Cromatografa de exclusin molecular

(filtracin en gel)

K
av
=
V
e
- V
o
V
t
-V
o
K
av
log MW
1 2 3
HDC
Figura 2P. Etapas de purificacin de
HDC recombinante.
1: Phenyl-Sepharose; 2: Macro-prep
DEAE; 3: Hidroxiapatito.
Purificacin de la HDC de rata recombinante
Etapa
Extracto crudo
Precip. + Phenyl-seph.
DEAE-sephadex
Hidrixiapa. + filtr.
Acti vi dad
(g CO
2
/ h)
4,6
1,7
0,87
0,31
Prot. total
(mg)
1488
243,2
3,45
0,55
Acti vi dad
espec f i ca
(pmol CO
2
/hg pr)
3,11
7,16
254
577,8
Puri fi caci n
(veces)
1
2,3
81
185
Rendi mi ento
(%)
100
36,7
18,9
6,7
1. K
2. SR
3. DR
4. FER
5. NLTK
6. NVACK
7. ATGSSK
8. TTQANK
9. ETAAAK
10. YPNCAYK
11. NGQTNCYQSYSTMSITDCR
12. HIIVACEGNPYVPVHFDASV
13. QHMDSSTSAASSSNYCNEMMK
14. CKPVNTFVHESLADVQAVCSQK
Digestin con tripsina
(14 fragmentos)
1. M
2. KETAAAKFERQHM
3. DSSTSASSSNYCNEM
4. SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIV
ACEGNPYVPVHFADASV
5. KSRNLTKDRCKPVNTFVLIESLADVQAVC
SQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
Digestin con CNBr
(5 fragmentos)
Secuenciacin de la ribonucleasa A
........10........20........30........40
Tripina ..........QHMDSSTSAASSSNYCNEMMK.........
CNBr KETAAAKFERQHM.................KSRNLTKDRC
KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYCNEMMKSRNLTKDRC
........50........60........70........80
Tripina ...........................NGQTNCYQSYSTM
CNBr KPVNTFVLIESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
KPVNTFVLIESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSYSTM
........90.......100.......110.......120
Tripina SITDCR...................HIIVACEGNPYVPVH
CNBr SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVH
SITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVH
..125
Tripina FDASV
CNBr FDASV
FDASV
6, 11, 13 y 10, 12, 14
Dependencia de la solubilidad del pH
I
n
f
l
u
e
n
c
i
a

d
e

l
o
s

p
e
q
u
e

o
s

i
o
n
e
s

s
o
b
r
e

l
a
s

i
n
t
e
r
a
c
c
i
o
n
e
s

e
n
t
r
e

l
o
s

m
a
c
r
o
i
o
n
e
s
Especificidades de varias endopeptidasas
NH
R
n-1
CH C
O
NH
R
n
CH C
O
punto de corte
es bastante inespecfica,
pH ptimo = 2
ocasionalmente rompe cuando R
n

= A, D, H, T; es termoestable
R
n-1
= E
R
n
= L, F, W o Y; R
n-1
P
R
n
= I, M, F, W, Y, V;
R
n-1
P
R
n-1
= A, G, S o V; R
n
P
rompe ms lentamente para
R
n-1
= N, H, M o L
R
n-1
= F, W o Y; R
n
P
S. aureus
B. thermoproteolyticus
mucosa gastrica bovina
Pancreas bovino
Pancreas bovino
Pancreas bovino
Altamente especfico
R
n-1
= R o K; R
n
P
Endopeptidasa V8
Pepsina
Termolisina
Elastasa
quimiotripsina
Tripsina
Comentario especificidad fuente Enzima
Degradacin de Edman
H
2
N
R
1
CH C
O
NH
R
2
CH C
O
NH
R
3
CH C
O
N C S
NH
R
1
CH C
O
NH
R
2
CH C
O
NH
R
3
CH C
O
N C
S
..
..
+
+
H
3
N
R
2
CH C
O
NH
R
3
CH C
O
+
N
H
S
N
O
R
1
N
H
S
N
O
R
1
Fenilisotiocianato
(PITC)
Polipptido
Feniltiocarbanil-polipptido
(PTC-polipptido)
Feniltiohidantona-aminocido
(PTH-aminocido)
Polipptido sin el extremo N-terminal
Derivado Tiazolina
-OH
-
F
3
CCOOH
anhidro
H
+
-S-S-
-S-S-
-
S
-
S
- -
S
-
S
-
Dominio Fc
Dominio
Fab
Dominio de unin
al antgeno
Antgeno
Bisagra
Zona de corte
con pepsina
Zona de corte
con papaina
Dominio Fc
Dominio Fab
Dominio
de unin
al antgeno
Bisagra
Cadenas pesadas
Cadenas ligeras
Carbohidrato
Inmunodifusin en gel
(Ouchternoly)
!-A
A
B
Los antgenos A y B son
inmunolgicamente identicos
!-A
A
B
Los antgenos A y B estn
estrechamente relacionados
!-A
A
B
Ambos antgenos son reactivos
pero con una relacin lejana
!-A
A
B
A es reactivo, pero B no lo es
Inmunoelectroforesis
+ -
En primer lugar las muestras A y B se somoten a una electroforesis
A
B
El antisuero se coloca en el gel entre las dos muestras y se deja
difundir. Se formaran arcos de precipitacin con las bandas de cada
mezcla que reaccionen con el antisuero
antisuero
blot: !-p75
PC12 N17
p75
NTR
PC12 N17
NGF - + - +
blot: !-PY
ERK1
ERK2
Transferencia Western
Separacin de protenas
en SDS-PAGE
Transferencia a
membrana
Incubacin con anticuerpos
y revelado de la protena
marcadora
PC12 N17
NGF - + - +
IP: 203
blot: !-PY
p140
Trk
p110
Trk
PC12 N17
blot: RTA
p140
Trk
p110
Trk
Inmunoprecipitacin
Incubacin con
el anticuerpo
Incubacin con
Protena A
Precipitacin del complejo
antgeno-anticuerpo-protena A
Anlisis de los
complejos en SDS-
PAGE
Obtencin de anticuerpos monoclonales
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Unin del antgeno
a la fase slida
Unin del anticuerpo
marcado al antgeno
Cuanticacin del
anticuerpo
Unin del anticuerpo
a la fase slida
Unin del antgeno
marcado al anticuerpo
Cuanticacin del
antgeno
Unin del anticuerpo
a la fase slida
Unin del antgeno
al anticuerpo
Cuanticacin del
anticuerpo
secundario
Unin del anticuerpo
secundario marcado
Ensayos de captura de anticuerpos
Ensayos de captura de antgeno
Ensayos con dos anticuerpos
Radioinmunoanlisis
Control Muestra desconacida
cpm control cpm desconocido
cpm control
cpm desconocido
X 100% = % Ag* unido
Cantidad ja de antigeno A
radiactivo
Se aade una cantidad
desconocida de antigeno A
sin marcar
Se aade una cantidad ja
de anticuerpos anti-A
Se aade un agente
precipitante (anticuerpo
anti-inmunoglobulina)
Se determina la
radiactividad en los
precipitados