Mesures Physiques Annecy MPh2 SE3 ME3 2011 Philippe Galez

Techniques spectroscopiques danalyse / Fluorimtrie

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IUT Annecy
Dpartement Mesures Physiques
MPh2 SE3 ME3


Mesures Physiques Annecy MPh2 SE3 ME3 2011 Philippe Galez
Techniques spectroscopiques danalyse / Fluorimtrie
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Certains composs organiques ou minraux, liquides ou solides
mettent de la lumire lorsquils sont excits par des photons
visibles ou du proche UV.

Cest le phnomne de photoluminescence.

Si lmission a lieu immdiatement aprs lexcitation (quelques
nanosecondes), on parle de fluorescence.
La technique danalyse correspondante est la fluorimtrie
dosage et analyse qualitative

Si lmission se produit au bout de quelques secondes, on parle
de phosphorescence.


1- Fluorescence et phosphorescence : origine

Certains composs sont fluorescents, dautres
sont phosphorescents, dautres les deux la fois.

Aprs excitation t = 0, lintensit de photoluminescence une
dcroissance exponentielle :

( ) ( ) ( ) t k I t I
f f
= exp 0 (quation 1)

La dure de vie de luminescence
0
est dfinie par :


k
1
0
= (quation 2)

Au bout du temps
0
, lmission vaut 37% de sa valeur initiale.
63% des espces sont revenus un tat non-missif.

Fluorescence
0
= quelques nanosecondes
Phosphorescence
0
= quelques secondes plusieurs
minutes




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La photoluminescence met en jeu des transitions entre
diffrents niveaux lectroniques.

Fluorescence

Etape dexcitation

La molcule passe de son tat fondamental S
0
, V
0
un
tat excit S
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) sous leffet dun photon
UV / visible.

S
0
, V
0
S
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
)

S
0
= niveau lectronique fondamental
S
1
= niveau lectronique excit
V
0
, V
1
, V
2
= niveaux de vibration

(Passage dun lectron sur une O.M. dnergie suprieure
+ augmentation de lnergie de vibration)

Etape de conversion interne

Perte dnergie vibrationnelle ( = 10
-12
s)

S
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) S
1
, V
0



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Fluorescence

Retour ltat lectronique fondamental avec une nergie
de vibration variable ( = 10
-9
10
-7
s)

S
1
, V
0
S
0
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
)

Retour ltat fondamental

Relaxation vibrationnelle ou mission dun photon de bien
moindre nergie (moyen IR)

S
0
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) S
0
, V
0


Remarques :

Lors du processus dabsorption, le spin de llectron qui
subit la transition ne se retourne pas.

Une partie de lnergie acquise est dissipe sous forme de
vibration les spectres dabsorption et dmission ne
concident pas.


Les molcules non rigides perdent facilement toute
lnergie par relaxation vibrationnelle la fluorescence
est lapanage des molcules cycliques, rigides possdant
des liaisons .


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Phosphorescence

La dsexcitation est plus complexe.

Croisement intersystme

Passage par un tat triplet plus stable par retournement du
spin de llectron si la conversion interne est lente

S
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) T
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
)

Conversion interne

T
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) T
1
, V
0


Phosphorescence

Ncessite un second retournement du spin : 10
8
fois plus
long que la fluorescence.

T
1
, V
0
S
1
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
)

Retour ltat fondamental

S
0
, (V
0
, V
1
, V
2
, V
3
) S
0
, V
0



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2- Intensit de fluorescence

Lintensit de fluorescence dpend de nombreux paramtres :

- la probabilit de transition du niveau fondamental vers un
niveau excit sous leffet du rayonnement ;

- la probabilit de retour au fondamental par un processus
qui inclut une tape de fluorescence ;

- labsorption du rayonnement dexcitation ;

- labsorption du rayonnement de fluorescence par lespce
mettrice en raison du recouvrement partiel des spectres
dmission et dabsorption (quenching couleur) ;

- le transfert dnergie despces excites vers dautres
molcules ou ions (quenching chimique).


On dfinit le rendement de fluorescence :


a
f
f
I
I
absorbs photons de nombre
mis photons de nombre
= =

Donc :

( )

= = =
0
0 0
1
I
I
I I I I I
t
f t f a f f


En supposant que la loi de Beer-Lambert sapplique pour le
rayonnement et lchantillon considrs :

( )
A
f f
I I

= 10 1
0


o A est labsorbance. On peut crire la puissance de 10 de
manire diffrente et effectuer un dveloppement en srie :

( )
( ) ( )
...
! 3
10 ln
! 2
10 ln
10 ln 1 10 ln exp 10
3 2
+ + = =

A A
A A
A



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Si la concentration en espce fluorescente est petite, on peut
limiter le dveloppement en srie au premier ordre :

10 ln 1 10 A
A
=

Dans ce cas, on obtient :

A I I
f f
= 10 ln
0


et en remplaant labsorbance par son expression bien
connue :

= c l I I
f f
10 ln
0
avec

l = trajet optique dans la solution ;
c = concentration massique (molaire) de la substance ;
= coefficient dabsorption massique (molaire) de la substance.

On aboutit au rsultat que lintensit de fluorescence est
proportionnelle la concentration en espce fluorescente :

c I K I
f
=
0


si les hypothses faites plus haut sont valables :
- validit de la loi de Beer-Lambert ;
- valeur petite de labsorbance.
Dans la pratique, lintensit de fluorescence croit de manire
linaire puis sature et enfin diminue lorsque la concentration
augmente.



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Remarque :

Compte tenu des interactions du rayonnement dexcitation
et du rayonnement de fluorescence avec la solution, on
utilise un iris pour ne recueillir que le rayonnement
provenant du centre de la cuve.

Rayonnements parasites

Ces rayonnements peuvent tre gnants quand les longueurs
donde dexcitation et dmission sont voisines.

Diffusion Rayleigh :
Diffusion lastique dune petite partie de lexcitation par le
solvant.

Diffusion Raman :
Transfert dune partie de la lumire excitatrice aux
molcules de solvant.



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3- Instrumentation

Les sources
Les sources sont en gnral des lampes arc au xnon
dune puissance variant de 100 800 watts. Elles mettent
une lumire polychromatique qui couvre la totalit du
spectre dintrt.


Les dtecteurs
On utilise des tubes photomultiplicateurs ou des
photodiodes.



Gomtrie de mesure
Avec liris prcdemment mentionn, on peut dtecter le
rayonnement fluorescent :
o 90du rayonnement dexcitation ;
o 180pour les chantillons opaques ;
o un angle aigu.


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Fluorimtres rapport de fluorescence (longueur donde fixe)

source monochromateur dexcitation chantillon


dtecteur monochromateur dmission

Le monochromateur dexcitation permet de slectionner
une bande troite de longueur donde (15 nm)

Le monochromateur dmission permet par rotation de
choisir une bande troite correspondant au dosage
effectuer.

On mesure alternativement lchantillon et des talons
pour saffranchir des fluctuations de la lampe et des
modifications ventuelles des conditions exprimentales.

Les spectrofluorimtres

Les deux monochromateurs sont motoriss : on peut
choisir les longueurs donde dexcitation et dmission.

On a ainsi accs la matrice dmission-excitation :
reprsentation 3D de lintensit mise en fonction des
longueurs donde dmission et dexcitation.


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Cette matrice est une signature de la substance analyse
analyse qualitative

Elle permet de trouver les longueurs donde optimales
pour un dosage optimisation de lanalyse quantitative.

Ces appareils permettent, par leur flexibilit, dtudier tous
les composs

Fluorescence rsolue dans le temps

Certains appareils permettent de dterminer les
constantes de dcroissance. On utilise pour cela des
sources pulses telles des diodes laser.



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4- Applications

Industrie agroalimentaire : dosages
Protines, amines, aides amins, vitamines, additifs,
rsidus de pesticides, microtoxines

Industrie pharmaceutique, biologie :dosages
Anesthsiques, analgsiques, neuroleptiques,
tranquillisants, diurtiques, sulfamides, antibiotiques

microfluorimtrie : analyse lchelle cellulaire
cytofluorimtrie en flux : tri des cellules

Industrie chimique
Composs aromatiques, aldhydes, ctones, produits
ptroliers, caoutchouc, colorants