PRODUCCIN DE BLASTOCISTOS PRODUCIDOS IN VITRO-DA-2 EMBRIONES BOVINOS

CLASIFICADO POR LA HENDIDURA ESCENARIO Y CITOGENTICOS EVALUACIN DE LA DA-8

RESULTANTE BLASTOCISTOS
Carlos Manuel ULLOA ULLOA1,2), Midori YOSHIZAWA1,2), Akira YAMASHITA2), Satoshi HAMA2),
Akinori MITSUI1,2), Chaomulige HASHI2), Hiroyuki ABE3), Hiroyoshi HOSHI4), Emiko FUKUI1,2) y
Hiromichi MATSUMOTO1,2)
1) Estados Escuela Superior de Agricultura de la Universidad de Tokio de Agricultura y Tecnologa,
Tokio desde 183 hasta 8059, 2) de la Facultad de Agricultura, Universidad de Utsunomiya,
Utsunomiya 321-8505, 3) de la Universidad de Tohoku, Investigacin en Ingeniera Biomdica
Organizacin (TUBERO), Sendai 980-8575 y 4) Instituto de Investigacin de los pptidos
funcionales, Yamagata 990-0.823, Japn
Resumen.
El presente estudio se realiz para determinar los criterios para la seleccin de embriones de
buena calidad en el Da-2 postinseminacin y en la etapa de blastocisto. Ovocitos bovinos fueron
madurados, fertilizados y cultivados in vitro. En primer lugar, el Da-2 embriones se clasificaron
basndose en el nmero de blastmeros en 2-clula, de 3 a 4 clulas, de 5 a 8 clulas y> etapa de
8 clulas embriones; a continuacin, se prepararon muestras de cromosomas. En el segundo
experimento, los dia-2 embriones clasificados de acuerdo se cultivaron para el nmero de
blastmeros por separado para un adicional de 6 das (da 8). La resultante Day-8 blastocistos de
cada grupo de Day-2 embriones se clasificaron en los siguientes 3 grados sobre la base de la
morfologa y dimetro: Grado A, tramado y eclosin blastocistos; Grado B, blastocistos
expandidos; y Grado C, blastocistos no expandidas. A continuacin, se prepararon muestras
cromosoma. La etapa de 5 a 8 clulas Day-2 embriones tena la menor incidencia de anomalas
cromosmicas (13,5%, P <0,05) y la tasa ms alta de desarrollo de blastocistos (59,2%, P <0,05).
Adems, los blastocistos derivados de los 5 a 8 clulas etapa de embriones tenan el nmero
medio de clulas ms grande (102,8 42.4, P <0,05), mayor nmero de metafases por blastocisto
(9,5 4,8, P <0,05) y una menor incidencia de cromosmica anomalas (24,6%, P <0,05). Los
blastocistos grado A tuvieron el mayor nmero medio de clulas (136,6 33,4, p <0,05), un gran
nmero de metafases por blastocisto (11,9 5,5, P <0,05) y una baja incidencia de anomalas
cromosmicas graves (17,3%). Los resultados mostraron que, en el Da 2, los de 5 a 8 clulas etapa
de embriones eran de mejor calidad ya que tenan la ms baja incidencia de anomalas
cromosmicas y la tasa ms alta de blastocisto y los blastocistos resultantes tuvo el mayor nmero
de clulas y menor incidencia de anomalas cromosmicas. En particular, la seleccin de los
blastocistos grado A puede mejorar la tasa de desarrollo a trmino.
Palabras clave: blastocistos, de bovino, anomala cromosmica, Embrin, produccin in vitro (PIV)
desde Hanada et al. [1] logrado obtener terneros de en fertilizacin in vitro (IVF) de ovocitos que
haban sido madurado en -producidos in vitro vitro, grandes avances se han hecho en trminos de
en (IVP), los embriones de la especie bovina. Sin embargo, los embriones de bovino IVP todava
tienen un bajo ndice de desarrollo a la fase de blastocisto y una menor viabilidad a plazo en
comparacin con los embriones recolectados in vivo en [2]. Aunque sin duda hay mltiples causas
para el fracaso en el desarrollo de embriones producidos in vitro, anomalas cromosmicas
parecen ser la causa principal del desarrollo del embrin pobres [3]. Una alta incidencia de
anomalas cromosmicas, mixoploidia y poliploida, se ha relacionado con una alta frecuencia de la
polispermia en embriones producidos in vitro [4-6]. En el ganado vacuno, una alta incidencia de
cromosmica anomalas se han reportado en los embriones producidos in vitro [7 9] en
comparacin con los embriones producidos in vivo en [9, 10]. Del mismo modo, anlisis
citogentico de los blastocistos porcinos producidos in vitro tiene revel que aproximadamente el
40% de ellos son anormales [11], y la incidencia de anomalas es superior a la reportada en el
vivoderived embriones (7,3%) [12]. Los embriones con anomalas cromosmicas puede dar lugar a
fallos en la reproduccin que se manifiesta por detencin en el desarrollo embrionario o la muerte
embrionaria temprana [13] y aborto [14, 15].
Debido a la baja calidad de citogenticamente embriones producidos in vitro, la competencia de
desarrollo de los embriones hasta el parto debe ser cuidadosamente evaluada desde las primeras
etapas para seleccionar la ms alta embriones de calidad para una transferencia exitosa.
Evaluacin de la calidad de preimplantacin de embriones en base a criterios morfolgicos tiene
sido utilizado en algunas especies, como el ganado [16, 17] y los seres humanos [18, 19].
Embriones de bovino que escinden ms rpido a la etapa de 2 clulas despus de visualizacin de
la inseminacin significativamente mayores tasas de blastocisto que embriones que escinden ms
lentamente [20-22]. Adems, ha sido reportado en cerdos que el nmero de blastmeros
presentes en el Da 2 despus de la inseminacin est vinculada a la viabilidad del embrin y el
cromosoma anomalas [23]. En el hmster, la capacidad de los blastocistos que llegar a la etapa de
8 clulas dentro de un marco de tiempo normal es significativamente ms altos que los
blastocistos que alcanzan otras etapas en el mismo tiempo estructura [24]. En comparacin con
escindido moderadamente, humana Da-3 FIV embriones, embriones de cmara lenta y de rpida
escisin tienen menor blastocisto las tasas de formacin [25] y una mayor incidencia de
cromosmica anomalas [26]. Morfolgicamente excelente bovina IVP blastocistos muestran un
menor nmero de ncleos poliploides en comparacin con los blastocistos con buena o mala
morfologa, y morfolgicamente normales embriones contienen un mayor nmero de clulas y se
desarrollan ms rpidamente que morfolgicamente embriones inferior [27].
Aunque se realizaron los estudios para identificar las buenas embriones de calidad producidos in
vitro, todava no hay suficientes datos, especialmente en las primeras etapas, para permitir la
seleccin de la mejor calidad embriones para la transferencia. Con el fin de permitir la seleccin de
la mejor blastocistos de calidad para la transferencia de embriones con xito, el presente estudio
se realiz para examinar la incidencia de anomalas cromosmicas en escisin temprana (da 2)
embriones bovinos, para evaluar la competencia de desarrollo a la fase de blastocisto y examinar
la incidencia de anomalas cromosmicas en los blastocistos resultantes. Adems, la incidencia de
anomalas cromosmicas en Blastocistos IVP bovinos seleccionados por su etapa de desarrollo y
tambin se determin la morfologa.
Materiales y mtodos
La produccin in vitro (PIV) de embriones bovinos
El sistema de produccin en vitro (en la maduracin y fertilizacin in vitro de ovocitos y cultivo in
vitro de embriones) se realiz bsicamente de acuerdo con el mtodo descrito previamente por
Yoshizawa et al. [28]. Brevemente, los ovarios bovinos se obtuvieron a Otawara matadero
(Otawara, Japn) y llevado a nuestro laboratorio en solucin salina estril de NaCl al 0,85%
despus de un bovino Encefalitis Espongiforme (BSE) examen (aproximadamente 4 horas). El
ovocitos se obtuvieron de 3 a 6 folculos mm de dimetro. Desde estos ovocitos, que fueron
fuertemente rodeados por clulas del cumulus fueron seleccionado y madurado por co-cultivo con
clulas del cumulus a 38.5 C en aire que contiene 2% de CO2 durante 20-22 h de acuerdo con el
mtodo de Goto et al. [29]. Los ovocitos madurados fueron trasladados en un suspensin- medio
que contiene espermatozoides congelados-descongelados (ajustado a una concentracin de 5-7 x
105 espermatozoides / ml) de un toro que tena recibido tratamiento para la capacitacin con la
cafena y la heparina mediante el mtodo de Niwa y Ohgoda [30]. Despus de 5 h de la
inseminacin, todos los oocitos se lavaron con medio de cultivo y co-cultivadas de nuevo con
clulas cmulo a 38,5 C en el aire que contienen 2% de CO2. El da de la inseminacin se defini
como Da 0 En el Da 2 (48 h despus de inseminacin), los embriones escindidos se clasifican en
funcin de su escisin etapas en cuatro grupos: 2 en clulas, embriones de escisin lentas; 3 a 4-
clula, moderadamente lenta escindir embriones; De 5 a 8 clulas, moderadamente escindiendo
rpido embriones; y> 8 celdas, escindiendo rpido embriones. Los embriones fueron entonces
separado co-cultivadas con clulas del cumulus en medio TCM-199 durante otros 6 das a
blastocisto etapa.
Preparacin de los cromosomas
Preparacin de los cromosomas se realiz en un alto grado de humedad habitacin de acuerdo
con el mtodo de Yoshizawa et al. [28]. brevemente, los embriones se colocaron en una solucin
hipotnica 0,4 ml de 1% (w / v) citrato de sodio para 13-15 min y se fija a continuacin,
ligeramente por vertiendo aproximadamente 0,02 ml de alcohol actico (una parte de cido
actico: una parte metanol) en la solucin hipotnica. Despus de unos pocos minutos, cada uno
embrin se asign de forma individual en un portaobjetos de vidrio limpio. para separar los
blastmeros de los embriones en el estadio de blastocisto, una gota de cido actico fue colocado
en los embriones. Por ltimo, la cromosomas embriones 'se extendieron y se fijaron con varias
gotas de fijador de alcohol actico (una parte de cido actico: tres partes de metanol). Las
muestras de cromosomas fueron secadas con aire y se tieron con 2% de Giemsa (Merck,
Darmstadt, Alemania) solucin durante 10 min.
criterios citogenticos
El nmero total de clulas con ncleos, metafases analizables Se examinaron los cromosomas
(intactos y que no se superponen) y bajo un microscopio de contraste de fase (Olympus, Tokio,
Japn) a una magnificacin de 600 (40 15) o 900 (60 15). los embriones que tiene una o
ms metafases analizables fueron juzgadas como analizable embriones. El ndice mittico se
determin como la relacin de el nmero de placas de metafase para el nmero total de clulas. El
embriones que tenan dos juegos de cromosomas (2n = 60) en todo el contable metafases fueron
definidos como diploides normales, y aquellos en los que todos metafases analizables (ncleos)
contena un conjunto de cromosomas (n = 30) fueron definidos como haploides. Los embriones
que contienen ms de dos juegos de cromosomas en todos los ncleos contables fueron juzgados
comopoliploides (3n, 4n, 5n, etc), y aquellos con una mezcla de diploide clulas y haploides (n /
2n), triploide (2n / 3n), tetraploides (2n / 4n) u otros clulas ploid se definieron como mixoploids.
Diseo experimental
Experimento 1: Incidencia de anomalas cromosmicas en Day- 2 embriones bovinos clasifican de
acuerdo a la etapa de escisin (nmero de blastmeros): En el Da 2 (48 h despus de la
inseminacin), todos embriones escindidos se clasificaron en 4 grupos segn el nmero de
blastmeras: 2 clulas, embriones de escisin lentos; De 3 a 4 clulas, moderadamente ralentizar
la escisin de embriones; De 5 a 8 clulas, escisin moderadamente rpido embriones; y> 8 celdas,
escindiendo rpido embriones. Los embriones fueron tratados durante 17 h con 100 ng / ml de
vinblastina (Wako Pure Chemical, Osaka, Japn), que es un inhibidor de la mitosis [28], y luego Se
prepararon muestras de cromosomas.
Experimento 2: Las tasas de desarrollo de blastocistos de Day- 2 embriones y el nmero de clulas
y la incidencia de los cromosomas anomalas en los blastocistos resultantes: Experimento 1 mostr
que un bajo porcentaje de embriones tuvo metafases. Este bajo porcentaje se debi al hecho de
que se incluyeron embriones degenerados en el anlisis. Por lo tanto, en el experimento 2, la
normalmente troceados embriones que no se degeneran, los que tenan aproximadamente el
mismo nmero de blastmeros y embriones que no tenan muy citoplasma oscuro se separ de
los otros embriones escindidos. Los embriones normalmente escindidos se clasifican segn el
nmero de blastmeros en los 4 grupos descritos anteriormente. Los embriones fueron entonces
por separado co-cultivadas con clulas del cumulus en TCM-199 medio durante otros 6 das a la
etapa de blastocisto. la resultante Day-8 blastocistos se clasificaron en los siguientes tres grados
basados en el grado de desarrollo de los embriones y morfolgica Dimetro: Grado A, blastocistos
en el nacimiento o eclosin etapa; Grado B, blastocistos en la etapa de expansin; y Grado C, en la
etapa de blastocistos no expandido. Los blastocistos fueron cultivadas durante 17 h en medio que
contiene sulfato de vinblastina 100 ng / ml (Wako), que es un inhibidor mittico, y luego muestras
de cromosomas se prepararon.
El anlisis estadstico
Se utiliz el test de chi-cuadrado para evaluar las diferencias en la incidencia de anomalas
cromosmicas entre 5 a 8 clulas embriones y otros grupos de embriones en el da 2. diferencias
estadsticas entre los blastocistos clasifican en 3 grupos y el tasas de desarrollo de blastocistos
derivados de los distintos cellstage embriones fueron evaluados por ANOVA de una va. el
promedio nmero de clulas por blastocisto datos se evaluaron utilizando el Prueba de Kruskal-
Wallis y la prueba de comparaciones mltiples de Dunn. Un valor de P <0,05 fue considerado
estadsticamente significativo.
Resultados
Experimento 1: Incidencia de anomalas cromosmicas en Day- 2 embriones bovinos clasifican de
acuerdo a las etapas de escisin (el nmero de blastmeros) De los 817 troceados, embriones Da-
2 despus de la inseminacin, el 5 a Embriones en estadio de 8 clulas fueron observadas con
mayor frecuencia (51,9%, 424/817; Tabla 1). Aunque slo el 52,1% (426/817) de la Da-2
embriones tenan uno o ms blastmeros en metafase, la mayora de los embriones con
blastmeras metafase podran ser con xito analizado (367/426, 86,2%). Las altas tasas de xito de
los cromosomas anlisis mostr que los datos eran altamente fiable. El tasa global de diploides
normales fue de 77,4% (284/367), es decir, el conjunto incidencia de anomalas cromosmicas fue
de 22,6%. haploidy (Fig. 1a), poliploida y mixoploidia (Fig. 1b) se encontraron en todos los grupos
de embriones. Los embriones en la etapa de 5 a 8 clulas (86,5%) eran el ms normal de todo el
grupo de embriones, es decir, cuando la incidencia de anomalas cromosmicas de la etapa de 5 a
8 clulas embriones (13,5%) se compar con la de las otras etapas de embriones, su tasa fue
significativamente menor que la de 2-clula (36,7%), de 3 a 4 clulas (23,9%) y> embriones en
estadio de 8 clulas (43,9%).
Experimento 2: Las tasas de desarrollo de blastocistos de Day-2 embriones, el nmero de clulas y
la incidencia de los cromosomas anomalas en los blastocistos resultantes Del total de 956
ovocitos utilizados para la FIV, 758 ovocitos (79,3%) escindida en el da 2 despus de la
inseminacin, 129 (17,0%) y degener 629 (83,0%) fueron normales. La tasa de desarrollo a
blastocisto etapa en el da 8 fue 46.9% (295/629) para el normalmente troceados embriones.
En el Da 8, el nmero de Day-2 de 5 a 8 clulas etapa de embriones quedesarrollado hasta la
etapa de blastocisto fue significativamente ms grandes que los del-Da 2 de 2 clulas, 3-4 celular
y> embriones en estadio de 8 clulas (Tabla 2). El 5 a embriones en estadio de 8 clulas tuvo la
tasa ms alta de blastocisto (59,2%) en comparacin con la clula 2 (26,7%), de 3-4 clulas (37,8%)
y > 8 celdas (35,4%) etapa de embriones. Los blastocistos derivados de la 5 a embriones en estadio
de 8 clulas tenan la capacidad mxima eclosin; su tasa de desarrollo en blastocistos
eclosionados o para incubar (Grado A, 29.0%) fue significativamente mayor que los de la 2-clula
(0,0%), 3 de 4 celdas (6,5%) y> embriones en estadio de 8 clulas (2,9%; todos P <0,05). en
Por otra parte, muchos de los blastocistos deriva de la 2-clula, 3 de 4 celdas y> 8 clulas etapa de
embriones estaban en el escenario sin expandir (Grado C).
Un total de 295 Da-8 blastocistos bovinos estaban preparados para cromosmica se prepararon
16, 62, 183 y 34 blastocistos: anlisis a partir de la clula 2, de 3 a 4 clulas, de 5 a 8-clula y
clula-> 8 embriones en etapa, respectivamente (Tabla 3). Un gran nmero de blastocistos
prepar como se muestras cromosmicas tenan uno o ms blastmeras metafase (237/295,
80,3%); los blastocistos derivados de la 5 a 8 clulas etapa de embriones tenan un porcentaje
especialmente elevado de metafase blastmeros (86,9%, 159/183, P <0,05) en comparacin con
los de la 2-clula y> 8 clulas etapa de embriones, 56.2 (9.16) y 61,8% (21/34), respectivamente.
Casi todos los embriones se analizaron con xito para normalidades cromosmicas, y el porcentaje
de xito analizado embriones fue 89,3% (142/159) en los blastocistos deriva a partir de los
embriones en la etapa de 5 a 8 clulas, que fue significativamente mayor que los de blastocistos
derivados de 2-clula y> 8 clulas embriones. Los blastocistos derivados de la etapa de 5 a 8
clulas embriones tena el nmero medio ms grande de clulas por blastocisto (102,8 42,4, p
<0,05); el nmero global de clulas por blastocisto fue 93,6 42.4. Adems, los blastocistos
derivados de la 5 a 8 clulas etapa de embriones tenan el mayor nmero de blastmeros
metafase por blastocisto (P <0,05), aunque no hubo diferencias en el ndices mittico entre los
grupos.
La incidencia global de anomalas cromosmicas fue 34,6% porque la normalidad cromosmica fue
65.4% (Tabla 4). Los blastocistos derivados de los 5 a 8 clulas etapa de embriones tenan el ms
alto normalidad (75,4%) y menor incidencia de anomalas cromosmicas (24,6%) en comparacin
con los derivados de 2-clulas (85,7%), De 3 a 4 celdas (45,2%) y> 8 clulas etapa embriones
(70,6%, P <0,05). Haploidy, poliploida (3n triploida; 4n tetraploida, y otros) y mixoploidia (n / 2n,
2n / 3n, 2n / 4n y otros) se encontraron en todos los grupos, pero haploidy no se observ en los
blastocistos derivados de> 8 clulas etapa de embriones. La incidencia de la poliploida en el
blastocistos derivados de la etapa de embriones de 5 a 8 de clulas fue significativamente (P
<0,05) menores que las de los blastocistos derivados de la 3 de 4 celdas y> 8 clulas etapa de
embriones.
En la clasificacin morfolgica de 295 embriones, 58 embriones fueron clasificado en el grado A,
110 se clasificaron en grado B y 127 se clasificaron en Grado C (Tabla 5). Casi todos los blastocistos
grado A tenido blastmeras metafase (56/58), y la tasa de xito de anlisis cromosmico fue
mayor (89,7%, 52/58) que en el otro grupos. Los blastocistos Grado C tuvieron la metafase ms
bajo Frecuencia y el porcentaje ms bajo de los embriones analizados (P <0,05). Por otra parte, los
blastocistos grado A tuvieron significativamente ms clulas (136,6 33,4) que el Grado B (99,1
25,6) y Grado C (66,1 19,1), mientras que los blastocistos blastocistos Grado C tenan la ms
pequea nmero de clulas (todas: p <0,05). Los blastocistos grado A tuvieron una mayor nmero
de blastmeros metafase por blastocisto (11.9 5.5) que los blastocistos Grado C (6.1 5.1, p
<0.05), aunque no haba diferencia significativa en el ndice mittico entre los grupos. Los
blastocistos Grado A y B tenan normalidades significativamente ms altos (82,7 y 70,4%,
respectivamente) y una menor incidencia de anomalas cromosmicas (17,3 y 29,6%,
respectivamente) que los blastocistos Grado C (52,0%, P <0,05, Tabla 6). haploide y blastocistos
poliploides, que no eran capaces de vivir a trmino la entrega, no se observaron en los blastocistos
de Grado A, pero poliploida se encontr en los blastocistos Grado B, y ambos haploides y
poliploida se observaron en los blastocistos Grado C. Sin embargo, mixoploidia se observ en
todos los 3 grupos. Por otra parte, el grado C blastocistos tuvieron la mayor incidencia de
poliploida (26,7%, P <0,05). Con respecto a la relacin entre las anomalas cromosmicas y el
nmero de clulas en blastocistos, se encontr que blastocistos diploides normales tenan
significativamente ms clulas (102,4 41.0) de blastocistos anormales (mixoploidia, poliploida y
haploides; P <0,05, Figura 2). Adems, entre la anormal blastocistos, mixoploidia tiene ms clulas
(78,5 37,5) que los poliploides (40,8 12,2, p <0,05).
Discusin
En el presente estudio, la incidencia de anomalas cromosmicas observado en Da-2 embriones
(22,6%) fue ligeramente inferior la incidencia reportada en 2 Day-embriones bovinos producidos
por IVP (26.8 [10] y 36,3% [3]), mientras que una baja incidencia de cromosmica anormalidades
se observ en 2 Day-embriones bovinos producidos en vivo (7,1% [8]). En los dia-2 embriones del
presente estudio, la incidencia de anomalas cromosmicas fue significativamente menor en los
embriones en la etapa de 5 a 8 de clulas que en los otros embriones en etapa. Este sugiere que
los embriones de bovino de buena calidad, a juzgar por una baja incidencia de anomalas
cromosmicas, se puede seleccionar en el Da 2. Magli et al. [26] observaron resultados similares
en Da-3 humana escindidas embriones, en el que la incidencia de anomalas cromosmicas fue
significativamente menor en embriones en estadio de 7-8 clulas que en el slowcleaving
embriones (4) de clulas, embriones moderadamente lenta de escisin (5- 6 celdas) y embriones
muy rpidos de escisin (9 de clulas). En el presente estudio, una alta incidencia de haploidy
(10,1%) se encontr en el Day- 2 embriones, que representaron cerca de la mitad de todas las
anomalas; un alta incidencia similar de clulas haploidy y haploides en mixoploide embriones de
la especie bovina en la fase 5 a 10 clulas se inform por Yoshizawa et al. [31]. Iwasaki y Hamano
[32] inform de la aparicin de clulas haploides que llevan el cromosoma Y en 6, 8, 11 y 13 de
clulas etapa IVF derivados de embriones bovinos; especularon que esto fue causado por la
detencin de la formacin de proncleo femenino despus la penetracin de los espermatozoides
de cromosoma Y-rodamiento, seguido de desarrollo andrognico en los cigotos. Adems, Kola et
al. [33] observaron patrones de escisin alterados en humanos tripronuclear ovocitos con
poliespermia y posteriormente encontrado blastmeras haploidy en los embriones resultantes. En
el presente estudio, andrognica el desarrollo en cigotos de fecundacin in vitro, tal como se
describe por Iwasaki y Hamano [32], y la divisin de escisin anormal en cigotos poliesprmicos,
como propuesto por Navara et al. [34], puede haber sido la causa del desarrollo de embriones
haploides o clulas haploides en la mixoploide embriones. Cuando los dia-2 embriones se
cultivaron hasta la etapa de blastocisto, los embriones en la etapa de 5 a 8 clulas tuvieron la ms
alta tasa de blastocisto. en nuestro informe anterior, el medio escinde (de 3 a 4 celdas y de 5 a 8
celdas embriones) Etapa Day-2 embriones de cerdo tuvieron una mayor tasa de blastocisto que la
etapa Day-2 lento y rpido troceados embriones de cerdo [23]. Alikani et al. [25] observaron
resultados similares con en humanos Day-3 embriones derivados in vitro-, en el que lento (<7
clulas) y rpidos (> 8 clulas) embriones escisin tuvieron una negativa efecto sobre la formacin
normal de blastocisto. McKiernan y Bavister [24] Asimismo, inform que los embriones de hmster
in vitro-cultivadas que escindido lentamente (<4 clulas) tenan menos probabilidades de alcanzar
el blastocisto etapa de embriones que alcanzaron el estadio de 8 clulas dentro de una normalidad
periodo de tiempo. Mateusen et al. [35] mostr que, en embriones de cerdo, fragmentacin
inferior o igual a 15% del volumen del embrin tiene una significativamente impacto negativo
sobre el desarrollo embrionario. En el presente estudiar, el pequeo nmero de ncleos presentes
en> estadio de 8 clulas Day-2 embriones pueden reflejar una alta frecuencia de fragmentacin,
que es considerada como una causa de una tasa de formacin de blastocistos baja. Adems, >
Etapa de 8 celdas Day-2 embriones pueden ser los productos de divisin de la segmentacin
anormal (3 o ms clulas) causado por la polispermia en la divisin de primera divisin [36]. En el
presente estudio, una significativa gran nmero de blastocistos deriva de la etapa 5-8 de clulas
embriones comenzaron a salir del cascarn antes que los blastocistos derivados de otros
embriones en la etapa, lo que sugiere que los blastocistos derivados de los embriones en estadio
de 5-8 clulas eran de mejor calidad que los derivados de las otras etapas. El nmero medio de
clulas por blastocisto en el presente estudio fue similar a la reportada previamente por
Yoshizawa et al. [28]; sin embargo, los blastocistos derivados de la etapa de 5 a 8 clulasembriones
tuvo significativamente ms clulas que las derivadas de la otros embriones. Este resultado no
est de acuerdo con nuestra prediccin que los blastocistos derivados de la fase de> 8 celdas Day-
2 embriones tener ms clulas que las derivadas de la etapa de 5 a 8 clulas embriones; esto
indica que la capacidad de dividirse a> etapa de 8 clulas disminuyeron despus de blastocistos
embriones Da 2. derivados de porcinos embriones en la etapa media (de 3 a 4-clula y de 5 a 8 de
clulas de embriones etapa) tener ms clulas que las derivadas de otros embriones en fase [23].
Los resultados del presente estudio, en el que tram la eclosin o blastocistos tenan ms clulas
que los blastocistos expandidos o no expandidos,estn de acuerdo con el informe de Jakobsen et
al. [27], en que los blastocistos bovinos nacidos mostraron un desarrollo rpido y tenan ms
clulas que los blastocistos no expandidas. Tambin ha sido inform que el momento de
formacin de blastocistos se correlaciona con la nmero total de clulas [37]. Los resultados en el
presente estudio fueron similares a los reportados por Jakobsen et al. [27], que mostr que
incubar y blastocistos eclosionados fueron mejores embriones de calidad que otros blastocistos.
Adems, los blastocistos desarrollados a partir de 5 a 8 embriones en estadio de clula tambin se
evaluaron como embriones de alta calidad porque contenan ms clulas en la fase de blastocisto.
Del mismo modo, los blastocistos clasificados como grado A tambin eran de buena calidad
porque contenan blastmeras ms metafase compararon con otros embriones de grado, aunque
el mismo tratamiento vinblastina regmenes se utilizan en ellos.
En el presente estudio, la incidencia total de anomalas cromosmicas en los blastocistos bovinos
Da-8 fue de 34,6%. Sin embargo, la anomalas cromosmicas observadas en la etapa de
blastocisto fueron principalmente poliploida y mixoploidia, con una pequea cantidad de
haploidy, aunque haploidy era muy frecuente en el Da 2 Este resultado sugiere que casi todos los
embriones haploides arrestados antes de que el blastocisto etapa, mientras que los embriones
poliploides y mixoploides continuaron desarrollar la fase de blastocisto. En contraste con nuestros
resultados, Viuff et al. [10] inform de ningn poliploida en bovinos Da 5-embriones producidos
por IVP; llegaron a la conclusin que los embriones de poliploida aparentemente detenidos
durante el tercer ciclo de la clula, mientras que los embriones mixoploidesseguido desarrollando.
Sin embargo, en embriones de cerdo derivadas de IVP, haploidy y poliploida han sido reportados
en la etapa de blastocisto [11, 23]. Se ha sugerido que la alta incidencia de la poliploida y
mixoploidia durante la fertilizacin in vitro en ratones [4, 6], ganado [5] y porcina [11, 23] son
causados por poliespermia. la poliploida y mixoploidia observada en el presente estudio tambin
puede ser el resultado de la polispermia. Sin embargo, King et al. [38] observ que mixoploide
embriones tambin podran surgir a travs de fusin de blastmeros. En el presente estudio, la
clasificacin de Day-2 embriones fue eficaz para la seleccin de embriones cromosmicamente
normales; es decir, la seleccin de 5 a embriones en estadio de 8 clulas que se desarrollan en
blastocistos con un baja incidencia de anomalas cromosmicas. Sin embargo, en nuestro estudio
previo se trata de la especie porcina, Day-6 blastocistos deriva De 3 a 4-clula y de 5 a 8 clulas
etapa Day-2 embriones tenan una menor incidencia de anomalas cromosmicas que otros grupos
de blastocisto [23]. Con respecto a la relacin entre la incidencia de anormalidades cromosmicas
y la etapa de escisin en porcino y embriones bovinos de IVP, parece que el Da-2 porcino
embriones en las etapas intermedias (de 3 a 4 celdas y de 5 a 8 clulas embriones) produce
blastocitos que tiene una baja incidencia de cromosmica anomalas, mientras que los embriones
de 5 a 8 clulas etapa bovinos tienen la menor incidencia de anomalas cromosmicas. esto puede
reflejan que la velocidad del desarrollo in vitro de embriones porcinos es ms lenta que la de
embriones bovinos. Hemos encontrado que hay una diferencia en la velocidad de desarrollo de
embriones PIV entre ganado vacuno y porcino, en que los embriones de porcinos desarrollan ms
lentamente que embriones de ganado (datos no publicados). Entre los blastocistos graduadas por
la morfologa, grado A y B blastocistos tuvieron una incidencia significativamente menor de
cromosmica anomalas que Grado C blastocistos. Es probable que la etapa del desarrollo del
embrin en un momento dado y la morfologa embrionaria estn relacionados con la incidencia de
anomalas cromosmicas. Esta relacin entre el tiempo de desarrollo y la incidencia de anomalas
cromosmicas no se observ por Jakobsen et al. [27]; no encontraron ninguna diferencia
significativa en los cromosomas anomalas entre rayada, expandida y no expandida FIV-produjo
blastocistos bovinos. Por otra parte, otra que mixoploidia, no informaron la presencia de
poliploida y haploidy. Sin embargo, en el presente estudio, los blastocistos Grado A y B tuvieron
una incidencia significativamente menor de poliploida que el Blastocistos Grado C. Se observaron
Unos haploides en el grado C blastocistos, lo que sugiere que los embriones haploides son
arrestados en una anterior etapa. Por otra parte, slo hubo una baja incidencia de mixoploidia en
los blastocistos de grado A, lo que demuestra su excelente calidad. Puede ser que la causa de la
diferencia entre el resultados de Jakobsen et al. [27] y el nuestro es que analizaron el cromosoma
anomalas por hibridacin fluorescente in situ utilizando diferencialmente etiquetados sondas
para los cromosomas 6 y 7; nosotros observado todos los cromosomas en los embriones
directamente. La poliploida es un anomala cromosmica grave, y los embriones poliploides
tienen ha encontrado que tienen un nmero significativamente menor de clulas, como se
muestra en el presente estudio (40,8 12,2, Fig. 2) y en otros informes [3, 11, 23]. Por lo tanto, la
poliploida puede ser perjudicial para el desarrollo del embrin, aunque los embriones de bovino
mixoploides que tienen un bajo frecuencia de clulas anormales podra desarrollar a trmino [27].
Por lo tanto, mediante la seleccin de los blastocistos de Grado A, tasas de desarrollo a plazo se
puede mejorar. En conclusin, el presente estudio demostr que el Da-8 bovino blastocistos
derivados de 5 a etapa de 8 clulas Day-2 embriones son de calidad superior basado en la
incidencia de anomalas cromosmicas, capacidad para desarrollar y nmero de clulas. Adems,
entre los blastocistos clasificados por etapa de desarrollo del embrin y la morfologa, los
blastocistos Grado A fueron de la ms alta calidad, ya que tenan el mayor nmero de clulas y la
menor incidencia de anomalas cromosmicas. Basndose en los resultados de la presente
estudiar, la seleccin de la etapa de 5 a 8 clulas Day-2 embriones puede reducir la frecuencia de
embriones cromosmicamente anormales y resultado en buena blastocistos de calidad, y la
seleccin de los blastocistos resultantes de grado A puede disminuir la prdida econmica que se
produce debido a la mortalidad embrionaria cuando los embriones se transfieren a los
destinatarios.