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Taenia sp.

Strongyloides stercoralis
Trichuris trichiura
Universidade Jos do Rosrio Vellano

Esfregao de sangue a fresco:
-Esse mtodo o mais fcil e a forma menos cara de mostrar a presena de parasitas em
sangue, porm o menos sensvel.
-Materiais:
Lanceta
Swab de algodo
Lamnula
Lmina
Soluo Salina
lcool
-Mtodo:
1- Escolha o terceiro dedo a partir do polegar. Limpe o dedo com swab de algodo levemente
umedecido em lcool. Seque bem. Fure o dedo com a lanceta.
2- Colete a primeira gota de sangue que aparecer e coloque-a diretamente no meio da lmina.
3- Adicione uma gota igual de soluo salina. Misture o sangue e a soluo salina usando a
ponta da lamnula. Cubra o preparado com a lamnula.
4- Examine o esfregao sistemicamente no microscpio (objetiva de 10X com ajuste de
condensador reduzido). O primeiro sinal de presena de tripanossomas ou microfilrias vivos
o movimento rpido entre as clulas vermelhas.
5- Observe todo o preparo sistematicamente. O tripanossoma refratrio e difcil de ver, por
isso deve-se reduzir a luminosidade.

Pesquisa de hematozotos no sangue perifrico:
A pesquisa por diagnstico da malria pode ser realizada por:
-esfregaos finos (gota estirada ou esfregao em camada delgada) identificao
-esfregao em cama espessa (gota espessa) mais utilizado para diagnstico epidemiolgico
-Nota normalmente utiliza-se duas tcnicas em uma mesma lmina
-Coleta de amostras dever ser feita preferencialmente no pico febril por puno digital ou
coleta venosa.
-Tcnica:

1- com a mo esquerda do paciente, palma para cima, selecione o terceiro dedo (o dedo do
p pode ser utilizado para crianas; o polegar nunca deve ser usado). Use algodo levemente
umedecido com lcool para limpar o dedo, usando movimentos firmes para remover a sujeira
e a gordura da ponta do mesmo.
2- com uma lanceta estril, fure a ponta do dedo rodando a lanceta rapidamente. Aplicando
leve presso sobre o dedo, esprema a primeira gota e limpe-a com algodo seco (certifique-se
de que nenhum fio de algodo permanea no dedo).
3- trabalhando rapidamente e segurando lminas limpas nas bordas, colete o sangue como
segue:
-aplique uma presso leve no dedo e colete uma nica gota de sangue no meio da lamina
(esfregao fino)
-aplique maior presso para espremer mais sangue e colete 2 ou 3 gotas grandes sobre a
lmina.
4- esfregao fino usando uma outra lamina limpa como extensor, e com a lamina com gota
de sangue em superfcie firme, toque a gota de sangue com o extensor e permite que a mesma
corra ao longo da margem. Firmemente empurre o extensor ao longo da lmina, mantendo
um ngulo de 45. Certifique-se de que o extensor est em contato com a lmina todo o
tempo que o sangue estiver sendo espalhado. O esfregao no deve se estender at a margem
da lmina para prevenir a infeco do investigador.
5- esfregao espesso sempre segure a lmina pela margem ou pela quina, para fazer o
esfregao espesso como segue:
-usando a quina do extensor, rapidamente una as gotas de sangue e espalhe para fazer um
bom esfregao espesso. O sangue no pode ser excessivamente mexido, mas pode ser
espalhado com movimentos circulares ou retangulares (3-6 movimentos).
6- deixe o esfregao espesso secar em superfcie plana, posio nivelada, protegida de insetos,
sujeira e batidas fortes.
7- etiquete a lmina com lpis dermatogrfico.

- Esfregaos sanguneos pelo Giemsa:
-para uma boa colorao, os esfregaos finos e espessos devem ser feitos em lminas
separadas em diferentes concentraes e tempo usado para coloraes. Melhores resultados
so obtidos se o esfregao sanguneo secou de um dia para o outro.
Tcnica:
1- Fixe o esfregao fino adicionando 3 gotas de metanol, ou mergulhando em um
recipiente com metanol por poucos segundos. Com fixao prolongada pode ser difcil
demonstrar o grnulo de Schuffner e o grnulo de Maurer. Para permitir a
desemoglobinao, o esfregao espesso no pode ser fixado, portanto, evite a
exposio ao metanol ou ao vapor do mesmo.
2- Coloquem as lminas de costas uma para outra na cuba com o corante.
3- Prepare a soluo Giemsa 3% em gua tamponada, pH 7,2 em quantidade suficiente
para completar o numero de cubas usadas. Agite bem o corante.
4- Despeje o corante com delicadeza na cuba at as laminas estarem totalmente
cobertas.
5- Deixe corando por 30-45 minutos fora da luz solar.
6- Lave com gua limpa.
7- Remova a lmina uma a uma e coloque-as numa estante de laminas para drenar e
secar com o lado do esfregao voltado para baixo, certificando-se de que o esfregao
no toque na estante.

-Mtodo rpido para esfregaos sanguneos finos e espessos na mesma lmina:

1- Deixe o esfregao espesso secar completamente; se resultados urgentes forem
requisitados, a secagem poder ser apressada por ventilao ou por exposio breve
ao calor brando, assim como a lmpada do microscpio.
2- Fixe o esfregao fino pincelando-o com algodo embebido em metanol ou imergindo-o
em um recipiente com metanol por poucos segundos. Para ocorrer a
desemoglobinao, o esfregao espesso no deve ser fixado.
3- Prepare uma soluo Giemsa 10% em gua tamponada, destilada ou deionizada, pH
7,2; se pouca quantidade estiver sendo usada, 3 gotas de corante por mL de gua

tamponada dar a correta concentrao da soluo Giemsa. Uma lmina requer mais
ou menos 3mL de corante feito.
4- Coloque delicadamente o corante na lmina, uma pipeta pode ser usada para isso.
5- Core de 5 a 10 minutos.
6- Lave a lmina com gua limpa, e coloque-a para secar em estante prpria.
- Soluo tamponada pH 7,2:
-Dissolver 3,0g de fosfato hidrogenado dissdico anidro (Na
2
HPO
4
) e 2,1g de fosfato
hidrogenado de potssio (KH
2
PO
4
) em 25 mL de gua destilada ou deionizada.
-Ajuste o pH em 7,2 com peagmetro ou papel indicador.
-Armazene em frasco mbar.
-Para preparar a soluo de trabalho, dilua 1 mL do concentrado com 20 mL de gua
destilada ou dionizada.

-Corante Giemsa:

-p Giemsa..................................................................................................................3,8 g
-metanol..................................................................................................................250mL
-glicerol....................................................................................................................250mL

-adicione o metanol, o p Giemsa, misture e ento adicione o glicerol.
OBS.: aconselhvel o uso de prolas de vidro para facilitar a agitao. Este corante
encontrado comercialmente.














Mtodo rpido para colorao de esfregaos sanguneos finos e espessos pelo
GIEMSA:
1- O esfregao deve estar totalmente seco.
2- Fixe o esfregao fino pincelando-o com algodo embebido em metanol ou
imergindo-o em um recipiente com metanol por poucos segundos. Para ocorrer a
desemoglobinao, o esfregao espesso no deve ser fixado.
3- Prepare uma soluo Giemsa 10% em gua tamponada, destilada ou deionizada,
pH 7,2; se pouca quantidade estiver sendo usada, 3 gotas de corante por mL de
gua tamponada dar a correta concentrao da soluo Giemsa. Uma lmina
requer mais ou menos 3mL de corante feito.
4- Coloque delicadamente o corante na lmina, uma pipeta pode ser usada para isso.
Alternativamente, as laminas devem ser colocadas de face para baixo numa placa
cncava e o corante pode ser introduzido por baixo da lmina.
5- Core de 5 a 10 minutos.
6- Delicadamente, escorra o corante fora da lmina por adio de gotas de gua, no
incline a lamina e no lave.
7- Coloque a lamina na estante, com o lado do esfregao voltado para baixo, para
drenar e secar. Certifique-se de que o esfregao no est tocando a estante.
gua tamponada pH 7,2:
-Dissolver 1,0g de fosfato hidrogenado dissdico anidro (Na
2
HPO
4
) e 0,7g de fosfato
hidrogenado de potssio (KH
2
PO
4
) em 1L de gua destilada ou deionizada.
-Ajuste o pH em 7,2 com peagmetro ou papel indicador.
-Armazene em frasco mbar e guarde ao abrigo da luz.









Identificao de parasitas de malria em esfregaos sanguneos finos:

-O analista deve observar as clulas vermelhas do sangue infectadas e o parasita no
interior das mesmas.
-Clulas vermelhas infectadas:
Observar o tamanho e a presena de granulaes;
Clulas aumentadas com grnulos de Shuffner presentes sugere P. vivax ou P. ovale;
Clula normal com grnulos de Shuffner ausentes P. malarie ou P. falciparum.

OBS.: se forem vistos P. falciparum, a porcentagem da parasitemia (n de clulas
vermelhas infectadas por cento) deve ser relatada.


Mtodo de contagem de parasitas da malria em esfregaos sanguneos espessos:
Baseia-se no nmero de parasita por microlitro de sangue em esfregao espesso, este
sendo contado em relao ao nmero predeterminado de leuccitos. Uma mdia de
8.000 leuccitos por microlitro tomada como padro. Apesar de imprecises devido
a variaes do n de leuccitos entre indivduos com a sade normal, e grandes
variaes em doentes, este padro permite comparaes razoveis.

Tcnica:
-Se aps contados 200 leucocitos, 10 ou mais parasitas forem identificados, anote o
resultado, mostrando o n de parasitas por 200 leuccitos.
-Se aps 200 leuccitos, 9 ou menos parasitas forem encontrados, continue contando
at que 500 leuccitos tenham sido contados, anote o n de parasitas por 500
leuccitos.
-Converter os resultados para microlitros de sangue pela frmula:

N de parasitas x 8000 = N de parasitas por microlitro de sangue
N de leuccitos

-Isto significa que, se 200 leucocitos forem contados, o n de parasitas multiplicado
por 40, e se 500 leucocitos forem contados, multiplica-se o n de parasitas por 16.

Sistema de cruzes:

+: 1 a 10 parasitas por 100 campos de esfregao espesso
++: 11 a 100 parasitas por 100 campos de esfregao espesso
+++: 1 a 10 parasitas por campo de esfregao espesso
++++: mais de 10 parasitas por campo de esfregao espesso

OBS.: itens que podem ser confundidos com parasitas da malria:
-plaquetas aderidas s clulas vermelhas do sangue em esfregaos finos.
-fragmentos de clulas brancas em esfregao espesso.
-aglomerado de plaquetas.
-p, bactria, leveduras, esporos vegetais e outros organismos que aparecem no
esfregao sanguneo enquanto ele est secando.








Sorologia para Chagas:

-Sinonmia: Machado guerreiro pesquisa de anticorpos T. Cruzi Sorologia para
tripanossomase.
-Mtodo: imunofluorescncia, hemaglutinao, contaminao bacteriana.
-Interpretao: teste til no diagnstico da infeco por T. Cruzi, que pode
corresponder a doena de Chagas ou quadros de infeco latente, sem qualquer
expresso clnica.
OBS.: reaes falso-positivos ocorrem com frequncia em pacientes com leishmaniose.

-Enzimaimunoensaio:
-Interferentes: soro muito lipmico.
-Valor de referncia: negativo
-Interpretao: um ensaio imunoenzimtico in vitro para deteco qualitativa do
anticorpo contra o T. cruzi.

-Hemaglutinao:
-Mtodo: hemaglutinao passiva.
-Interferentes: soros lipmicos, leishmaniose.
-Interpretao: hemcias de aves estabilizadas e sensibilizadas com antgenos totais de
T. cruzi, so aglutinadas quando colocadas em contato com diluies de soro de
pacientes chagsicos.

-Imunofluorescncia:
-Interferentes: hemlise, lipemia.
-Interpretao: os anticorpos presentes no soro de pacientes chagsicos quando
colocados sobre uma lmina contendo antgeno de T. cruzi, previamente fixado, so
revelados atravs de uma antiglobulina humana, marcada pela fluorescncia,
formando um complexo antgeno-anticorpo cunjugado.

-Xenodiagnstico:
-Mtodo de diagnstico indireto de escolha quando se quer detectar o parasita na fase
crnica da doena.
-Mtodo Natural:

-Pega-se barbeiros estreis (criados em laboratrio), alimentados com sangue de aves
e coloca-se os mesmos no antebrao do paciente (dentro de uma caixa de fil).
-Deixar o paciente em repouso para que o inseto se alimente. Rotular as caixas com
nome e data.
-Quando os insetos estiverem cheios de sangue, estes sero mantidos em condies
adequadas (umidade 70%, Temperatura 26C).
-Aos 30, 60 ou 90 dias, as fezes do inseto so examinadas (presso abdominal por
pina), por exame direto para visualizao de formas epimastigotas e tripomastigotas.
Esse material pode tambm ser inoculado em cobaias ou mantidos em meio de
hemocultura (LIT).
-O mtodo artificial utilizado quando o paciente tem alergia a picada do barbeiro.
-Mtodo do micro-hematcrito:
-Material: Fita adesiva
Tubo capilar
Centrfuga de micro-hematcrito
-Mtodo:
1- fure o dedo do paciente e coloque 2 gotas de sangue na lmina. Adicione 1 gota de
soluo de citrato de sdio 2% e misture. Complete o tudo capilar at de sua
capacidade.
2- vede a ponta do tubo capilar.
3- centrifugue por 2 minutos para microfilrias, e 4 minutos para tripanossomos.
4- deite o tubo capilar numa lmina e prenda as extremidades com fita adesiva para
manter o tubo fixo.
5 com objetiva 10X examine a rea entre as clulas vermelhas e o plasma. Microfilrias
mveis ou tripanossomos podem ser vistos.
OBS.: a OMS preconiza pelo menos dois mtodos sorolgicos para confirmao de
diagnstico positivo para Doena de Chagas.








Sorologia para toxoplasmose:

-Hemaglutinao:
-Material: soro (mnimo 1mL).
-Preparo do paciente: jejum de 8 horas.
-Interferentes: hemlise.
-Interpretao: os soros, dando reao negativa, so reportados como reagentes e
indicam ausncia de infeco atual. Entretanto, no caso de suspeita clnica da
toxoplasmose aguda, o teste deve ser repetido depois de alguns dias, pois o paciente
pode estar ainda na fase pr-sorolgica da infeco. Todos os soros com resultados
positivos devero ser testados pelo procedimento quantitativo para a confirmao de
positividade e determinao do perfil sorolgico.

-Toxoplasmose IgG e IgM:
-Material: soro (mnimo 1mL).
-Preparo do paciente: jejum de 8 horas.
-Mtodo: imunofluorescncia.
-Interferentes: hemlise, lipemia.
-Valor de referncia: at 1:4000
-Interpretao: as infeces por Toxoplasma gondii esto muito difundidas em seres
humanos e animais, e na maioria dos casos transcorrem sem sintomas clnicos. Em
regies diferentes, e dependendo da idade, os adultos tem anticorpos IgG em nveis de
50% dos casos, e com isso estaro protegidos contra uma nova infeco. A primeira
infeco por Toxoplasma tem grande importncia durante a gravidez (principalmente
na segunda metade). O agente patognico pode contagiar o feto atravs da placenta,
no qual levar ao aborto, ao parto prematuro ou a natimortalidade, como tambm
pode produzir danos graves como hidrocefalia, calcificao intracerebral ou, em casos
leves, ao retardamento cerebral. Somente a primeira infeco pode conduzir a danos
fetais, ao filho e a mulher que, antes da gravidez, j apresenta anticorpos especficos
contra o Toxoplasma gondii.

Toxoplasmose perfil
-Material: soro ou lquor (mnimo 1mL).
-Preparo do paciente: jejum de 4 horas.

-Interferentes: lipemia excessiva.
-Valores de referncia:
Hemaglutinao: at 1:4000
IF indireta IgM: negativo
Fixao do complemento: no-reagente
Perfil I: fase aguda
Perfil II: fase de transio
Perfil III: fase crnica
-Interpretao: teste til no diagnstico e seguimento da toxoplasmose. So definidos
3 padres sorolgicos, cuja finalidade determinar aproximadamente o perodo de
incio da infeco.
-Perfil I: infeco recente, com IgM positiva, IgG em altos ttulos iguais ou superiores a
1:8000, fixao ao complemento com ttulos elevados (iguais ou superiores a 1:160)
-Perfil II: fase de transio, IgM negtiva e IgG e hemaglutinao com altos ttulos.
OBS.: pode-se encontrar vestgios de IgM.
-Perfil III: infeco antiga, IgM negativa, IgG e hemaglutinao em baixos ttulos,
fixao em complemento negativa ou em baixos ttulos.

-Risco de transmisso congnita:
-Perfil I: riscos de transmisso.
-Perfil II: dvidas quanto ao risco.
-Perfil III: sem riscos de transmisso.
OBS.: gestante de risco aquela que nunca entrou em contato com o toxoplasma (IgG
e IgM negativas).

-para diagnstico da toxoplasmose congnita, o melhor indicador sorolgico o IgM,
pois, este no atravessa a placenta.
-o IgG ser indicativo de transmisso congnita se o ttulo do recm-nascido for maior
do que o da me em duas diluies.






Diagnstico laboratorial de Leishmaniose:

-Reao de Montenegro intradermorreao:
Avalia a reao de hipersensibilidade do paciente frente a um antgeno especfico.
til para diagnstico ou monitoramento epidemiolgico.
-Sensibilidade: 80-100%
-Princpio: inoculao de um antgeno especfico intradermicamente, dando
preferncia s formas promastigotas inculas.
-Material: Antgeno inativado
Seringa de 1mL
Algodo
-Mtodo:
-Inocular o,1 mL do antgeno intradermicamente na face interna do brao.
-Realizar leitura em 48-72 horas e observar formao de ppula.
OBS.: tempo de leitura superior ou inferior ao proposto pode levar a resultados
errneos.

-Resultado:
-Positivo: formao de uma reao inflamatria local (ppula), no tendo sido
estabelecido valor numrico para medida desta reao.
-Negativo: ausncia de reao inflamatria.
OBS.:
-Na forma cutnea simples da LTA, a reao inflamatria varia com a evoluo da
doena, sendo maior nas lceras crnicas.
-Forma mucosa de LTA: reao inflamatria intensa (paciente hiper-reativo)
-Forma difusa: reao negativa (deficincia imunolgica do paciente)

Pesquisa de Leishmaniose:
-Material: raspado de lceras, material de puno, sangue total.
-Colheita: no caso de lceras cutneas, o material deve ser obtido por curetagem junto
a derme e nas bordas da leso.
-Mtodo: microscopia sob imerso / colorao Giemsa.
-Interferentes: medicao tpica.

-Interpretao: exame til no diagnstico de Leishmaniose, sendo mtodo especfico,
porm, de baixa sensibilidade no caso de leses cutneas. Aconselha-se realizao de
cultura em meio NNN, reao de Montenegro e sorologia.

-Sorologia para Leishmaniose (principalmente LV):
-Material: soro
-Mtodo: Imunofluorescncia indireta
-Interferentes: reao cruzada com Doena de Chagas
-Interpretao: na Leishmaniose Visceral os ttulos so altos (acima de 1/160). Na L.
tegumentar, os ttulos so baixos e tendem a se correlacionar com as extenses das
leses.
OBS.: Meio NNN (McNeal, Novy e Nicolle)

gar...............................................................................................................................14g
NaCl.................................................................................................................................6g
gua Destilada.........................................................................................................900mL



















reas de atuao Leishmaniose Diagnstico Exame Direto
1. EXAME DIRETO (generalidades)
a tcnica de exame laboratorial que permite visualizar em menor tempo possvel,
fresco ou atravs de colorao, a forma do agente determinante da infeco (vrus,
bactria, protozorio, fungo, helminto, artrpode, etc.), em determinado material
biolgico suspeito (sangue, urina, fezes, exsudatos, linfa-drmica, medula, etc.).
A. EXAME DIRETO NO DIAGNSTICO DE LEISHMANIOSES
1.1 FUNDAMENTO permite visualizar atravs da fixao pelo metanol e posterior
colorao pelo GIEMSA, as formas de AMASTIGOTA ou PROMASTIGOTA, no
diagnstico das Leishmanioses Tegumentares (LT), na Leishmaniose Visceral (LV) e/ou
no contedo de tubo digestivo do inseto transmissor infectado (Lutzomyia, Diptera,
Psychodidae), dependendo da amostra biolgica em exame.
AMASTIGOTA nas escarificaes, aspirado ou bipsia do Homem ou outro
hospedeiro vertebrado, nas leses de LT, ou atravs de puno-biopsia de
gnglio (LT e LV), e de medula ssea ou de bao na LV.
Encontrada em pele e vsceras do reservatrio na natureza e, em laboratrio,
em cobaias (hamster) infectados.
PROMASTIGOTAS no vetor infectado, no sangue de alguns reservatrios e
em meios de cultura.
PARAMASTIGOTAS encontradas fixadas atravs de hemidesmossomas ao
epitlio do intestino do vetor.
2. AS TCNICAS DE COLETA (descrio anexa): Na LT, LC ou LM aps a
escatificao, biopsia e/ou aspirado, pode-se proceder ao exame direto a partir do
esfregao em lmina de vidro. A biopsia permite o exame direto atravs da
aposio ou imprint do tecido em lmina, para impresso da linfa-drmica.
Esperar secar, fixar pelo metanol e, em seguida, corar pelo GIEMSA (secar a
amostra em papel-filtro estril antes do imprint); Na LV na puno de medula
(mielograma), gnglio ou de bao, o exame pode ser feito a partir de rpido
esfregao de medula em lmina, que aps seca e fixada pelo metanol, sofre o
mesmo processo de colorao, citado anteriormente.
3. COLORAO PELO GIEMSA: Antes da colorao, deve-se atender alguns itens
importantes:

3.1 Se no foi voc a realizar a coleta, verificar se as lminas contm material, se tm
identificao correta segundo a solicitao e, se possvel, que contenha o n do
registro, nome do paciente, idade, procedncia, sexo, data da coleta e suspeita
clnica (LV, LM, LCM ou LC).
3.2 Registrar o paciente no livro (ou similar) de entrada de seu laboratrio.
3.3 Se houver dvida quanto fixao das lminas, melhor repeti-la com metanol (PA)
em volume suficiente para cobrir a amostra.
3.4 Calcular o volume total da SOLUO-CORANTE GIEMSA a ser usado, na proporo
de 3mL de soluo por lmina a corar.
3.5 3.5 em proveta de 25mL, pingar de 2 a 3 gotas da SOLUO-ESTOQUE GIEMSA (ver
receita anexa), cuja concentrao varia entre laboratrios, quanto a tempo de
utilizao, maneira de conservao, etc, e completar o volume calculado no item
anterior com SOLUO TAMPO-SULFATO ou GUA TAMPONADA pH = 7.2, e ter
a SOLUO-CORANTE GIEMSA pronta para ser usada.
Exemplo 1: Para corar 20 lminas de 10 pacientes, preciso de 20 x 3mL = 60mL de
SOLUO-CORANTE GIEMSA ou SOLUO-USO.
Preparao da SOLUO-CORANTE GIEMSA: 2 gotas x 60 = 120 gotas (ou 6 mL) de
SOLUO-ESTOQUE GIEMSA que se deve pingar em proveta e completar o volume
para 60 mL com SOLUO TAMPO-SULFATO ou GUA TAMPONADA pH = 7.2.
Exemplo 2: Para cada 15 mL de gua tamponada, usar 30 gotas (ou 1,5 mL) de Giemsa
soluo-estoque e ter uma soluo corante GIEMSA para uso (SOLUO-USO).
3.6 As lminas podem ser mergulhadas na soluo ou esta deve cobrir apenas a face
que contenha a amostra, por tempo que tambm varia de acordo com a qualidade
do corante. Normalmente, aguarda-se 60 minutos, mas desejando o tempo de
colorao mais rpida e dispondo-se de estufa, o tempo pode ser encurtado para
15 a 30 minutos temperatura de 37C.
3.7 Desprezar, limpar o excesso do corante e lavar as lminas em gua corrente, fluxo
suave, evitando jatos fortes para a amostra no se desprender e, em seguida,
sec-las temperatura ambiente ou ventilao, evitando o calor.
3.8 Levar ao microscpio, focalizar e examinar em lente de imerso, procurando as
formas do parasita correspondentes amostra em exame.

3.9 A microscopia da Leishmania qualitativa e mais simples que a do Plasmodium
(que exige contagem de parasitemia), pois, a partir de uma Amastigota, o
resultado positivo, mas em ambos o resultado negativo o mais difcil, pois,
exige exaustivo exame de toda a amostra.
3.10 Registrar o resultado no livro do exame direto e de entrada do laboratrio, se
possvel, datilografar o resultado e encaminhar ao mdico solicitante.
OBS.: imprescindvel o controle de qualidade interno, com reviso de no mnimo
10% das lminas positivas e 15% das negativas, por outro microscopista mais
experiente do servio, e o controla inter-laboratorial com o laboratrio de referencia
do SNLB, ao qual estiver ligado.

SOLUO-ESTOQUE GIEMSA
Giemsa (p)* 7,5g Giemsa (soluo)* 50 mL
Glicerina P.A. 350mL ou Glicerina (P.A.) 23mL
Metanol P.A. 650mL Metanol (P.A.) 43mL

OBS.: *conforme o adquirido pelo laboratrio, melhor a soluo preparada a partir
do p.
-Dissolver em agitador magntico (se disponvel), em recipiente revestido com papel
alumnio, protegendo de luz e agitar por 1 a 2h. Filtrar, estocar em frasco mbar ou
outro tipo que proteja da luz ambiental, rotulado com nome da soluo, data de
preparao e nome de quem a preparou. Guardar em geladeira, retirando alquotas
em frascos mbar menores para utilizar na rotina conforme a necessidade da
SOLUO-USO, quando ser diluda na soluo tampo-fosfato.
SOLUO TAMPO-FOSFATO
Fosfato de Potssio H
2
KPO
4
0,6g
Fosfato de Sdio (bibsico) Na
2
HPO
4
7,5g
H
2
O destilada qsp 1000mL


Dissolver em agitador magntico, medir pH = 7,2, acondicionar em frasco rotulado
(nome da soluo, pH, data de preparao e nome ou iniciais de quem a preparou) e
conservar para uso na rotina, em temperatura ambiente.
OBS.: Existem outras formulas disponveis, inclusive as que usam somente sais
fosfatados; pode-se tambm prepara-las em solues concentradas, SOLUO-
ESTOQUE ou SOLUO-ME, para diluies na hora da utilizao.
COLORAO PELO PANTICO RPIDO
Importante Esta uma tcnica de colorao alternativa ao GIEMSA tradicional.
Tambm constituda por corantes que compem o GIEMSA, tem como maior
vantagem, a rapidez no processo de colocao (3 minutos ou menos), vindo a
beneficiar o doente com um diagnstico mais rpido.
-Imergir a lmina j com esfregao ou imprint, seco por um (1) minuto no Fixador ou
Soluo 1.
-Retirar as lminas do Fixador, apoiar o excesso no papel toalha e, em seguida, voltar a
imergi-la no Revelador ou Soluo 2 por mais um minuto.
-Aps retirar do Revelador, tornar a apoiar o excesso no papel toalha e agora, colocar
no Corante ou Soluo 3 por mais um minuto.
-Aps esse tempo, lavar as lminas em agua corrente, fluxo suave, evitando jatos
fortes e, em seguida, sec-las temperatura ambiente, ou estufa 40C.
-Levar ao microscpio, focalizar e examinar em imerso, procurando formas do
parasita correspondentes a amostra de em exame.
- A microscopia da Leishmania qualitativa e mais simples que a do Plasmodium (que
exige contagem de parasitemia), pois, a partir de uma Amastigota, o resultado
positivo, mas em ambos o resultado negativo o mais difcil, pois, exige exaustivo
exame de toda a amostra.
-Registrar o resultado no livro do exame direto e de entrada do laboratrio, se
possvel, datilografar o resultado e encaminhar ao mdico solicitante.


OBS.: imprescindvel o controle de qualidade interno, com reviso de no mnimo
10% das lminas positivas e 15% das negativas, por outro microscopista mais
experiente do servio, e o controla inter-laboratorial com o laboratrio de referencia
do SNLB, ao qual estiver ligado.

SOLUO PANTICO RPIDO*
Fixador (soluo 1)
Revelador (soluo 2)
Corante (soluo 3)
*Nome comercial da Laborclin

B. ROTINA PARA TCNICAS DE COLETAS DE AMOSTRAS PARA EXAMES NO
DIAGNSTICO DAS LEISHMANIOSES
1. A ESCARIFICAO (procedimento tcnico)
1.1 Registrar o doente, conforme a solicitao do mdico e as normas do laboratrio
(livro de registro de entrada + questionrio e n de laboratrio), conferindo dados
de identificao e epidemiologia, informando-o sobre o exame que vai ser
submetido.
1.2 Separar os materiais necessrios para o exame (lista abaixo).
1.3 Usar luvas.
1.4 Escolher o local para o exame, que deve ser a leso mais recente e com menos
infeco secundria.
1.5 Lavar a leso com gua e sabo, ou soro fisiolgico.
1.6 Fazer assepsia ou limpar a regio a ser escarificada com gaze ou algodo embebido
de lcool 70% ou 96%, trocando 3 a 4 vezes. No usar lcool iodado, se interessar
preservar a viabilidade do parasita ou em caso de alergia do paciente.
1.7 Usar anestsico em gel ou adesivo (EMLA) no local a examinar.
1.8 Utilizar estilete ou lanceta, palito de madeira com a ponta em bisel, escarificador
de Naiff ou lmina de bisturi esterilizados (por serem descartveis, preferimos
coletar com a lateral do estilete ou lanceta, usado no exame de sangue da

malria). Comprimir a pele (LC) da borda da leso entre os dedos, para provocar a
isquemia do tecido e, ao mesmo tempo, deve-se escarific-lo de modo a conseguir
a linda, preferencialmente sem sangue.
1.9 Proceder os esfregaos em numero e tamanho padronizados/lmina e, no mnimo,
em trs lminas de vidro, previamente limpas, identificadas e ainda, friccionadas
em tecido de algodo limpo, momentos antes da coleta.
1.10 Lembrar que a escarificao tambm permite, se necessrio, colher material
para cultura, inoculao em animal ou para congelao para estudos em biologia
molecular.
1.11 Cuidar do doente, fazendo curativo compressivo com gaze e esparadrapo e
orientar a retira-lo aps 24 horas do exame.
1.12 Fixar o material das lminas com metanol ou lcool metlico por 3 a 5 e
reservar para colorao.

2. A BIPSIA (procedimento tcnico)
2.1 Proceder como nas condutas listadas de 1.1 a 1.6 do item anterior (escarificao).
2.2 Anestesiar a regio a partir de um determinado ponto da pele, com injeo
subcutnea de lidocana 2%, sem adrenalina, infiltrar cerca de 0,2 a 0,5mL. Usar,
preferencialmente, seringas tipo tuberculina, com agulhas removveis, tendo
cuidado de sempre trocar a que aspira o anestsico do frasco por uma nova agulha
a ser utilizada no paciente.
2.2.1 Aguardar o tempo de ao do anestsico e proceder bipsia, utilizando
punch de 4 ou 5 mm de (pele e outras localizaes) e de 2 mm de em
pele da face. Movimentar o punch em rotao de meio crculo para a esquerda
e direita, alternadamente, e quando se chegar derme (a amostra comea a
ser visualizada no espao aberto do punch), a movimentao deve passar a ser
em sentido levemente inclinado de 45, no intuito de seccionar a base do cone
da bipsia. Se houver dificuldade de cortar a base com o punch ou bisturi, usar
a tesoura, cortando para baixo. Evite usar a pina. A bipsia tambm pode ser
feita com bisturi, na falta do punch, mas nos dois procedimentos evitar
pontear, porque, na Leishmaniose, possibilita a ampliao da leso. Fazer a
hemostasia compressiva por 1 a 5. Deixar o punch com a amostra em placa
de Petri estril.

2.3 Na musocsa nasal, usar anestsico tpico, em spray, sem sabor e jatear de 3 a 4
vezes, com intervalos de 5 minutos. Biopsiar a mucosa lesada com pina STORZ.
Cuidar do doente, fazendo curativo compressivo com tampo de gaze e orientar
retir-lo aps cessar o sangramento.
2.4 Cuidar do doente, fazendo curativo com gaze e esparadrapo, e orientar retir-lo 24
horas aps o exame.
2.5 Separar a amostra do punch e seccionar, usando pina de dissecao e bisturis
esterilizados, no sentido longitudinal epiderme-derme, de modo a dividi-la em
fragmentos (secar em papel filtro) para o exame direto, cultura e inoculao em
animal (em soluo salina), histopatologia (formol a 10%) e/ou congelamento para
procedimentos em biologia molecular.
2.6 Alguns preferem separar e no utilizar a epiderme.
OBS.: A bipsia de pele ou mucosa considerada ato mdico, e a de mucosa s deve
ser feita aps treinamento especializado ou por Otorrinolaringologista.
3. O ASPIRADO (procedimento tcnico)
3.1 Procedimentos semelhantes citados nos itens de 1.1 a 1.6 (escarificao).
3.2 Anestesiar a regio a ser aspirada a partir de um determinado ponto da pele ou
mucosa, com injeo subcutnea de lidocana a 2%, sem adrenalina. Infiltrar cerca
de 0,2 a 0,5mL. Usar, preferencialmente, seringas tipo tuberculina com agulhas
removveis, tendo cuidados de sempre trocar a agulha que aspirar o anestsico do
frasco por uma nova agulha a ser utilizada no paciente.
3.3 Aguardar o tempo de ao do anestsico e proceder a aspirao propriamente
dita: com seringa tipo tuberculina, injetar no ponto anestesiado cerca de o,3mL de
salina estril e tentar aspir-la, movendo a agulha em sentido lateral, ao mesmo
tempo em que feita a aspirao para o meio de cultivo. Pode ser empregada a
tcnica de MARZOCHI (1993) e ROMERO (1999) onde se dispe de um sistema
aspirador conectado a um frasco vacutainer com meio de cultura para
Leishmania + vcuo (de onde foi retirado o ar, atravs de seringa 20 mL),
semelhante ao utilizado para coletar sangue para sorologia.
3.4 Como a escarificao, esta tcnica de coleta tambm permite a retirada das
amostras para cultura, inoculao em hamster, exceto histopatologia. Parte do
material aspirado com salina pode ser utilizado para esfregao e/ou aposio em

trs lminas previamente limpas e identificadas para exame direto e, aps fixao
com metanol, reservar para colorao.

4. MIELOGRAMA (PUNO DE MEDULA SSEA), LINFONODO OU PUNO DE BAO
Todos estes so considerados atos mdicos e s devem ser realizados por
profissionais treinados, obedecendo s normas tcnicas da OMS (1990), em
ambiente ambulatorial ou hospitalar, oferecendo ao doente as condies devidas
da hemostasia.
4.1 Aps a coleta atravs de puno bipsia o exsudato (material medular ou linda)
deve ser colocado em frascos estreis, contendo uma gota de anticoagulante
universal (EDTA) para, posteriormente, no laboratrio, ser semeado em cultura,
inocular em hamsters e/ou fazer o esfregao por distenso ou aposio em trs
lminas previamente limpas e identificadas para exame direto e, aps fixao com
metanol, reservar para colorao.















Material vaginal e uretral:
-A coleta destes materiais visa a deteco de T. vaginalis, que um protozorio
flagelado do sistema urogenital. Normalmente so identificados em montagens
fresco, pois, em preparaes coradas estes organismos sai deformados e podem no
ser reconhecidos.
-Coleta e amostras:
-Materiais: Swab de algodo estril
Lminas microscpicas/lamnulas
Pipetas de Pasteur
Tubos de ensaio tampados e com 3mL de soluo salina
Centrfuga
Microscpio
-Tcnica:
1- Com um swab estril, colete a secreo uretral ou vaginal.
2- Coloque o swab imediatamente dentro de um tubo estril contendo salina. A ponta
do swab pode ser quebrada, se este for maior que o tubo.
3- Podem ser feitos esfregaos para colorao. Para isto, colete mais material com um
segundo swab estril e esfregue na lmina. Deixe secar, e depois prossiga com a
colorao.
4- Etiquete os tubos e as lminas com n ou nome do paciente e a data da coleta.

-Exame direto de esfregaos vaginais e uretrais:
-Se o paciente puder vir ao laboratrio, colha a secreo e coloque em cima de uma
gota de soluo Salina na lmina.
-Cubra com lamnula e examine nas objetivas de 10X e 40X para motilidade dos
flagelados.

-Material centrifugado ou sedimentado:
1- Se for recebido um swab em soluo salina, remova o excesso de lquido do swab
por aperta-lo contra a parede do tubo. Jogue fora o swab.
2- Centrifugue o tubo por 2 minutos. Se no houver nenhuma centrifuga disponvel,
deixe o tubo descansar por 10 minutos, para permitir a sedimentao.
3- Com uma pipeta, remova o fluido sobrenadante. No agite o sedimento.
4- Pegue uma gota do sedimento e coloque na lmina.
5- Cubra com lamnula e examine com objetiva de 10X e 40X para motilidade dos
flagelados.
OBS.: em montagem a fresco, flagelados podem ser identificados por seus
movimentos padres. Trofozotos de T. vaginalis movem-se como um nervo,
movimento irregular ou saltitante.
-T. vaginalis pode ser frequentemente encontrado em sedimento urinrio, no qual
possvel observ-lo em movimento. A sua presena deve ser relatada em laudo.












Mtodo de Diagnstico
Pesquisa e identificao de trofozotos mveis em secreo
uretral recente, esfregao vaginal ou urina.
Pode ser reconhecido em esfregao cervical corado por
Papanicolaou.
Recomendaes para o Diagnstico
1- Corrimento vaginal ou uretral recente ou secrees
prostticas so examinados em preparao mida,
diluda com uma gota de salina.
2- Vrias amostras podem ser necessrias antes de ser
confirmado o diagnstico.

Colorao de esfregaos sanguneos para Microfilrias:
Materiais e Reagentes:
-5 cubas para corante
-ter - etanol fixador
-descorante de gua - cido clordrico
-corante hematoxilina de Delafield
Tcnica:
1- Prepare os esfregaos de sangue obtido por puno digital. Deixe secar de um dia para
o outro (8 10 horas).
2- Prepare cubas com corantes como se segue:
-Cuba 1: gua de torneira
-Cuba 2: ter - etanol
-Cuba 3: corante hematoxilina de Delafield
-Cuba 4: gua cido clordrico (HCl a 0,05%)
-Cuba 5: gua de torneira

3- Coloque o esfregao seco em gua de torneira (cuba 1) por 5 10 minutos. As clulas
vermelhas do sangue lisam, e o esfregao ficar claro ou branco, quando lisar
completamente.
4- Deixe o esfregao secar.
5- Coloque em ter etanol (cuba 2) por 10 minutos.
6- Deixe secar.
7- Coloque o esfregao em corante hematoxilina de Delafield (cuba 3) por 15 minutos.
8- Descore com gua cido clordrico (cuba 4). Mergulhe a lmina rapidamente dentro
da mistura por duas vezes. O esfregao ficar vermelho.
9- Imediatamente coloque a lmina em gua de torneira (cuba 5) para retirar o cido.
Ponha a cuba debaixo de gua corrente at o corante ficar azul.
10- Deixe o esfregao secar e examine-o com objetiva de imerso.

Fixador ter-etanol:
-ter........................................................................................................................................20mL
-etanol 95%.............................................................................................................................20mL
Adicione o ter ao lcool numa proveta graduada e agite.

Corante hematoxilina Delafield:
-cristais de hematoxilina..............................................................................................................1g
-etanol absoluto.....................................................................................................................10mL
-soluo saturada de sulfato de amnia alumnio em gua.................................................100mL
-glicerol...................................................................................................................................25mL
-metanol absoluto..................................................................................................................25mL
OBS.: este corante pode ser comprado comercialmente.

Descorante gua-cido clordrico
-HCl concentrado...................................................................................................................0,5mL
-gua destilada.....................................................................................................................100mL
Mea a gua destilada e coloque-a num recipiente de vidro, e adicione lentamente o HCl.

Teste de Knott para concentrao de microfilrias:
-Quando se suspeita de filariose, pode ser til concentrar o sangue para aumentar a
possibilidade de se encontrar microfilrias.

Tcnica:
1- Retire 2mL de sangue total e coloque-o imediatamente em tubo de centrifuga
contendo 10mL de formol a 2%.
2- Misture completamente por inverso. O formol hemolisa os glbulos vermelhos, fixa,
mata e endireita o corpo das microfilrias.
3- Centrifugue o tubo por 5 minutos.
4- Decante o sobrenadante.
5- Retire o sedimento com uma pipeta de Pasteur e o espalhe numa gota espessa sobre
uma lmina.
6- O sedimento pode ser examinado a fresco, ou a lmina pode ser deixada para secar
durante uma noite, seguindo-se a colorao pelo Giemsa durante 45 minutos.
7- Descore em gua por 10 15 minutos. Deixe secar e examine.
OBS.: existem outras tcnicas de concentrao, incluindo-se a filtrao de sangue
hemolisado atravs de filtros de poros finos, e ento corando o filtro para pesquisa de
microfilrias, ou passando o sangue atravs do filtro de Sephadex.

Sorologia para Filariose:
-Mtodo: enzimaimunoensaio
-Valor de referncia: negativo
-Interpretao: o teste tem utilidade relativa no diagnstico, a pesquisa de filria no
sangue fornece dados mais precisos, uma vez que a pesquisa de anticorpos pode sofrer
vrias interferncias.

-Coleta de sangue para pesquisa de microfilrias:
O perodo do dia importante para a coleta, pois, algumas espcies tem periodicidade.
Microfilrias esto presentes no sangue apenas em certos perodos do dia.
-Wulchereria bancrofti: coletar noite, entre 22:00 e 00:00 horas.

Deteco de microfilrias no sangue perifrico:
-Esfregao de sangue espesso (gota espessa) idem malria.
-Exame direto de sangue gota de sangue em soluo salina.
-Exame de sangue venoso hemolisado.
-Materiais e reagentes: Frasco 10mL
Centrfuga
Tubos cnicos para centrifugao
Lminas/lamnulas
Anticoagulante citrato de sdio 2%, soluo de formalina 2%
Corante Giemsa
ter/etanol
-Mtodo:
1- Adicione 1mL de sangue venoso a 9mL de formalina 2%, espere 5 minutos para
hemlise, e ento centrifugue em alta rotao.
2- Jogue o sobrenadante fora.
3- Coloque uma gota do sedimento na lmina. Espalhe para formar um esfregao fino.
Deixe secar ao ar. Fixe o esfregao usando uma mistura de partes iguais ter/etanol e
deixe secar por 2 minutos. Core com Giemsa.

-Tcnica do micro-hematcrito: idem ao T. cruzi, porm, com tempo de centrifugao de 2
minutos.





Helmintos
H trs grupos de Helmintos de importncia mdica nematdeos,
cestdeos e trematdeos. Os estgios para diagnstico usual so ovos e
larvas. Menos frequentemente, vermes adultos como Ascaris e Enterobius
podem ser vistos; segmentos ou progltides so usados para diagnosticar,
com certeza, vermes de tnia.

Chave para identificao dos ovos

As caractersticas usadas para identificar as espcies dos ovos so as
seguintes:
1. Tamanho O comprimento e a largura so medidos ao alcance
especfico.
2. Forma Cada verme tem sua forma particular.
3. Estgio de desenvolvimento quando coletadas Em algumas espcies,
os ovos consistem em uma nica clula; em outras pode haver vrias
clulas; algumas espcies so, normalmente, embrionadas (ex: eles
contm uma larva) quando coletado nas fezes.
Ocasionalmente, se as amostras de fezes estiverem velhas por vrias
horas ou 1 2 dias, os ovos podem se desenvolver em estgios mais
avanados. Os ovos de Ascaris normalmente tem apenas uma clula
quando coletados nas fezes, contudo, a mesma pode se dividir e, em
amostras velhas, pode-se encontrar ovos com 2 ou 4 clulas. Ovos de
ancilstomo em amostras que foram coletadas h vrias horas podem
conter 16, 32 ou mais clulas. Em 12 24 horas, os ovos podem estar
embrionados e, posteriormente, ainda, a larva pode eclodir. Entretanto,
quando observamos o estagio de desenvolvimento dos ovos dos
helmintos, temos certeza de que a amostra de fezes foi coletada fresca.
Se ela tiver vrias horas ou dias, espera-se ver alteraes nos estgios
de desenvolvimento de algumas espcies. ideal aceitar apenas
amostras frescas para diagnstico.
4. Espessura do envoltrio do ovo Algumas espcies como Ascaris tem o
envoltrio espesso, outras como o ancilstomo tem o envoltrio fino.
5. Cor Alguns ovos so incolores (ancilstomo, Enterobius), outros so
amarelos ou marrons (Ascaris, Trichuris).
6. Presena de caractersticas como oprculo, espculas, tampes,
ganchos ou revestimento externo mamilado.

Se um ovo ou objeto que se parea com o ovo, for encontrado, estas
caractersticas devem ser cuidadosamente observadas para se fazer uma
identificao especfica. Ocasionalmente, podem ser vistos ovos atpicos ou
deformados. Nestes casos, ser necessrio procurar por formas tpicas para

se fazer um diagnstico confivel. Lembre-se de que mais do que uma
espcie de heminto pode estar presente em um nico paciente.















Olhe o tamanho, forma, estgio de desenvolvimento, espessura do
envoltrio do ovo, cor e presena de estruturas especiais como
oprculo, espculas, tampes, ganchos e revestimento externo saliente
para identificar espcies de ovos.

Aula prtica: Exame direto de fezes
-Material: Lminas microscpicas
Lamnulas
Soluo salina, lugol, soluo azul de metileno
Palitos de dente (esptula de madeira ou plstica, descartvel)
-Exame microscpico:
-Observar a consistncia da amostra fecal e anotar na ficha de diagnstico.
-Verificar a presena de sangue ou muco, e relatar.
-Verificar a presena de proglotes de cestodas e/ou pequenos nematodas (caso positivo,
devem ser separados para clarificao cido actico glacial).
-Exame microscpico:
-Montagem direta em soluo de salina e lugol.
1- Identificao da lmina.
2- Coloque uma gota de salina no meio da lmina.
3- Com o auxlio de um palito, recolha uma pequena poro do material (fezes) e misture com
a salina.
4- Acrescente uma gota da soluo de lugol.
5- Cubra com lamnula sugere a lamnula em ngulo reto, toque a margem da gota e abaixe
delicadamente a lamnula sobre a lmina.
6- Coloque a lmina com a montagem no campo do microscpio e foque com a objetiva
de 10X ou de menor aumento.
7- Regule a luz do microscpio com o diafragma (muita ou pouca luz no adequado).
8- Examine a rea total da lamnula fazendo movimentos em Z.

-Quando so vistos organismos ou materiais duvidosos, mude para a objetiva de 40X, para
visualizao ntida da morfologia.

-NOTAS:
-Recomenda-se observar 1/3 da lmina com aumento de 40X.
-Os resultados devem ser comprovados por outras tcnicas.
-O uso de lugol fica a critrio do analista ( recomendvel).



Tcnica de WILLIS - 1921 (Flutuao simples):

-Material:
-Recipientes para coleta de fezes ou frascos com boca no superior a 3 cm de dimetro. O
ideal o frasco de Borrel.
-Basto de vidro.
-Lminas.
-Lamnula.
-Soluo de cloreto de sdio (NaCl) saturada ou com densidade especfica de 1,20 g/mL.

-Procedimento:
1- Colocar uma poro de fezes (1 a 2g), coletada em vrias partes da amostra dentro do
recipiente escolhido para realizao. Colocar a soluo de NaCl at o meio do frasco.

2- Suspender as fezes na soluo, utilizando basto de vidro, at completa homogeneizao.

3- Completar o volume at as bordas do frasco e ento, colocar uma lamnula ou lmina na
borda do frasco de maneira que a lmina fique em contato com o liquido sem haver formao
de bolhas entre as superfcies.

4- Deixar as superfcies em contato por 5 a 15 minutos. A pelcula contendo ovos, cistos e
larvas, se adere parte inferior da lmina.

5- Aps decorrido o tempo, inverter rapidamente a lmina, virando-a para cima.
6- Recobrir com lamnula, adicionar uma gota de lugol ( critrio) e examinar a microscpio
com objetiva de pequeno aumento (10X). Recomenda-se observar 1/3 da preparao com
objetiva de aumento maior (40X).
NOTA: Os ovos no flutuam na superfcie do reagente quando a homogeneizao do material
fecal incompleta. A flutuao dos ovos no se realiza quando o perodo de repouso for
inferior ao estipulado.
-Princpio: flutuao espontnea. Originalmente preconizado para pesquisa de ovos de
ANCILOSTOMDEOS, pode revelar presena de outros ovos como scaris, Enterobius, T.
trichiurus e at S. mansoni. Mtodo especfico para ovos leves (baixa densidade).







Tcnica de FAUST & COLS (centrfugo-flutuao):
-Material: Soluo de sulfato de zinco, densidade 1,18g/dL.
Frasco de Borrel.
Basto de vidro.
Gazes.
Funil pequeno.
Tubos de centrfuga.
Centrfuga.
Ala de platina.
Lmina/lamnula.
-Procedimento:
-Em frasco apropriado, preparar uma suspenso de fezes.
-Usando um funil pequeno e gaze dobrada, coar a suspenso de fezes para tubo de centrfuga.
-Centrifugar por 1 minuto, a 2500 rpm. Decantar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento.
-Adicionar gua at 1 cm das bordas do tubo. Centrifugar por 1 minuto a 2500 rpm. Decantar o
sobrenadante.
-Adicionar cerca de 3mL de soluo de sulfato de zinco e ressuspender o sedimento. Adicionar
mais soluo de sulfato de zinco at atingir o nvel de 1 cm das bordas do tubo.
-Centrifugar por 2 minutos a 2500 rpm.
-Com uma ala de platina dobrada em L, colher a fina pelcula que se forma da superfcie,
passando-a para lmina (2 ou 3 pescadas).
-Adicionar uma gota de soluo de lugol, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio em
pequeno aumento (10X).







Mtodo de KATO-KATZ:
-Excelente mtodo para pesquisa de ovos de S. mansoni, A. lumbricoides, T. trichiurus.
-Amostra: fezes frescas ou conservadas. Fezes diarreicas no so utilizadas.
-Tcnica:
-Preparar soluo verde malaquita (finalidade de conservar e clarear as fezes)
Glicerina................................................................................................................................100mL
gua destilada......................................................................................................................100mL
Verde-malaquita 3%.................................................................................................................1mL
-Cortar papel celofane semipermevel em pedaos similares a lamnulas, e deixa-los
mergulhados na soluo de verde-malaquita por 24 horas.
-Colocar a amostra a ser analisada sobre um papel higinico.
-Comprimir a parte superior com um pedao de tela metlica (marca IBRAS 120, fios urdume e
trama 0,09 mm) sobre sua superfcie. Pela malha passam os ovos de helmintos e detritos
menores.
-Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com auxlio de um
palito, para um carto retangular, contendo no seu centro um orifcio de 6 mm de dimetro (as
fezes so colocadas nesse orifcio).
-Aps encheu completamente o orifcio, retirar o carto, cuidadosamente, deixando as fezes
sobre a lmina de vidro.
-Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane, comprimindo a lmina, aps t-la invertido,
contra a folha de papel absorvente (higinico).
-Aguardar de 1 2 horas e examinar ao microscpio (todos os campos).
-O nmero de ovos encontrados, multiplicados por 23, corresponder ao nmero de ovos por
grama de fezes.
EXEMPLO: 3 ovos encontrados = 69 ovos por grama de fezes.
OBS.: comercialmente, encontra-se Kits prontos para realizao do mtodo Kato-Katz.






Tcnica de LUTZ; HOFFMAN, PONS & JANER:
-Material: Frasco de Borrel
Basto de vidro
Gazes
Clice para sedimentao
Pipeta de Pasteur ou canudo plstico
Funil de vidro
Lmina/Lamnula
-Procedimento:
-Preparar uma suspenso com 2 4 gramas de fezes e 10mL de gua; aps completa
homogeneizao, adicionar cerca de 10mL de gua.
-Coar a suspenso de fezes atravs de gaze dobrada 4x para o clice. Adicionar gua at 4 cm
da borda do clice.
-Deixar sedimentar por 2 24 horas.
-Recolher um pouco de sedimento (canudo) e passar para a lmina, recobrir com lamnula e
observar ao microscpio com objetiva de 10X.
NOTAS:
-Use lugol optativo (recomenda-se).
-Se o lquido da preparao estiver turvo, faz-se a lavagem do mesmo por decantao
cuidadosa, completando-se o volume com mais gua (repouso de 60 minutos).










Mtodo de Baerman-Moraes:
-Princpio: termo e hidrotopismo de larvas de helmintos.
-Material: fezes ou terra.
-Procedimento:
-Colocar de 8 10 g de fezes ou terra em uma gaze dobrada em quatro.
-Colocar o material assim preparado em um funil, com gua, a 45C.
-Deixar 1 hora em repouso.
-Passado este tempo, desobstruir a borracha que se encaixa no funil e recolher de 5 a 7 mL.
-Recolher a gua em vidro de relgio (observar em lupa) ou em tubo de centrifugao,
centrifugando o mesmo a 1000 rpm por 1 minuto. Observar o sedimento.

Mtodo de Rugai:
-Colocar de 8 10 g de fezes ou terra em uma gaze dobrada em quatro e fazer uma pequena
trouxa.
-Colocar o material assim preparado em um clice de sedimentao cheio de gua morna
(45C) at o meio.
-Deixar uma hora em repouso.
-Colher no fundo do clice as larvas porventura existentes, com auxlio de uma pipeta.
-Examinar em lupa ou microscpio.











MTODOS DE SEDIMENTAO POR CENTRIFUGAO
Mtodo de RITCHIE, Mtodo de Blagg
-Princpio: sedimentao mecnica (centrifugao).
-A diferena nos mtodos acima refere-se principalmente na conservao das amostras.
-Fezes conservadas em formalina 10% - Mtodo de Ritchie ou formol-ter.
-Fezes conservadas em MIF Mtodo de Blagg ou MIFC.
-Mtodo de Ritchie:
-Material: Frasco de Borrel
Basto de Vidro
Gazes
Tubos de centrfuga cnicos
Funil pequeno
Swab de algodo
Lmina/lamnula
Formalina 10%
ter
Lugol
-Procedimento:
-Agitar bem o frasco contendo material fecal conservadas em formalina.
-Coar a suspenso por gaze para um tubo de centrfuga at o meio.
-Adicionar salina ou gua at um dedo da borda do tubo. Centrifugar a 1500 rpm por 10
minutos. Decantar o sobrenadante, deixando cerca de 1,5mL do sedimento.
-Adicionar 9mL de formalina 10% e misturar.
-Adicionar 3mL de ter e tampar o tubo com rolha de borracha e agitar vigorosamente por 1
minuto.
-Centrifugar por 10 minutos a 1500 rpm (formao de camadas).
-Soltar a pelcula de gordura com uma esptula e desprezar o sobrenadante por rpida
inverso do tubo.
-Limpar as paredes do tubo com swab de algodo.

-Transferir parte do sedimento para lmina e observar 10X, 40X (lugol recomendado).
OBS.: 4 camadas:
1- Sedimento
2- Formalina
3- Tampo de detritos fecais
4- ter
-Mtodo de Blagg:
-Material: os mesmos da tcnica de Rithcie, com exceo da formalina.
-Procedimento:
-Agitar bem o tubo contendo amostra fecal em MIF.
-Coar a suspenso por gaze para tubo cnico at o meio.
-Adicionar 4,5mL de ter, tampar e agitar por 1 minuto.
-Retirar a tampa e centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto.
-Soltar a pelcula de gordura com uma esptula e desprezar o sobrenadante.
-Limpar as paredes do tubo com swab de algodo.
-Transferir o sedimento para lmina e observar 10X, 40X (lugol recomendado).














Mtodo de SHEATHES:
-Especfico para oocistos de coccdeos (Isospora, Cryptosporidium).
-Procedimento:
-Misturar em partes iguais fezes e soluo fisiolgica (NaCl).
-Filtrar a soluo em gaze.
-Recolher o filtrado em tubo de centrfuga (at o meio).
-Completar o tubo com soluo saturada de acar.
-Cobrir o tubo com lamnula plstica ou de papel celofane transparente, e fixa-la com elstico.
-Centrifugar por 5 minutos ou deixar em repouso por 1 hora.
-Retirar a lamnula, colocar sobre uma lmina e examinar a microscpio (40X).

FITA GOMADA, ANAL SWAB, MTODO DE GRAHAN
-Mtodo especfico para pesquisa de ovos de E. vermiculares.
-Procedimento:
-Corta-se um pedao de 8 10 cm de fita adesiva transparente.
-Coloca-se o mesmo sobre um tubo de ensaio com a parte adesiva voltada para fora.
-Passe o tubo com a fita vrias vezes na regio perianal.
-Aps a coleta do material, fixar a fita sobre uma lmina, procurando evitar dobras e formao
de bolhas de ar.
-Examinar todo o campo ao microscpio com objetivas de 10X e 40X.
OBS.: o diagnstico pelo EPF muito falho, no ultrapassando a positividade de 10%, em
funo das caractersticas do prprio ovo (muito leve e flutua por mtodos de sedimentao.
- comum encontrar tambm ovos de Ascaris, T. trichiura e outros parasitas por este mtodo.
-Ideal colher o material pela manh, sem que o paciente troque de roupa ou faa higienizao.





Pesquisa de SANGUE-OCULTO nas fezes:
Tal pesquisa de grande importncia clnica no diagnstico das hemorragias do trato
digestivo, tendo por base os efeitos catalticos dos compostos de heme sobre a oxidao de
substncias orgnicas como a benzidina, guiiaco, etc.
Sabe-se que a ingesto de carne na alimentao ou de vegetais pode acarretar pequena
atividade de peroxidase. Assim, o sangramento gengival e alimentao podem influir no
resultado do exame. Para realizao de um bom teste deve-se preservar rigorosa dieta por
quatro dias, excluindo-se carnes, vegetais clorofilados, medicamentos a base de ferro e os
demais cuidados em relao a possveis sangramentos gengivais.
-Amostra: fezes recm-emitidas, de preferncia sem conservantes.
-Tcnicas:
REAO DE BENZIDINA:
-A gua oxigenada decomposta pela ao da peroxidase do sangue e o oxignio liberado
oxida a benzidina, formando um composto de cor azul ou verde.
-Procedimento:
-Espalhar pequena quantidade de fezes sobre um papel de filtro, gotejar 2 ou 3 gotas de gua
oxigenada e juntar igual quantidade de soluo de benzidina, observar:
Sem alterao na cor: negativo
Esverdeado: traos
Verde claro: +
Verde escuro: ++
Verde azulado: +++
Azul: ++++
-Reagentes:
-gua oxigenada (perxido de hidrognio 3%)
-Soluo Benzidina:
cido actico glacial...............................................................................................................25mL
Benzidina em p..........................................................................................................................5g




REAO DE MEYER:
A fenolftalena reduzida pelo zinco para anidrido fltlico que, oxidado pela gua oxigenada,
desprende oxignio pela ao do sangue, transforma-se novamente em fenolftalena,
assumindo colorao vermelha em meio alcalino.
-Procedimento:
-Fazer uma suspenso de fezes 5%. Passar 5mL para um tubo de ensaio e juntar 1mL de
reativo de Meyer-Johannessen. Inverter vrias vezes e acrescentar 3 a 4 gotas de gua
oxigenada.
-Reao positiva: desenvolvimento de cor vermelha imediata.
Reativo de Meyer-Johannessen:
Fenolftalena................................................................................................................................2g
Hidrxido de potssio anidro....................................................................................................20g
gua destilada qsp................................................................................................................100mL
Aquecer at fervura, acrescentando de 10 a 30 g de zinco em p. Armazenas em frasco mbar.
OBS.: Atualmente, vem sendo utilizadas tcnicas mais especficas como a determinao da
hemoglobina humana por um anticorpo monoclonal especfico para a mesma.














SOMENTE PARA USO DIAGNSTICO IN VITRO
Finalidade: Pesquisa de Sangue Oculto nas fezes pela tcnica de Meyer-Johannessen.
Princpio: A fenolftalena reduzida pelo zinco para anidrido fltlico que, oxidado pela gua
oxigenada, desprende oxignio pela ao do sangue, transforma-se novamente em
fenolftalena. Como o meio alcalino, ela assume a colorao vermelha caracterstica.
Metodologia: Meyer-Johannessen.
Sensibilidade: a sensibilidade do mtodo > 5mg de hb por grama de fezes.
Reagentes:
REAGENTE CROMGENO: Reagente pronto para uso. Constituintes: Hidrxido de potssio
(KOH) 4,46M, fenolftalena 0,07M e zinco em p. Usar sem agitar.
REAGENTE REVELADOR: Reagente pronto para uso. Constituinte: Perxido de hidrognio a 10
volumes.
Armazenamento dos reagentes: entre 15 e 30C.
Estabilidade dos reagentes: Estvel at a data registrada no rtulo, quando respeitadas as
condies de armazenamento.
Amostra biolgica: Fezes. Deve-se fazer um regime alimentar, evitando comer vegetais e
carne durante 3 dias antes da coleta. Quantidade mnima: 10g de fezes.
Conservao da amostra: Conservar entre 2 a 8C, por um perodo mximo de 2 dias. O ideal
utilizar amostra recente.
Materiais e equipamentos necessrios: Pipeta 10mL; Tubo de ensaio 10mL; Estante para tubo.
Procedimento tcnico:
Preparar uma suspenso de fezes a mais ou menos 5% em gua destilada (exemplo: 5g de
fezes em 100mL de gua destilada).
Centrifugar 10mL desta suspenso por 5 minutos.
Colocar em um tubo de ensaio 2mL do sobrenadante e acrescentar 0,5 mL de REAGENTE
CROMGENO. Homogenizar.
Pingar sobre esta mistura, 3 gotas do REAGENTE REVELADOR e homogeneizar. Proceder a
leitura.



LEITURA:
REAO POSITIVA: cor vermelha (ntida) no tubo.
REAO NEGATIVA: a reao no muda de cor, ou torna-se rosa bem claro.
Valor de Referncia: negativo.
Interferentes:
1- Mioglobina de hemoglobina de carnes vermelha e/ou branca tem atividade de
peroxidase e podem dar resultado falso-positivo.
2- Aspirina (cido acetil-saliclico) aumenta o sangramento no trato gastro-intestinal,
provocando um resultado falso-positivo.
3- Vegetais e frutas.
Adequao do KIT e controle de qualidade:
Ao abrir o KIT, realizar os testes de Controle-Positivo e Negativo da seguinte maneira:
1- Como CONTROLE POSITIVO podem ser usados 2mL de gua destilada + 0,01mL de
sangue total + 0,5mL de REAGENTE CROMGENO e 3 gotas de REAGENTE REVELADOR.
2- Como CONTROLE NEGATIVO podem ser usados 2mL de gua destilada + 0,5mL de
REAGENTE CROMGENO + 3 gotas do REAGENTE REVELADOR.
Apresentao do KIT:
Kit para 50 reaes:
REAGENTE CROMGENO: 1 x 25mL
REAGENTE REVELADOR: 1 x 10mL
BULA.
Periculosidade: corrosivo.
Descarte: O reagente deve ser descartado numa pia, sobre gua corrente. O sedimento deve
ser descartado sobre gua corrente, no desprez-lo no lixo, pois pode causar incndio.
Observaes:
1- O aparecimento tardio da cor rosa no pode ser considerado positivo.
2- Dieta: o paciente deve se abster de carne, vegetais verdes (clorofila) e medicamentos a
base de ferro por 3 dias antes do exame.
3- O desenvolvimento de cor no reagente indcio de deteriorao.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
HENRY, John Bernard, M.D., Diagnsticos Clnicos & Tratamento por Mtodos Laboratoriais,
18 edio. So Paulo: Manole Ltda.
LIMA, A. Oliveira (et al): Mtodos de Laboratrios Aplicados a Clnica, 6 edio. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1985.

Tamizao das fezes para pesquisa de proglotes de Taenia ou partes de eliminao
-Para pesquisa de proglotes de Taenias, esclex e eventualmente a eliminao de pequenos
vermes, deve-se coletar todas as fezes emitidas. Em geral, aps o uso de laxantes.
-O paciente dever coletar todo volume fecal proveniente de uma nica evacuao, ou maior
quantidade critrio.
-No laboratrio, emulsionar as fezes em gua com auxlio de basto de vidro e coar todo
material em tamis metlico de 80 a 100 malhas por cm, sob uma torneira aberta.
-Atentamente, coletar as proglotes ou vermes eventualmente retidos na peneira.
Exame macroscpico de fragmentos ou partes de eliminao para comprovao de helmintos:
No raro so levados ao laboratrio para identificao, pequenos fragmentos vegetais mal
digeridos, sementes, pequenos pedaos de plstico e uma infinidade de estranhos espcimes
confundidos com pequenos vermes. Por outras vezes o material pode apresentar larvas de
moscas que so sugestivas de verminose, mas na verdade no passam de contaminao em
amostras deixadas descobertas por mais de 24 horas.
-Exemplares de scaris lumbricoides, Enterobius vermiculares e proglotes de Taenias so
frequentemente enviados para exame, e estes devem ser processados por exame direto com
ou sem colorao.
-O esmagamento da fmea de E. vermiculares expulso nas fezes, entre a lmina e a lamnula
corados pelo lugol, apresenta uma grade quantidade de ovos caractersticos dessa espcie.
Identificao dos proglotes de Taenia:
-Pelo fato da Taenia solium desenvolver cisticercose no homem, a identificao e
caracterizao de proglotes tem alto significado clnico.
-As proglotes de T. solium so expulsas durante ou aps as evacuaes, unidas de 3 a 6
elementos; na T. saginata as proglotes costumam sair ativamente e, em geral, isoladas, nos
intervalos das evacuaes.
Tcnica:
-Mergulhar as proglotes em cido actico glacial, por tempo superior a 15 minutos, utilizando
placas de Petri, vidro de relgio ou qualquer outro recipiente.
-Retirar a proglote do cido, enxaguar o excesso com papel de filtro e comprimi-la entre duas
lminas largas. Examinar sob iluminao intensa.
-Os caracteres do tero e de suas ramificaes permitiro diferenciar proglote grvida das
duas espcies de Taenias.
-Taenia saginata: apresenta o tero com ramificaes laterais, finas e numerosas, prximas ao
tubo uterino longitudinal.

-Taenia solium: apresenta esses prolongamentos espessos e em menor nmero.
Identificao do esclex de Taenias:
-O encontro do esclex significa eliminao total do parasita, este, por sua vez, pode ser
identificado atravs de microscopia, sendo que esta estrutura tem aproximadamente 1 mm de
dimetro.
-Taenia saginata: no possui rostro (coroa de acleos), apresenta ventosas.
-Taenia solium: esclex com rostro armado, apresenta ventosas.






















Gorduras fecais
Normalmente poder existir pequena quantidade de gordura nas fezes (at 7g), na forma de
gorduras neutras, cidos graxos e sabes. O exame microscpico permite constatar uma
quantidade anormal de gordura nas fezes, possivelmente relacionada com esteatorria da
insuficincia pancretica ou com transtornos da absoro.
As gorduras neutras apresentam-se sob a frmula de pequenas gotculas, muito refringentes e
fracamente coradas pela bile.

REATIVO DE HECHT:
Soluo aquosa vermelho neutro........................................................................................1 parte
Soluo aquosa verde brilhante..........................................................................................1 parte
Preparar no momento do uso.
-cidos graxos coram-se de vermelho, e sabes ficam esverdeados.

REATIVO DE LORISH Azul do Nilo
Sulfato de azul do Nilo.................................................................................................................1g
gua destilada......................................................................................................................100mL
-cidos graxos coram-se de azul, e sabes de cinza azulado.

REATIVO DE SAATHOFF Sudan III
Sudan III.......................................................................................................................................2g
lcool 96.................................................................................................................................10mL
cido actico glacial...............................................................................................................90mL
-cidos graxos se coram de vermelho. normal ser encontrado 2 ou 3 gotas de gordura por
campo microscpico.





COPROTEST (Mtodo comercial de concentrao)
Material:
1. Frasco Coprotest com fixador de escolha.
2. Tubos de centrfuga, cnicos de 15mL graduados.
3. Funil pequeno.
4. Gazes.
5. Swab de algodo.
6. Lmina e lamnula.
7. Pipetas 10mL
8. Estante ou suporte para tubos.
9. ter ou acetato de etila.
10. Soluo de Lugol 1%.
11. Centrfuga.
O Coprotest atualmente comercializado no Brasil e pode ser adquirido apenas o frasco
coletor com ou sem fixador de escolha do laboratrio ou todos os dispositivos e reagentes
para execuo do procedimento. O basto coletor tem capacidade para 1g, e essa quantidade
interpretada como suficiente. As etapas a serem seguidas para a coleta da amostra de fezes,
como preconizadas, so transcritas a seguir:
1. Abra o frasco e retire a tampa com o basto coletor.
2. Com auxlio de uma pazinha de madeira, preencha o basto coletor com as fezes.
3. No coloque fezes em excesso: use a pazinha para eliminar o excesso de fezes.
4. Feche o frasco.
5. Agite vigorosamente por 1 a 2 minutos, at dissolver as fezes no lquido.
6. Volte ao frasco para a embalagem. Leve ao laboratrio.



Procedimento:
1. Agitar um pouco o frasco para homogeneizar.
2. Destaque o bico da tampa.
3. Introduza o bico em um tubo de centrfuga e pressione o frasco.
4. Acrescente uma gota de detergente domstico a suspenso.
5. Adicione 3mL de Acetato de Etila comercial.
6. Tampe os tubos de centrfuga e agite vigorosamente.
7. Centrifugue a 2000 rpm durante 2 minutos.
8. Despreze a camada sobrenadante.
9. Adicione o sedimento em 7mL de gua, tampe os tubos e agite.
10. Centrifugue a 2000 rpm por 2 minutos.
11. Despreze o sobrenadante com cuidado.
12. Deixe os tubos emborcados sobre gaze, durante 2 minutos.
13. Adicione soluo de Lugol (3 vezes o volume do sedimento).
14. Adicione ao sedimento, batendo nas paredes do tubo.
15. Inverta o tubo sobre uma lmina e deposite uma gota do sedimento.
16. Cubra o sedimento com lamnula.
Examine ao microscpio sistematicamente aumento de 100X.