LA EFICACIA DE BACTERIOCINA QUE CONTIENEN SOBRENADANTES DE CULTIVO LIBRES DE

CLULAS A PARTIR DE CIDO LCTICO BACTERIAS PARA CONTROLAR LISTERIA

MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS
Resumen
Demandas de los consumidores han llevado a un creciente inters en el uso de antimicrobianos naturales
para la proteccin de los alimentos.Con el objetivo de desarrollar nuevos productos para mejorar la seguridad
microbiana de los alimentos, hemos probadosobrenadantes libres de clulas de cultivo (CFS) de ocho cepas
bacterianas antagonistas para su eficacia para inhibir la Listeriamonocytogenes en diferentes matrices
alimentarias. Las cepas antagonistas representados diferentes miembros de la ordenLactobacillales as como
un aislamiento de Staphylococcus sciuri y todos mostraron una fuerte inhibicin de L. monocytogenesen
placas de agar. Sobrenadantes libres de clulas se obtuvieron despus de crecer las bacterias en un extracto
de levadura-glucosa caldo.En seis de, a diferencia del sndrome de fatiga crnica de la clase IIa bacteriocinas,
es decir, leucocin A, B leucocin, mundticin L, pediocina PA-1,sakacin A, y X sakacin, fueron identificados como
los principales anti-Listeria compuestos. Para las otras dos cepas, lasustancias activas no se pudo determinar
de manera concluyente. La concentracin eficaz mnima (MEC) delpersona CFS es alcanzar un 2,3 log10 de
L. monocytogenes se determin en caldo de cultivo, todala leche y la carne molida de res a 4 C. Si bien
todos bacteriocina que contiene CFS fueron eficaces en caldo a concentraciones52 a 205 UA / ml,
importantes concentraciones ms altas se necesita cuando se aplican en los alimentos. Los mejores
resultados fueronobtenidos mediante pediocina contiene CFS PA-1, que muestra slo tres y diez veces mayor
del MEC en la leche(307 UA / ml) y groundmeat (1024 UA / g) en comparacin con el caldo, respectivamente.
Un aumento de veinte veces en theMEC(2048 UA / ml) se observ para un mundticin L-contiene fermentado,
y que contiene un SFC Un leucocin y BWASinactivada ms de cincuenta veces (N1280 UA / ml) en las
matrices alimentarias ambos. Sorprendentemente, el sakacin A y X sakacinque contiene se muestran las
tasas de inactivacin de CFS muy selectivos, en la que sakacin Un slo era efectivo en la carne(512 UA / g),
mientras que sakacin X era slo eficaz inmilk (2048 UA / ml). En todos los casos, la inhibicin de L.
monocytogenesfue slo bacterias transitorias y sobrevivir o resistente comenz a crecer despus de un
almacenamiento prolongado. Estos resultadosdestacar la importancia de las pruebas de cuidado de la eficacia
de las bacteriocinas en los sistemas alimentarios para los queestn destinadas a aplicarse contra el destino
seleccionado y las bacterias no objetivo. Adems, el resultado desobreviviente o resistentes a los puntos de
las poblaciones bacterianas que las bacteriocinas probados no son adecuados para asegurar la
plenainhibicin de Listeria monocytogenes en un producto alimenticio, si no se aplica en combinacin con
conservante adicional medidas.
1. INTRODUCCIN
Listeria monocytogenes se ha convertido en una de las ms significativas patgenos transmitidos por
los alimentos que representan aproximadamente 2500 casos de infeccin humana y ms de 500
muertes por ao en los EE.UU. (CDC, 2010). En la industria alimentaria, el control de este patgeno se
mantiene una desafo debido a la ocurrencia itswidespread y su capacidad para sobrevivir y persisten
incluso en ambientes hostiles. Adems, la capacidad para crecer a bajas temperaturas aumenta el
riesgo de enriquecimiento selectivo de el patgeno durante el almacenamiento (Freitag et al, 2009;.
Gandhi y Chikindas, 2007; Lianou y Sofos, 2007). Una forma de controlar la contaminacin de Listeria
en los alimentos puede ser la utilizacin de bacteriocinas producidas por los alimentos de grado
bacterias de cido lctico (LAB). LAB de las bacteriocinas, son ribosomas sintetizan, pequeo,
secretada, pptidos catinicos, que matan a las clulas diana por la permeabilizante membrana
citoplasmtica (Cotter et al, 2005;. Vuyst y Leroy, 2007; Glvez et al, 2007, 2010;. Gillor et al, 2008)..
Ms de 100 pptido bacteriocinas producidas por LAB se han descrito, que difieren en estructura,
propiedades bioqumicas, y el espectro de cepas diana afectada (Hammami et al., 2010).

Principalmente, existen dos formas de aplicacin de bacteriocinas a alimentos: ya sea directamente
como un compuesto purificado o un crudo bacteriana fermentado, o indirectamente a travs del
organismo productor de bacteriocina. Ambas formas tienen ventajas y desventajas que dependen
fundamentalmente en el alimento en particular y la funcin prevista de la bacteriocina. La produccin in
situ de una bacteriocina por bacterias vivas dentro de un alimento matriz es apremiante especialmente
en procesos que implican fermentaciones, tales como la produccin de salchichas fermentadas,
verduras, masa madre, o los productos lcteos. Sin embargo, el xito de dicha solicitud requiere una
cepa productora que es capaz de sobrevivir en el entorno particular, que no tiene un impacto negativo
sobreel sabor del producto o la calidad, y que produce el respectivo antimicrobianosustancias en
cantidades suficientes para inhibir el organismo objetivo(Glvez et al, 2008;. Settanni y Corsetti,
2008).En los productos alimenticios, donde la adicin de bacterias vivas seraperjudiciales, libres de
clulas preparados de bacteriocinas como la nisina Nisaplin (A)o ALTA 2341 (pediocina PA-1) puede
ser utilizado. Hasta la fecha, la nisina A es elbacteriocina nico que ha sido aprobado para uso
comercial en muchospases. Es activo contra un amplio espectro de bacterias Gram-positivasy tiene
una amplia gama de aplicaciones, sin embargo, debido a su bioqumicapropiedades, que es el ms
adecuado para su uso en alimentos cidos como el queso procesado,sopas o verduras (Delves-
Broughton, 2005). Un inconveniente delaplicacin directa de bacteriocinas a una matriz del alimento es
que la prdida de actividadse produce con el tiempo debido a la degradacin enzimtica y las
interaccionescon los componentes de los alimentos como las protenas y los lpidos (Aasen et al,
2003.;Gnzle et al, 1999;. Jung et al, 1992;. Stergiou et al, 2006)..Adems de bacteriocinas, las
bacterias de cido lctico son capaces de producir una granvariedad de sustancias antimicrobianas.
Ejemplos son el perxido de hidrgeno,cidos orgnicos, compuestos biotensioactivos, o compuestos
de bajo peso molecular comoreuterina (Gudia et al, 2010;. Hammes y Hertel, 2009; Vollenweidery
Lacroix, 2004). Aplicando un fermentado bacteriana en lugar de crudouna preparacin purificada
bacteriocina as podra tener la ventaja dela incorporacin de diferentes sustancias biolgicamente
activas con posibleefectos sinrgicos en un solo producto. Esto podra lograrse mediante la
fermentacinadecuados por parte de los productos agrcolas seleccionados de calidad alimentaria
bacterianalas culturas y la preservacin de los metabolitos antimicrobianos de secado por
aspersin(Weber et al., 2008). El objetivo de este trabajo fue evaluar laidoneidad de las diferentes
cepas bacterianas antagonistas para este fin ypara probar la eficacia de los sobrenadantes de cultivo
libres de clulas respectivas ainhibir el crecimiento de L. monocytogenes en diferentes matrices
alimentarias.
2. Materiales y mtodos
2,1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se
muestran en la Tabla 1. la cepas antagnicas han sido previamente identificados en un examen
programa para las bacterias que producen sustancias anti-Listeria (sin publicar). En esta prueba, las
bacterias del cido lctico (LAB) y coagulasa estafilococos (SNC) fueron aisladas de diferentes
muestras de animal, lcteos y del medio ambiente de fuentes y, posteriormente, la prueba del la
produccin de anti-Listeria sustancias en un antagonismo diferido ensayo en placas de agar. El medio
de crecimiento y los productos qumicos fueron obtenidos de Merck (Darmstadt, Alemania), Oxoid
(Basingstoke, Reino Unido), y Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Cepas de BAL fueron cultivadas a 30
C bajo 5% de la atmsfera de CO2 en la SRA o caldo M17G (M17 contiene un 1% glucosa) a menos
que se indique lo contrario. LAB no cepas fueron cultivadas en infusin de cerebro corazn (BHI). Los
medios slidos contena 1% de agar (Oxoid). A extracto de levadura-glucosa caldo (YGB), compuesto
de extracto de levadura 3% (Ohly, Hamburgo, Alemania) y 1% de glucosa, pH 6,5 fue utilizado para
estudios de fermentacin. Las poblaciones de glicerol se mantiene a -80 C.
2,2.
Cuele caracterizacin y determinacin de los espectros de inhibitoria Las cepas se ensayaron
antagonistas de la presencia de ltica bacterifago infectando L. monocytogenes como se describe por
Lewus et al. (1991). La produccin de perxido de hidrgeno se evalu en un ensayo de placa
utilizando TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina) como se describe por Eschenbach et al. (1989). Perfiles
de fermentacin de carbohidratos se obtuvieron utilizando API50 CH tiras (bioMrieux, Marcy l'Etoile,
Francia), de acuerdo con la las instrucciones del fabricante. Adems, se utiliz el VP1 y VP2 reactivos
de bioMrieux (Ref. 70422) para la deteccin de acetona. primario productos de la fermentacin
fueron cuantificados a partir de sobrenadantes de papelera cultivos en fase crecido en YGB. Las
cantidades de D / cido L-lctico eran determina enzimticamente usando un kit de la prueba
correspondiente (R-Biopharm, Darmstadt, Alemania). El cido actico y ethanolwere cuantificado por
las llamas

cromatografa de ionizacin del gas esencialmente como se ha descrito antes (Shihui et al., 2009). La
concentracin de histaminewas determin por GC / MS anlisis sobre una traza de gas GC Ultra cromatgrafo
acoplado a un CET Quantum serie espectrmetro de masas (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.)
despus de la derivatizacin con cloroformiato de isobutilo como se describe en Fernandes y col. (2001). Los
espectros de inhibitoria de las cepas antagonistas se determinaron utilizando un ensayo modificado el
antagonismo diferido (Schillinger y Lucke, 1989). En pocas palabras, cultivos de una noche de las cepas puras
fueron vistos en Placas de agar TSY (3% de peptona de soja; 0,5% de extracto de levadura, 1% de agar, pH
7,0) y se incub anaerbicamente durante 6 horas a 30 C. cepa de Lactobacillus plantarum DSM1055 sirvi
como un control negativo para dar cuenta de la inhibicin debido a la produccin de cidos orgnicos. A
continuacin, las placas fueron superpuesta con 5 ml de agar blando (BHI, MRS, o M17G que contiene 0,5%
de agar), sembr con 2 x 106CFU/ml de una de las cepas enumeradas en el indicador Tabla 1, y se incubaron
en condiciones ms apropiado para el bacterias indicadoras respectivas. La presencia de una zona de
inhibicin claro alrededor de una colonia indicada represin de la cepa indicador debido a la produccin de
una sustancia antimicrobiana difusible.
2,3. Cuantificacin relativa y la categorizacin de los anti-Listeria sustancias Para analizar los niveles de
expresin de las sustancias anti-Listeria en lquido medios, 50 ml de MRS o YGB se inocul con 0,25 ml de
una estacionaria fase de cultivo y se incuban aerbicamente sin agitacin durante 20, 30, o 40 horas a 37, 30,
o 21 C, respectivamente. La densidad ptica (OD 600) de la culturas se determin utilizando un
espectrofotmetro Genesys 10UV (Thermo Scientific) en un rango de absorbancia de 0,1 a 0,8. Libre de
clulas sobrenadantes (CFS) se obtuvieron por centrifugacin de la bacteriana cultivos (15 min 4000 xg), el
ajuste del pH a 6,5 (NaOH) y posteriores filtro de esterilizacin (0,45 tamao mpore). La actividad anti-
listeriana de el de SFC se cuantific mediante dilucin crtico en un ensayo de difusin bien con L.
monocytogenes DSM20600 como organismo indicador (Schillinger y Lucke, 1989): Dos diluciones de la
CFS'swere preparado en el 0,02% Tween 80 (Merck), y 20 l de cada dilucin se dispensa en el pocillos (5
mm de dimetro) de las placas de agar inoculadas BHI. Una arbitraria unidad (UA) se define como el
recproco de la dilucin ms alta a la que la inhibicin del crecimiento fue an detectable. Para caracterizar la
naturaleza de la sustancias antimicrobianas, cada SFC se trat con el siguiente enzimas: catalasa (Sigma), A-
quimotripsina (Applichem, Darmstadt, Alemania), pankreatin (Merck), pronasa (Merck), y proteinasa K (New
England Biolabs), durante 2 horas a 37 C a una concentracin final de 1 mg / ml. La sensibilidad trmica de
los compuestos fue probado por ebullicin el Sndrome de fatiga crnica durante 20 minutos a 100 C.
Despus de estos tratamientos, el residuo antilisterial actividad de la del SFC se cuantific como se ha
descrito anteriormente.
2,4. Purificacin y espectrometra de masas- Bacteriocina sustancias inhibitorias fueron purificados a partir de
800 ml cultivos cultivados en condiciones ptimas para su produccin. todo etapas de purificacin se
realizaron a temperatura ambiente. cuando necesario, el pH del cultivo se ajust a 4,5 utilizando cido actico,
y las clulas se eliminaron por centrifugacin (15 min 4000 xg). A continuacin, el sobrenadante se aplic a
una columna PD-10 que contiene 6 ml
de SPSepharose Fast Flow de intercambio catinico residuo (Sigma) equilibrada con tampn A (5 mM de
acetato amnico, pH 4,5). Despus de lavar con 100 ml de tampn A, 30 ml fracciones fueron recolectados a
travs de cada vez mayor Las concentraciones de NaCl (0,075, 0,15, 0,3, 0,6, y 1,0 M) en tampn A. Las
fracciones que contenan actividad de pico se reunieron y se cargan en un slido fase de extraccin del
cartucho (Sep-Pak C18, Waters, Milford, MA, EE.UU.). El cartucho se lav con tampn A y 20 ml de
fracciones de 10 ml Se recogieron usando 20, 40, 60 y 80% de acetonitrilo en tampn A, respectivamente. Las
fracciones activas se secaron y se resuspendieron en 0,1% cido frmico. Las masas moleculares de las
sustancias purificadas fueron determinado por ionizacin electrospray espectrometra de masas (ESI-MS). Las
muestras fueron inyectadas directamente en un cuadrupolo Agilent 6410 Triple espectrmetro de masas
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) para espectrometra de masas. La tensin capilar se fij en
3.000 V, la temperatura de la fuente fue de 100 C, y la tensin de cono fue de 60 V. Los datos fueron
adquiridos durante un intervalo de relaciones masa-carga (m / z) de 500 a 2000. Las masas moleculares se
calcula a partir del grabado m / z valores y en comparacin con las entradas de las protenas conocidas
antimicrobianos en la bases de datos pblicas.
2,5. Las pruebas de provocacin Para evaluar la eficacia de los distintos de SFC en la reduccin de clulas
viables recuentos de L. monocytogenes en alimentos, la leche entera (3,8% de grasa), y el suelo carne de
vacuno comprada en un supermercado local. La del SFC se prepararon como se describe en la Seccin 2.3.
haciendo crecer las bacterias en YGB en condiciones ptimo para la produccin de las sustancias
antagnicas (Tabla 4). Un fivestrain mezcla de L. monocytogenes wasmade por el crecimiento de la persona
cepas (Tabla 1) en BHI a temperatura ambiente a la tarde exponencial fase y diluirlas en cantidades iguales
en 1.4 la fuerza del timbre solucin (Oxoid) para dar un recuento celular final de 1 x 106CFU/ml. 10-ml
alcuotas de BHI y la leche se prepararon en tubos de plstico estriles y la carne molida se dividi en
porciones de 50 g en bolsas Stomacher. El sampleswere inoculado a un nivel de 2 x 103CFU/ml (andmilk BHI)
o 2 x 104CFU / g (carne) con la mezcla de Listeria y se incubaron durante 6 horas a 4 C. Despus de este
perodo de adaptacin, el SFC es antagnica de la persona cepas se aadieron a las muestras en las
siguientes concentraciones: 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, y 10,0%,
respectivamente. Sobrenadante libre de clulas de la cepa no bacteriocinogenic Lb. plantarum DSM1055
sirvi como control negativo. Las muestras fueron mezclan o se homogeneiz y se almacenan durante un
perodo de seis das a 4 C ( 1 C). Unidades formadoras de colonias de L. monocytogenes se
determinaron todos los das en agar Brilliance, Listeria (Oxoid). Para las muestras BHI y leche, esto se logr
mediante siembra de 0,1 ml de la sonda directamente sobre el placa de agar selectivo, mientras que las
muestras de carne molida de res fueron los primeros homogeneiz en 9 volmenes de tampn (peptonewater
instrumentos IUL, Knigswinter, Alemania) de acuerdo con el procedimiento de la norma ISO 11290-2. la
concentracin eficaz mnima (MEC) se defini como la mnima concentracin de SFC que result en una
reduccin de la L. monocytogenes por debajo del lmite de deteccin (10 UFC / ml para BHI y leche; 100 UFC
/ g para de carne molida) dentro de tres das a 4 C y se determin en tres pruebas de desafo, eachwith
preparaciones independientes de los fermentates.
3. RESULTADOS
3,1. Cuele caracterizacin y determinacin de los espectros de inhibitoria En un programa de cribado anterior,
960 aislamientos de campo de cido lctico bacterias y 94 cepas de estafilococos coagulasa-negativos han
sido probado para la produccin de sustancias antagnicas en placas de agar. fuera de 188 aislamientos
positivos (184 LAB adems del SNC 4), se seleccionaron ocho cepas que mostr una fuerte inhibicin de L.
monocytogenes para su posterior anlisis (Tabla 1). Lticas bacterifagos que infectan a L. monocytogenes no
podra ser identificado en ninguna de las cepas, mientras que la produccin de hidrgeno perxido se observ
en Lactobacillus IDE0444 curvatus. Cuando se cultiva en extracto de levadura-glucosa caldo, la mayora de
las cepas mostr una homofermentativo metabolismo, con cido lctico como el producto de fermentacin
principal, concentraciones que llegan de 28 a 107 mm (Tabla 2). Leuconostoc carnosum fermentado glucosa a
cido D-lctico y etanol. acetona se detect en las culturas de la CE. sp. IDE886 y dbilmente en cultivos de
Lb. plantarum IDE0105. Ninguna de las cepas producidas detectable cantidades (N1 mg / l) de la histamina.
La Tabla 3 muestra la capacidad de las cepas para inhibir patgenos seleccionados, los organismos de
descomposicin, o especies de la microbiota natural de los alimentos. nosotros pudo confirmar un fuerte
efecto inhibidor de todas las cepas antagnicas hacia la L. monocytogenes, que no se limita a la cepa tipo,
pero se observ tambin en dos aislamientos de alimentos de L. monocytogenes y, Curiosamente, tambin en
Enterococcus faecalis (fig. 1). Aparte de eso, el


A La produccin de perxido de hidrgeno fue ensayada en placas de agar; -, no se detecta; +,
detectada; nd, no determinado.
B productos de fermentacin aerbica en el crecimiento despus de extracto de levadura-glucosa
caldo (YGB). Produccin de acetona se evalu mediante la prueba de Voges-Proskauer, -, no hay
reaccin; (+), dbil reaccin; +, fuerte reaccin.

A una actividad antimicrobiana despus del crecimiento en placas de agar TSY. Colar Lb. plantarum
DSM1055 sirvi como un control negativo.
b Bc, Bacillus cereus DSM31; Bt, Brochothrix thermosphacta DSM20171; Eb.c., Enterobacter cloacae
DSM30054; Ec.f., Enterococcus faecalis DSM2570; Lb.p., Lactobacillus plantarum
DSM1055; Lc.l., Lactococcus lactis DSM20481; Ln.c., Leuconostoc carnosum DSM5576; Lm DSM, Listeria
monocytogenes DSM20600; L.m. 15, Listeria monocytogenes; IDE0015 L.m. 48,
Listeria monocytogenes; IDE0048 Sal, Salmonella enterica DSM4224; St.a., Staphylococcus aureus
DSM1104; Smbolos: -, sin inhibicin detectable; (+), zona de inhibicin pequea.
(mm b2); +, una zona de inhibicin de 2 a 6 mm; + +, inhibicin zona N6 mm.
Deshacer cambios
cepas examinadas mostraron una actividad limitada spectrumof hacia otros LAB y agentes patgenos.
Excepcional en este sentido son las cepas Lactococcus lactis IDE0290 y San sciuri IDE0983, que mostr una
inhibicin de la mayora de las bacterias Gram-positivos probados. Adems, IDE0290 consistentemente
mostr la represin dbil de la Enterobacter bacterias Gram-negativas cloacae y Salmonella enterica en
placas de agar (Cuadro 3, Fig. 1).
3,2. Expresin anlisis y caracterizacin de la antagnica sustancias Un extracto de levadura-glucosa caldo
(YGB) apoy un crecimiento aceptable de todas las cepas. En la mayora de los casos, la produccin de las
sustancias antimicrobianas estaba relacionado con la tasa de crecimiento de las clulas, pero para IDE0444 y
IDE0290, la actividad anti-listeriana de la de CSA podra ser aumentada mediante el uso de un bajar la
temperatura de incubacin (Tabla 4). Las mayores actividades eran grabado en el SFC de cepas de Lb.
curvatus IDE0444, Ec. sp. IDE0886, y Lb. plantarum IDE0105, mientras que San sciuri IDE0983 producido
slo bajo concentraciones efectivas de los antimicrobiano (s), lo que contradice la fuerte actividad inhibidora
de las clulas cuando se cultivan en medios slidos. Los resultados obtenidos hasta el momento sugiere que
las bacteriocinas pueden participar en la actividad antagnica de las bacterias. Para clasificar el principales
compuestos antimicrobianos, hemos probado la sensibilidad de la del sndrome de fatiga crnica hacia la
catalasa, la proteasa y los tratamientos trmicos. Aparte de Lc. lactis IDE0290 y San sciuri IDE0983, los
activitywas contra Listeria completo

Fig. 1. Inhibicin espectros de las cepas bacterianas antagonistas. Los cultivos se hicieron crecer en placas de
agar TSY y superpuesta con un agar blando, se inocul con L. monocytogenes DSM20600 (A), L.
monocytogenes IDE0015 (B), E. faecalis DSM2570 (C), y S. enterica DSM4224 (D). La presencia de una zona
de inhibicin claro despus de la incubacin indica represin del indicador deformacin debida a la produccin
de una sustancia antimicrobiana difusible. De izquierda a derecha: Fila superior: Lb. plantarum DSM1055
(control), Ec. sp. IDE0886, Lb. curvatus IDE0444; Fila del medio: Lb. plantarum IDE0105, Lb. sakei IDE0216,
Lc. lactis IDE0290; Fila inferior: Ln. carnosum IDE1105, Pc. acidilactici IDE0550, San sciuri IDE0983.

abolida despus del tratamiento de la proteasa, mientras que hervir durante 20 minutos como resultado
slo en la prdida de actividad amoderate (Tabla 5). Por lo tanto, podramos confirmthat
estables frente al calor compuestos protenicos, muy probablemente la clase II, las bacteriocinas
son responsables de la actividad anti-listeriana de stos de SFC.
A la inversa, la de SFC de IDE0290 y IDE0983 demostrado ser resistentes
a la proteasa, pero sensibles a los tratamientos trmicos. El perxido de hidrgeno,
aunque se hayan producido por IDE0444, era en ningn caso responsable de
para el principal anti-Listeria actividad, ya que la catalasa tratada con CFS
retenido plena actividad (Tabla 5).
Deshacer cambios
3,3. Identificacin de los compuestos antagonistas Para la identificacin de las sustancias antagnicas, hemos
seguido una enfoque bioqumico de purificacin y espectrometra de masas. la sustancias inhibidoras se
purificaron a partir de la SFC por intercambio catinico y cromatografa de interaccin hidrofbica-y las
fracciones que contienen pico de actividad fueron analizados por espectrometra de masas. De esta manera,
se podra purificar al menos una protena de cada uno de los seis sensible a proteasas sobrenadantes, todas
las masas moleculares exhiben correspondientes a ya se ha descrito bacteriocinas clase IIa (draa et al,
2006;. Cuadro 6). Cromatografa de intercambio catinico no fue efectivo para el enriquecimiento de las
sustancias antagonistas de Lc. lactis IDE0290 y San sciuri IDE0983, lo que indica una falta de residuos
cargados positivamente en estos molculas. No obstante, mediante la aplicacin de cromatografa de
interaccin hidrofbica, podemos identificar un compuesto de 3329 Da en el sndrome de fatiga crnica de la
IDE0290 (Tabla 6). Themass de thismolecule hizo notmatch cualquier protena se describe en la base de
datos UniProt-(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/) o en BACTIBASE (http://bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php). De
manera similar, podramos aislar un compuesto de bajo peso molecular a partir de la SFC de IDE0983, pero,
debido a las impurezas, que todava no eran capaces de determinar el masa exacta de esta molcula.

A Colar Lb. plantarum DSM1055 sirvi como un control negativo. B anti-listeriana actividad de los
sobrenadantes libres de clulas despus enzimtica y el calor tratamientos. UA, unidades arbitrarias
3,4. Al comparar la eficacia de crudo fermentates bacterianos para inhibirL. monocytogenes en los
alimentosPara seleccionar el CFSmost bacteriano adecuado para su uso en productos alimenticios, queen
comparacin de su eficacia para inhibir L. monocytogenes en caldo de cultivo,leche entera y carne molida de
res. La Tabla 7 muestra el correspondiente mnimoconcentraciones efectivas de la SFC, de que se han
determinado en unserie de pruebas de provocacin. Debido a que cada uno tena SFC especfica
diferenteactividad (Tabla 5), el de MEC tambin se calculan como UA / ml para facilitarcomparaciones de la
eficacia de los respectivos anti-Listeria sustancias.En este ensayo, el sndrome de fatiga crnica es una de las
cepas de amplio espectro antagnicasLc. lactis IDE0290 y San sciuri IDE0983 no fueron efectivos, sin tener
en cuentade la concentracin (hasta 10%) y el medio de desafo. Por lo menospara IDE0983, esto puede ser
explicado por la baja actividad especfica delcorrespondiente sndrome de fatiga crnica (400 UA / ml). Por
otro lado, la mnimaconcentraciones eficaces (MEC) de las bacteriocinas que contienen fermentatesestaban
en el intervalo de 0,2 a 0,4% en BHI. Teniendo en cuenta elactividades especficas de la respectiva SFC, 52 a
205 UA / ml fueronnecesaria para la inhibicin de L. monocytogenes en BHI. Como se esperaba, elMEC de
los fermentates fueron mayores cuando se aplica en la leche ycarne molida de res. Sin embargo, hemos
encontrado que la eficacia de los distintosfermentates vari considerablemente entre el desafo
diferentematrices: La pediocina contiene fermentates de Lb. plantarum yPediococcus acidilactici muestra de
tres y diez veces mayor del MEC en elleche y carne picada en comparacin con BHI, respectivamente. A
veinte veces aumento en el MEC se observ para el mundticin L que contiene fermentado, y el A y B que
contiene leucocin CFS de Ln. Carnosum se inactiva ms de cincuenta veces en las dos matrices de alimentos.
Cabe destacar que,la X sakacin y sakacin A fermentates contienen mostr muyfuncionalidad selectiva, en la
que X era slo sakacin eficaz en la leche,mientras que sakacin Un slo era efectivo en la carne (Tabla 7).
Aunque todos los fermentates ensayados muestran un bactericida principalmentemodo de accin, hemos
observado que la inhibicin de L. monocytogenesera por lo general slo transitorio y que las bacterias
supervivientes o bacteriocin resistant mutant cepas comenzaron a crecer despus de una incubacin
prolongada (datos no se muestra).
4. Discusin
El xito de la aplicacin de fermentates bacterianas en los sistemas alimentarios complejos para eliminar o
inhibir el crecimiento de bacterias patgenas o de descomposicin depende de varios factores. A diferencia de
la situacin en placas de agar, compuestos antagonistas pueden ser inactivados por enzimas procedentes del
producto o la microflora endgena o por las interacciones con los componentes de los alimentos especficos.
Tambin es concebible que algunos compuestos de la fermentado puede incluso proteger las bacterias del
estrs u otros efectos adversos encontrados en la matriz del alimento, o que los factores de crecimiento
especficos pueden estimular la proliferacin de microbios indeseables. Adems, los productos metablicos
como perxidos o cido actico que se incorporan en el fermentado puede tener un impacto indeseable sobre
la calidad del producto. Por lo tanto, es vital para llevar a cabo una exhaustiva verificacin de la idoneidad de
un fermentado dada para una aplicacin especfica. En el presente estudio, hemos investigado sndrome de
fatiga crnica, producida por ocho cepas bacterianas antagnicas, por su eficacia para inhibir L.
monocytogenes en diferentes matrices alimentarias.
Basado en los metabolitos analizados, todas las cepas de antagonistas bsicamente sera adecuado para la
produccin de un fermentado bacteriana, aunque la aplicabilidad de cada fermentado como un aditivo
alimentario debe ser probado en una base individual. La formacin de perxido de hidrgeno puede ser
evitado mediante el uso de condiciones anaerbicas de cultivo, mientras que los metabolitos voltiles como el
etanol se elimina del SFC durante el proceso de secado por pulverizacin. Adems, la composicin de la
fermentado puede ser influenciada por la seleccin de substratos especficos y condiciones de crecimiento en
una fermentacin controlada (Pastink et al., 2009).
En placas de agar, todas las cepas mostraron una buena inhibicin de varias cepas de L. monocytogenes, lo
cual era un requisito previo para nuestra aplicacin. Adems, las cepas de Lc. lactis IDE0290 y San sciuri
IDE0983 tambin fueron activas contra una amplia gama de otras bacterias Gram-positivas, calificando estas
cepas para otros fines, as, como, por ejemplo, la vida til de extensin.
Una de las limitaciones, cuando se utiliza naturales aislados bacterianos para la produccin de metabolitos
antagonistas, es la expresin con frecuencia limitada de las sustancias activas en cultivo lquido. Por varias
bacteriocinas, se ha demostrado que la biosntesis est regulada por parmetros externos como nutrientes,
temperatura, pH, o niveles de aireacin ([Biswas et al., 1991], [Cintas et al., 1997], [Diep et al. 2000] y
[Papagianni y Anastasiadou, 2009]). Mediante el uso de una levadura simple extracto-glucosa caldo y las
temperaturas adecuadas de crecimiento, se obtuvieron muy eficaz CFS (> 50.000 UA / ml) a partir de cepas,
la IDE0105 IDE0444 y IDE0886. Los sobrenadantes de los cultivos restantes exhibieron niveles intermedios
de actividad (6400 a 25.600 UA / ml), mientras que IDE0983 mostr bajo nivel de expresin (400 UA / ml) del
antimicrobiano (s) en cultivo lquido. Debido a que no sistemticamente probar los requisitos particulares de
cada cepa para la produccin ptima, es probable que las actividades especficas de la del SFC puede
incrementarse an ms.
Debido a la seleccin de cepas para la fuerte inhibicin de L. monocytogenes, que no es de extraar que
todas las sustancias antimicrobianas identificados pertenecan a la clase IIa bacteriocinas, que se sabe que
tienen una fuerte actividad anti-Listeria ([Eijsink et al., 1998 ], [Guyonnet et al., 2000] y [Katla et al., 2003]). A
pesar de que generalmente se observan buena concordancia de lo observado y las masas denunciados, no
podemos excluir cualquier diferencia en el pptido lder o estructura primaria de las bacteriocinas, que se han
reportado ocasionalmente ([draa et al., 2006], [Flix et al. 1994] y [Feng et al., 2009]). El aislamiento y
secuenciacin de los genes correspondientes que se requiere para confirmar la identidad de las bacteriocinas
identificados. No podemos tambin descartar la presencia de bacteriocinas adicionales u otras sustancias
antagonistas dentro de la del SFC, que podran haber escapado de deteccin o que podran haber sido
inactivado durante el procedimiento de purificacin. Una vez ms, esta cuestin podra abordarse mediante el
aislamiento de cepas mutantes con un gen alterado bacteriocina estructural.
La identidad de los compuestos antagonistas secretadas por LC. lactis IDE0290 y San sciuri IDE0983 an no
se pudo resolver de manera concluyente. Los intentos de determinar la secuencia de aminocidos de la
molcula de 3329 Da en el CFS de IDE0290 por degradacin de Edman o novo-secuenciacin fallado, debido
a la obstruccin N-terminal y que interfieren puentes intermoleculares, respectivamente (datos no
presentados). En general, debido al tamao caracterstico de las propiedades bioqumicas, y la actividad
antibacteriana, consideramos que esta sustancia como hasta el momento no caracterizado lantibitico (Willey
y van der Donk, 2007). El anlisis preliminar de la sustancia antimicrobiana producida por IDE0983 est
apuntando a un no-proteico, compuesto de bajo peso molecular. Ms investigaciones son necesarias para
determinar la naturaleza de estos interesantes, antimicrobianos de amplio espectro.

Es una larga observacin hizo que la eficacia de las bacteriocinas es a menudo mucho ms baja en los
sistemas alimentarios en comparacin con medios de cultivo ([Gnzle et al., 1999] y [Schillinger et al., 1996]).
Este efecto se puede atribuir a varios factores como la adsorcin de la bacteriocina a los componentes de los
alimentos, por inactivacin qumica o modificaciones enzimticas, mala solubilidad, o la distribucin desigual
en la matriz del alimento dado (Glvez et al., 2007). Debido a que cada bacteriocina exhibe propiedades
bioqumicas individuales, el nivel de inactivacin difiere en un sistema de alimentacin dado. Por ejemplo,
Aasen et al. (2003) informaron que la actividad nisina se ve menos afectado por los aceites de triglicridos en
salmn ahumado en fro en comparacin con sakacin P. Por otro lado, un lacticina 3147 enriquecido en polvo
demostr ser superior sobre la nisina en la reduccin de los niveles de L. monocytogenes en un nmero de
alimentos sistemas a pH neutro (Morgan et al., 2001). En consecuencia, diferentes grados de inactivacin
fueron observados tambin por los fermentates bacteriocina contienen investigados en este estudio. Los
pediocina y sakacin X que contienen fermentates muestra fuerte inactivacin en la carne en comparacin con
la leche, que puede atribuirse a la degradacin de los pptidos por proteasas de carne ([Degnan et al., 1993] y
[Murray y Richard, 1997]). En el reverso se observ para el sakacin Una contiene fermentado, que se inactiv
en gran medida en el entorno de la leche. Curiosamente, la mitad C-terminal de la sakacin Un pptido (que es
idntico al curvacin A) forma una hlice distinta-bisagra-hlice estructura, que distingue a este pptido de otra
clase IIa bacteriocinas (Haugen et al., 2008). Debido a que la parte C-terminal de la clase IIa bacteriocinas
define el espectro antimicrobiano y es reconocido por las protenas de la inmunidad afines (Johnsen et al.,
2005), se podra especular que el sakacin A molculas son capturados por las protenas especficas de la
leche. Alternativamente, las clulas de L. monocytogenes podra ser mejor protegida de la actividad perjudicial
de la bacteriocina, o mostrar una mayor resistencia debido a la alteracin de las actividades metablicas o la
composicin de la membrana en el entorno de la leche. Tiene que hacerse hincapi, sin embargo, que hemos
utilizado crudo fermentates bacterianas en las pruebas de provocacin en lugar de preparaciones purificadas
bacteriocina, y que las actividades especficas por lo tanto se aplican a los fermentates enteros en lugar de las
bacteriocinas identificados.
En conclusin, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de las pruebas de cuidado de la eficacia
de las bacteriocinas en los sistemas alimentarios para los que estn destinados a ser aplicada contra el
objetivo seleccionado y las bacterias no objetivo. Adems, la consecuencia de sobrevivir o bacterias
resistentes a bacteriocina despus de puntos de incubacin prolongados seala que las bacteriocinas no debe
ser el principio conservante utilizado en un producto alimenticio, sino que debe ser parte de un sistema con los
principios de conservacin mltiples, los llamados "obstculos ".