja anterior. Ambos presentan un fenotipo normal. Se realiza el cariotipo a la 228 Qumica Clnica 2007; 26 (4) Qumica Clnica 2007; 26 (4) 224-228 REVISIONES DE GENTICA mujer y presenta en todas las metafases estudiadas en sangre perifrica una translocacin robertsoniana entre los cromosomas 13 y 14, siendo los posibles puntos de ruptura (q10;q10) con frmula sexual XX. Se realiza el cariotipo a sus progenitores, siendo el padre portador de la misma translocacin. Resumen: 46,XX,der (13:14)(q10;q10). Portadora de una translocacin rec- proca equilibrada heredada del padre (figura 5). Correspondencia C. Alonso Cerezo Unidad de Gentica. Servicio de Anlisis Clnicos Hospital Universitario de La Princesa c/ Diego de Len, 62 28006 Madrid calonso.hlpr@salud.madrid.org Figura 5. Cariotipo 46,XX, der (13:14)(q10;q10). Traslocacin robertsioniana 13 y 14. BIBLIOGRAFA 1. ISCN: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (Cytogenetic & Genome Research). Ed. Shaffer LG, Tommerup N. 2005. 2. Jorde, Carey, Bamshad & White. Medical Genetics Updated 3 rd edition; 2006. 3. Nussbaum, McInnes & Willard. Thompson & Thompson Genetics in Medicine, revised 6 th edition, 2001. 4. Jacobs PA, Browne C, Gregson N, Joyce C, White H. Estimates of the frecuency of chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of banding. 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