2.4.

La evaluacin sensorial
Las muestras tratadas con enzimas proteolticas se almacenaron en una cmara
frigorfica durante 3 das y se sometieron a una evaluacin sensorial. Cada lado de
las muestras se cort en trozos pequeos (20 x 20 x 20 mm) y fueron asados a la
parrilla a 200 C durante 30 s. Los miembros del panel (11 participantes) fueron
estudiantes y personal de la Universidad de Niigata, pero no estaban entrenados
en el anlisis sensorial de carne. Se les pidi a los miembros del panel que
rellenen un cuestionario, el cual contena seis preguntas, de apariencia, el
ablandamiento, jugosidad, la amargura, el aroma y el sabor. Cada rasgo excepto la
amargura se puntu en una escala de 7 puntos de -3 a +3: muy pobre, bastante
pobre, un poco pobre, media, un poco buena, bastante buena, y excelente. En el
caso de amargura, una escala de 7 puntos de -3 a +3 significa un aumento de la
amargura. En esta prueba, los resultados se evaluaron en comparacin con la
muestra de control. Normal (0 puntos) significa el puntaje evaluado para la muestra
sin tratar (control).

2.5. Preparacin de las miofibrillas y el ndice de fragmentacin
Las miofibrillas se extrajeron de cada msculo de acuerdo con los procedimientos
descritos por Busch, Stromer, Goll y Suzuki (1972). El msculo triturado se
suspendi en 6 volmenes (w / v) de 50 mM de tampn Tris-HCl (pH 7,6) que
contiene KCl 100 mM y EDTA 5 mM usando un mezclador Waring durante 15 s.
Las miofibrillas se sedimentan en 1000 g durante 10 min y se suspendieron de
nuevo en 5 volmenes del mismo tampn usando un mezclador Waring durante 10
s. Las miofibrillas resuspendidas se sedimentan a 1000 g durante 10 min, y el
proceso de resuspensin - sedimentacin se repiti tres veces ms. Despus del
quinto lavado, las miofibrillas en suspensin en el mismo tampn se pasaron a
travs de una malla de red de nylon 20 para eliminar el tejido conectivo. Las
miofibrillas tensas se sedimentan a 1000 g durante 10 min, se lavaron tres veces
en 1,000 mM KCl y finalmente se suspendieron en 100 mM KCl y 1 mM de NaN3.
Despus de ajustar la concentracin de protenas a 0,5
mg / ml de KCl 100 mM, la turbidez en 540 nm de la solucin se midi como ndice
de fragmentacin (Moller, Vestergaard y Wismer-Pedersen, 1973) por un
Espectrofotmetro U-2000 de Hitachi (Hitachi Co. Ltd., Tokio).

2.6. SDS-PAGE
Las miofibrillas se sedimentan por centrifugacin a 5000 g durante 10 min, y se
solubilizan en tampn de sodio fosfato 0.01 M (pH 7,0) que contena 5% de SDS y
1% de 2-mercaptoetanol en agua hirviendo durante 2 min, con posterior
centrifugacin a 10.000 g durante 15 min. El sobrenadante transparente se analiz
por SDS-PAGE, que se realiz de acuerdo con el procedimiento descrito por
Laemmli (1970) con una ligera modificacin. La electroforesis se llev a cabo en
7,5% de poliacrilamida [bisacrilamida / acrilamida, 01:20 (w/w) de gel de losa
(70x90x1 mm) que contiene 0.1% de SDS a corriente constante de 20 mA durante
1,5 h, y luego los geles se tieron con Coomassie Brilliant Blue R-250. Los perfiles
SDS-PAGE de las miofibrillas se escanearon densitomtricamente con una Toyo
DMU-33C Digital Densitorol (Toyo Kagaku Sangyo, Tokio) con un filtro de 610 nm.

2.7. Estudios Electro Microscpicos
Despus de la centrifugacin de 4000 g durante 10 min, las miofibrillas se fijaron
durante la evaluacin de transmisin electromicroscopica (TEM) de examen. La
examinacin de la TEM fue llevado a cabo por el procedimiento de Suzuki, Saito,
Sato, y Nonami (1978). Las muestras para la exploracin electromicrogrfica
(EEM) de tejido conectivo intramuscular se prepararon por el mtodo de la
maceracin de la clula de Ohtani, Ushiki, Taguchi y Kikuta (1988). Brevemente,
los pedazos pequeos (5x5x5mm) del control o los msculos tratados con enzimas
fueron fijados en glutaraldehido al 2,5% en tampn fosfato al 0,1 M, pH 7,0 durante
1 da. Las piezas se sumergieron en 10% de NaOH durante 7 das, la solucin de
NaOH fue reemplazada cada da por una nueva solucin y luego se enjuaga en
agua destilada durante 5 das a temperatura ambiente. A continuacin, las piezas
se pusieron en cido tnico al 1% durante 3 horas, se enjuagaron en agua
destilada durante varias horas, y despus fueron fijadas en un tampn fosfato de
tetraxido de Osmio al 0,1 con PH igual a 7,0 durante 1 hora. Las muestras se
deshidrataron a travs de etanol, por congelacin fracturada con una cuchilla de
afeitar en nitrgeno lquido, y se secaron por el mtodo de liofilizacin de alcohol
de t-butilo (Inoue y Osatake, 1988). Las muestras secas se cubrieron con oro y se
examinaron utilizando un SEM ABT-55 (Akashi haz Tecnologa Co., Tokio) con un
voltaje de aceleracin de 10 kV.

2.8. Concentracin de las protenas
La concentracin de las protenas se midi mediante el mtodo de biuret
estandarizado frente a albmina cristalina de suero de bovino (Gornall, Bardawill, &
David, 1949).

3. Resultados y discusiones

3.1 Deshidratacin y absorcin de la solucin enzimtica
La relacin de absorcin de la solucin enzimtica [absorcin de la solucin
enzimtica (ml) / agua eliminada en la deshidratacin (ml) x 100] se muestra en la
Tabla 1. Como se muestra en la tabla, la relacin de absorcin fue de alrededor de
78% del agua extrada en la deshidratacin. Las diferencias entre relacin de
absorcin no se observaron entre las soluciones enzimticas. La eficiencia de
penetracin de la solucin enzimtica despus de la deshidratacin por contacto
osmtico de la carne parece ser suficiente.La relacin de absorcin aument casi
linealmente con el aumento de la inmersin de tiempo de hasta 3 h, despus se
aument gradualmente y alcanz aproximadamente el 90% a las 5 h de inmersin,
pero el desvanecimiento de color de la carne debido a la liberacin de la
mioglobina en la solucin enzimtica aument notablemente durante 3 h de
inmersin (datos no mostrados). Por lo tanto, 3 h de inmersin fue el tiempo
elegido en este experimento.

3.2. Medicin de la textura
Los cambios en la dureza relativa de la carne tratada con enzima que se expresan
en un porcentaje de la muestra de control (la carne no tratada) almacenada
durante 24 horas se muestran en la Figura 1. Se observ la disminucin de la
dureza relativa durante el almacenamiento, independientemente con tratamiento
enzimtico o no. Sin embargo, ocurri ms rpidamente y completamente en la
carne tratada con enzimas. Entre las enzimas ensayadas en este experimento la
actividad de ablandamiento de la carne de la papana era la mejor y no se observ
diferencias en la actividad entre las proteinasas de A. sojae y
A. oryzae.