BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO BACTERIOLOGA III
GUIA DE LABORATORIO No 3 AGENTES ANTIMICROBIANOS
Introduccin Los agentes antimicrobianos son medicamentos que inhiben el crecimiento o desarrollo de un microorganismo, estos pueden controlar procesos infecciosos de etiologa bacteriana entre otras. Son substancias qumicas naturales, (sintetizadas por hongos o bacterias) sintticas o semisintticas que son capaces de inhibir el desarrollo o de destruir los microorganismos patgenos infectantes. Los antibiticos son agentes antimicrobianos de uso sistmico que pueden reducir y controlar la presencia de microorganismos contaminantes del husped y son administrados por ingestin oral, uso tpico: absorbidos por la piel o inyectados. Su efecto sobre el agente infeccioso puede ser como: Bacteriosttico: impide el desarrollo del germen sin causar su destruccin, pueden multiplicarse nuevamente al desaparecer el agente. Bactericida: producen la destruccin de los microorganismos mediante cuatro mecanismos: Inhibicin de la pared celular (peniclinas, aminopenicilinas, carboxipenicilinas, cefalosporinas, B-lactmicos, carbapenemes.) Alteracin de la permeabilidad celular (Polimixinas, Imidazoles, y polienos.) Inhibicin de la sntesis de protenas ( Tetraciclinas, macrlidos, aminoglucsidos, anfenicoles, lincosamidas, ) Inhibicin de la sntesis de los cidos nucleicos (sulfonamidas, quinolonas, diaminopirimidinas, ansamicinas). PRUEBAS DE SUCEPTIBILIDAD MICROBIANA Es llamado antibiograma el ensayo In Vitro realizado a una bacteria ya identificada frente a una serie de antibiticos o quimioteraputicos para observar la sensibilidad o resistencia que presenta a dichos agentes. La prctica del antibiograma tiene como fin, ayudar al clnico en el control del control del proceso infeccioso del paciente mediante la utilizacin racional de los antimicrobianos. El uso de esta tcnica se hace mas necesario cada da debido a la mayor resistencia que estn presentando las bacterias, especialmente los bacilos gram negativos, a los diferentes antibiticos y a la aparicin en el mercado de nuevos agentes quimioteraputicos. Los resultados pueden variar ampliamente segn las tcnicas empleadas razn por la cual es necesario aplicar tcnicas estandarizadas y suficientemente ensayadas que permiten garantizar resultados reproducibles. La susceptibilidad a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias se estudia por el mtodo de susceptibilidad por categoras de Thornsberry. Los principales mtodos usados hoy en da por el laboratorio para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un antibitico incluyen los mtodos de dilucin en caldo, dilucin en placa de agar y mtodos de difusin en agar utilizando discos de papel impregnados de antibiticos.
METODO DE DIFUSION EN AGAR (KIRBY BAUER) Es un mtodo fcil, econmico y reproducible bajo condiciones estandarizadas. Consiste en sembrar en forma masiva el inoculo en un medio solido en caja. Colocarle discos de papel impregnados con antibiticos de concentraciones conocidas, incubar y medir las zonas de inhibicin del crecimiento alrededor del disco. Discos antimicrobianos: para la seleccin adecuada de los antibiticos se debe tener en cuenta: el microorganismo a probar, localizacin de la infeccin y de ser posible las condiciones de salud del paciente. Los sensidiscos se conservan en frascos pequeos bien tapados y con desecante, guardados a refrigeracin a 4 C. los discos para ser usados se sacaran 1-2 horas antes para que alcance la temperatura ambiente. Microorganismos Grampositivos
Microorganismos Gramnegativos
Penicilina G Clindamicina Tetraciclina Eritromicina Vancomicina Ampicilina Cefalospirina
Objetivos Realizar la tcnica de antibiograma propuesta por Kirby Bauer. Conocer el concepto de microorganismos resistentes, intermedios o sensibles. Identificar los principales grupos de antimicrobianos disponibles y su mecanismo de accin. Entender el fundamento del antibiograma, el modo en que se debe realizar y las principales fuentes de error. Materiales Asas de argolla. Estudiante Sensidiscos de antimicrobianos para gran negativos y gran positivos Escobillones estriles Solucin salina fisiolgica estril Cultivo de bacterias Mechero Laminas y laminillas. Estudiante Agar Mller Hinton Escala de Mac Farland (TUBO 0.5) Pinzas Incubadora Regleta. Estudiante PROCEDIMIENTO METODO DE DIFUSION EN AGAR Seleccin del medio de cultivo: El medio considerado como ideal es agar de Muller Hinton, porque ofrece buen crecimiento uniforme y es bajo en inhibidores para tetraciclinas y sulfonamidas. Para organismos ms exigentes puede agregrsele sangre de cordero. PREPARACION DEL INOCULO Con un asa de argolla se toman algunas colonias de un cultivo puro y se inoculan 5 ml de solucin salina estril. La cantidad de colonias a tomar son las necesarias para conseguir una turbidez equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mac Farland. INOCULACION DE LAS CAJAS Debe realizarse dentro de los 15 min siguientes a la preparacin del inoculo, utilizando un aplicador (escobilln) estril. Sumerja el aplicador en la suspensin bacteriana y homogenice. Presione el aplicador firmemente contra las paredes del tubo, para eliminar el exceso suspensin. Esparza el inoculo de forma masiva sobre la superficie del agar en tres direcciones (siembra en rejilla) y al final pase el aplicador alrededor del borde del borde del medio de cultivo para asegurar que la bacteria utilizada crezca masivamente en toda la superficie del medio.
APLICACIN DE LOS SENSIDISCOS Permita que el inoculo se seque por 3 5 min, antes de colocar los sensidiscos. Coloque los sensidiscos con ayuda de una pinza estril haciendo presin para asegurar el completo contacto con el agar. La distancia del disco al borde de la caja debe ser de mnimo 12 mm y la distancia entre discos de 24mm, una vez colocados los sensidiscos no se deben remover, debido que una vez el sensidisco toca el agar difunde el antibitico. Incubar inmediatamente a 35 C por 24 a 48 horas en la atmosfera apropiada.
LECTURA DE RESULTADOS Hacer la lectura de los halos de inhibicin del microorganismo alrededor de cada disco midiendo este con una reglilla. Anote los resultados en mm e interprete la sensibilidad o resistencia de acuerdo a la tabla (Anexo 1). El tamao de la zona de inhibicin depende de la capacidad de difusin del antibitico, de las condiciones de la prueba y la sensibilidad propia de la cepa.
PRELABORATORIO 1. Cul es la importancia clnica de realizar un antibiograma. 2. Cul es el mecanismo de resistencia ms frecuente frente a betalactmicos. Explique cmo hara para determinar la resistencia los betalactmicos en el laboratorio. 3. Cuales antibitico son bactericidas y cuales bacteriostticos, que diferencia existe entre ello? 4. Que otras tcnicas o mtodos existen para la determinacin de sensibilidad antimicrobiana? 5. Que son las normas CLSI? 6. Investigue que es la prueba o test D para Gram positivos y cmo se realiza. 7. Cmo se realiza la deteccin de resistencia a oxacilina en Staphylococos?
POSLABORATORIO 1. Reporte los resultados del antibiograma, compare los antibiticos de mayor sensibilidad y resistencia microbiana, segn el microorganismo estudiado.
BIBLIOGRAFIA SANCHEZ, Mara Piedad; GUZMAN, Miguel A. Manual de procedimientos en Bacteriologa Clnica, 5 Edicin, Santaf de Bogot 1998. JAWETZ, E. Microbiologa medica. Editorial manual moderno. 17 edicin. Mxico 2002. DELGADO, Alberto; manual de laboratorio Clnico bsico. Editorial MacGraw Hill. Santaf de Bogot, Mxico 2000 LABLINSAN. disponible online en: http://www.lablinsan.cl/index_files/Page886.htm