Ministrio da

Educao
Apresentao da obra
A Microbiologia um ramo da Cincia Biolgica responsvel por estudar e caracterizar o
mundo microbiano. A disciplina Microbiologia pretende introduzir o aluno nos fundamentos
dessa cincia, alm de familiariz-lo e trein-lo na manipulao dos microrganismos. Esta obra
apresenta duas etapas: uma composta por textos, que relatam a importncia da Microbiologia,
o seu avano e as contribuies marcantes na rea nos ltimos sculos, uma breve
caracterizao dos dois principais grupos microbianos (bactrias e fungos) e, em uma segunda
etapa, uma descrio de aulas prticas bsicas de Microbiologia para reforar o processo de
aprendizagem dos alunos e, ao mesmo tempo, de formato bastante simples, facilitando o
preparo de materiais e a adequao s condies laboratoriais disponveis, na maioria das
vezes, com limitaes importantes.
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EDILSA ROSA DA SILVA
Doutora em Cincia de
Alimentos pela Universidade
Estadual de Campinas,
Mestre em Engenharia de
Alimentos pela Universidade
Estadual de Campinas e
Graduada em Economia
Domstica pela Universidade
Federal de Viosa. Possui
experincia profissional, em
Instituies de Ensino e
Pesquisa, como a
Universidade Tecnolgica
Federal do Paran, Instituto
Paulista de Educao e
Universidade Estadual de
Campinas, principalmente na
rea de ensino do cultivo e
manipulao de
microrganismos em
Laboratrios de
Microbiologia. Atualmente
docente no Instituto Federal
de Educao, Cincia e
Tecnologia de Braslia,
atuando tambm como
pesquisadora na rea de
Microbiologia Bsica e
Aplicada ao controle de
qualidade higinico-sanitria
de alimentos, biodegradao
de resduos
ligninocelulsicos,
monitoramento
microbiolgico sistemas de
tratamento biolgico de
resduos e isolamento de
bactrias e fungos de
amostras ambientais.
Edilsa Rosa da Silva
Aparecida Snia de Souza
INTRODUO AO ESTUDO
DA MICROBIOLOGIA:
TEORIA E PRTICA
Autoras: Edilsa Rosa da Silva e
Aparecida Snia de Souza
APARECIDA SNIA DE
SOUZA Doutora e Mestre
em Nutrio Experimental e
Aplicada Tecnologia de
Alimentos pela
Universidade Estadual de
Campinas. Especialista em
Sade Pblica pela
Secretaria da Sade de So
Paulo e Graduada em
Engenharia de Alimentos
pela Universidade Federal
de Viosa. Possui
experincia profissional na
Indstria de Alimentos, na
rea de controle de
qualidade de produtos
crneos e em Laboratrio
de Controle de Qualidade
de Alimentos. Atualmente
Assistente Pesquisa do
Centro de Cincia e
Qualidade de Alimentos do
Instituto de Tecnologia de
Alimentos (ITAL) em
Campinas, SP e, desenvolve
pesquisa na rea de Cincia
e Tecnologia de Alimentos,
com nfase em Nutrio
Aplicada Tecnologia de
Alimentos, atuando
principalmente nos
seguintes temas:
hidrolisados proticos,
hidrlise enzimtica,
isolado protico de soja,
peptdeos e irradiaco gama
e funcionalidade de
alimentos.
O presente trabalho tem
como objetivo disponibilizar
aos estudantes de cursos
tcnicos e superiores dos
Institutos Federais que tm,
em sua grade curricular,
componentes curriculares
relacionados
Microbiologia, um material
introdutrio ao estudo dessa
cincia, visando contribuir
para a aquisio de
conhecimentos tericos e
prticos bsicos nessa rea.
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Introduo
ao Estudo da
Microbiologia:
Teoria e Prtica
Edilsa Rosa da Silva
Aparecida Snia de Souza
EDITORA IFB
BrasliaDF
2013
REITOR
Wilson Conciani
PR-REITORIA DE PESQUISA E INOVAO
Luciana Miyoko Massukado
PR-REITORIA DE ENSINO
Adilson Cesar de Araujo
PR-REITORIA DE EXTENSO
Giano Luiz Copetti
PR-REITORIA DE DESENVOLVIMENTO INSTITUCIONAL
Rosane Cavalcante de Souza
PR-REITORIA DE ADMINISTRAO
Simone Cardoso dos Santos Penteado
Introduo
ao Estudo da
Microbiologia:
Teoria e Prtica
Edilsa Rosa da Silva
Aparecida Snia de Souza
EDITORA IFB
BrasliaDF
2013
EDITORA
2013 EDITORA IFB
Todos os direitos desta edio reservados Editora IFB.
Nenhuma parte desta publicao poder ser reproduzida ou transmitida de qualquer modo ou por qualquer meio, eletrnico ou
mecnico, incluindo fotocpia, gravao ou qualque tipo de sistema de armazenamento e transmisso de informao, sem prvia
autorizao, por escrito, da Editora do IFB.
SGAN 610, Mdulos D, E, F e G
CEP 70860-100 - Braslia -DF
Fone: +55 (61) 2103-2108
www.ifb.edu.br
E-mail: editora@ifb.edu.br
Conselho Editorial
Coordenao de Publicaes
Produo executiva
Tiragem
Carlos Cristiano Oliveira de Faria Almeida
Cristiane Herres Terraza
Francisco Nunes dos Reis Jnior
Gabriel Andrade Lima de Almeida
Gustavo Ablio Galeno Arnt
Juliana Rocha de Faria Silva
Katia Guimares Sousa Palomo
Luciano Pereira da Silva
S586i Silva, Edilsa Rosa da
Introduo ao estudo da microbiologia: teoria e prtica/ Edilsa Rosa da
Silva, Aparecida Snia de Souza. _ Braslia : Editora do IFB, 2013.
66 p. : il. ; 23 cm.
ISBN 978-85-64124-22-6
1. Microbiologia. 2. Microorganismos. 3. Fungos. 4. Bactrias. 5. Biossegurana.
I. Souza, Aparecida Snia de. II. Ttulo.


CDU 579
fcha catalogrfca elaborada pela bibliotecria
Lara Batista Botelho CRB - 2434
Luiz Diogo de Vasconcelos Junior
Marco Antonio Vezzani
Reinaldo de Jesus da Costa Farias
Renato Simes Moreira
Richard Wilson Borrozine de Siqueira
Tatiana de Macedo Soares Rotolo
Vanessa de Assis Araujo
Vinicius Machado dos Santos
Juliana Rocha de Faria Silva
Sandra Maria Branchine
1.000 exemplares
AGRADECIMENTOS
Este trabalho no tem a pretenso de ser completo, mas objetiva fornecer
informaes bsicas de Microbiologia para os estudantes de cursos tcnicos e
superior, em seu primeiro contato com essa cincia. Por isso, primeiramente
agradecemos aos nossos alunos que, ao longo do tempo, nos motivaram a
desenvolver este trabalho, com seus comentrios, dvidas e sugestes.
Os temas desenvolvidos neste manual, no decorrer desses anos,
receberam a contribuio de pessoas iluminadas ligadas rea de
Microbiologia e afns. Somos profundamente gratas a essas pessoas.
Agradecemos especialmente aos professores Maria Cristina Dantas
Vanetti, da Universidade Federal de Viosa, e Lcia Regina Durrant, Hlia
Harumi Sato, Glaucia Maria Pastore e Yong Kun Park, da Universidade
Estadual de Campinas.
Agradecimentos muito especiais a Maria Helena Martini, do Instituto
Adolfo Lutz, Campinas, pela partilha, apoio e ensinamentos.
Especiais agradecimentos a todos os professores e servidores tcnicos
do Departamento de Qumica e Biologia e do Departamento de Fsica da
Universidade Tecnolgica Federal do Paran, pela colaborao, partilha,
apoio e ensinamentos. Especial agradecimento a professora Marlene Soares
pelos ensinamentos e valiosa contribuio.
Agradecemos muitssimo a colaborao, apoio e companhia dos
professores e tcnicos do Ncleo da Agroindstria, Agropecuria e
Agroecologia do Instituto Federal de Braslia, Campus Planaltina.
Agradecemos tambm Editora do IFB pelo incentivo e oportunidade
de realizar a publicao deste material didtico.
Finalmente, gostaramos de agradecer aos nossos familiares, amigos e
ao Senhor Deus pela companhia e amor incondicional.
APRESENTAO
O estudo da Microbiologia torna o aluno consciente e capaz de
reconhecer os organismos que fazem parte do mundo microbiano.
Os principais microrganismos estudados pela Microbiologia so as
bactrias, os fungos, as algas microscpicas, os protozorios e os vrus.
Alm desses grupos, a Microbiologia pode abordar tambm o estudo de
alguns parasitas e vermes, como o grupo dos helmintos.
Os microrganismos esto presentes em todos os aspectos da vida humana.
Desde o incio de nossa vida ps-uterina, a colonizao do corpo humano
por determinados grupos microbianos (principalmente bactrias dos gneros
Lactobacillus, Bacterides, Biffdobacterium, Escherichia coli, Staphylococcus,
Streptococcus e fungos e leveduras dos gneros Cndida e Pityrosporium).
Muitos microrganismos, normalmente inofensivos vivem na superfcie
e no interior do corpo humano. O grupo de microrganismos que vivem
normalmente no corpo humano, sem produzir sintomas caractersticos de
uma doena denominado de microbiota normal ou fora normal do corpo
humano. Alguns microrganismos so chamados de microbiota transitria,
pois no residem permanentemente, podem fcar no corpo por dias,
semanas ou meses, mas tendem a desaparecer.
Alguns dos microrganismos que habitam o corpo humano so
denominados patgenos oportunistas, porque normalmente no causam
doenas em uma pessoa saudvel, entretanto, em condies ambientais
diferentes, como baixa imunidade do hospedeiro, o patgeno pode se
desenvolver alm do normal e causar os sintomas de uma doena caracterstica.
A maioria dos microrganismos desempenha um papel fundamental no
equilbrio da vida no nosso planeta: constituem a base da cadeia alimentar nos
ambientes marinhos, os microrganismos do solo auxiliam na decomposio
da matria orgnica e na reciclagem de elementos essenciais para a vida,
como no ciclo do carbono, nitrognio, enxofre, fsforo entre outros.
Ao longo dos anos, a Microbiologia desenvolveu pesquisas bsicas
e aplicadas voltadas para o estudo do potencial biotecnolgico dos
microrganismos. Esses estudos mostraram uma vasta capacidade de
aplicao destes organismos: produo microbiana de cidos orgnicos,
enzimas, steres, lcoois, antibiticos e muitas outras substncias;
desenvolvimento de muitos alimentos a partir do cultivo de microrganismos
sobre diferentes substratos; utilizao de microrganismos no tratamento de
resduos lquidos e slidos, biorremediao de ambientes contaminados
por substncias txicas e recalcitrantes so alguns dos benefcios que estes
organismos trazem para o nosso dia-dia.
O conhecimento sobre o mundo microbiano deve considerar tambm
uma pequena parcela de microrganismos, denominados patognicos, que
so aqueles organismos capazes de provocar uma doena com sintomas
caractersticos. Ao longo dos sculos, milhares de pessoas morreram por
causas de epidemias causadas por microrganismos desconhecidos na
poca, ou por falta de vacinas e antibiticos ainda no disponveis para
combater as enfermidades.
A elevada capacidade de biodegradao de alguns microrganismos,
tambm apresenta aspectos negativos, quando provoca a deteriorao de
alimentos e outros materiais utilizados pelos seres humanos, provocando
grandes perdas e prejuzos scio-econmicos.
Finalmente, devemos considerar que os microrganismos esto
presentes em todos os ambientes habitados ou no por outros organismos
e que todo conhecimento a respeito desses seres vivos, nos tornar mais
capacitados e efcientes no estabelecimento de uma relao equilibrada e
saudvel com os mesmos.
SUMRIO
AGRADECIMENTOS .......................................................................5
APRESENTAO .............................................................................7
PARTE 1
INTRODUO MICROBIOLOGIA
O MUNDO DOS MICRORGANISMOS ............................................. 13
AS FERRAMENTAS DA MICROBIOLOGIA ......................................... 18
CARACTERIZAO DE BACTRIAS E FUNGOS ................................ 21
BACTRIAS ........................................................................................ 22
FUNGOS ........................................................................................... 25
PARTE 2
INTRODUO A MICROBIOLOGIA PRTICA
SEGURANA EM MICROBIOLOGIA ................................................. 33
NORMAS BSICAS DE BIOSSEGURANA EM LABORATRIO ........ 34
CONTROLE DE MICRORGANISMOS ................................................ 36
AULA PRTICA 1 - ISOLAMENTO DE BACTRIAS TOTAIS PRESENTES
NAS DIGITAIS DAS MOS ................................................................ 38
AULA PRTICA 2 - ISOLAMENTO E QUANTIFICAO DE
MICRORGANISMOS A PARTIR DE AMOSTRA AMBIENTAL OU DE
ALIMENTOS ...................................................................................... 40
AULA PRTICA 3- MONITORAMENTO MICROBIOLGICO DE
AMBIENTES ....................................................................................... 43
AULA PRTICA 4 - ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE FUNGOS
FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ........................................................ 47
AULA PRTICA 5 - TCNICAS DE PREPARAO DE LMINAS PARA
COLORAO ................................................................................... 53
REFERNCIAS ...............................................................................59
ANEXO 1 MICROSCOPIA DE BACTRIAS ............................................ 61
ANEXO 2 MICROSCOPIA DE FUNGOS ............................................... 63
PARTE 1
Introduo
Microbiologia
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O MUNDO DOS MICRORGANISMOS
Afnal, o que Microbiologia?
Quais so as reas de abrangncia?
Qual a importncia no seu curso?
A Microbiologia uma cincia derivada da Biologia que vem se
desenvolvendo nos ltimos sculos devido a contribuio de inmeros
personagens, profssionais, estudiosos ou simplesmente pessoas curiosas
e dedicadas a conhecer um mundo aparentemente invisvel. O principal
objetivo da Microbiologia estudar todos os aspectos que envolvem o
mundo microbiano, constitudo pelas bactrias, fungos (flamentosos,
bolores, mofos e leveduras), protozorios, vrus e algas microscpicas.
Ao longo da evoluo humana, fcou cada vez mais claro o papel
desempenhado pelos microrganismos no estabelecimento dos seres
vivos no planeta Terra: so responsveis por alteraes climticas que
possibilitaram o desenvolvimento de formas de vidas mais complexas
e diversas. Alm disso, sabe-se que os microrganismos so os grandes
recicladores de matria orgnica, sendo responsveis pela ciclagem de
elementos vitais para os seres vivos, como o N, S, P, Fe, entre outros.
Com o desenvolvimento da Microbiologia, fcou estabelecido que
aproximadamente 99% dos microrganismos desempenham um
papel benfco ou incuo para a vida dos seres vivos no planeta,
entretanto, em torno de 1% so considerados patognicos ou com
potencial para provocar as mais diversas doenas. Para a histria
humana, isso representou a morte de milhes de pessoas ao longo
dos sculos devido a doenas provocadas por Microrganismos, como
a peste negra, febres tifides, gripe espanhola, clera, sndrome HIV,
toxiinfeces diversas e generalizadas, entre outros.
Devido ao fato de Microbiologia se dedicar ao estudo de microrganismos
que ocupam os mais diferentes ambientes, desenvolvendo as mais diversas
atividades, essa tornou-se uma cincia com atuao em muitas reas:
14
Microbiologia Ambiental;
Microbiologia de Alimentos;
Microbiologia Veterinria;
Microbiologia Agrcola;
Microbiologia Mdica e Sanitria;
Microbiologia Industrial;
Fisiologia e Gentica Microbianas:
entre outros.
A disciplina Microbiologia deve fornecer informaes e instrumentos
pertinentes para o estudante, contribuindo, assim, com a sua formao
tcnica. Deve indicar os microrganismos que desempenham papel
fundamental no meio ambiente, na produo e na deteriorao de
alimentos, entre outras aplicaes, as formas de control-los, alm de
caracterizar o potencial dos microrganismos em todos os aspectos da
vida humana.
Qual a importncia e aplicao do estudo dos microrganismos no seu curso?
HISTRIA DA Microbiologia, ALGUNS MARCOS:
1686 Anton Van Leeuwenhoek: arteso e comerciante holands
descreveu organismos microscpicos, presentes nos mais diferentes
materiais (gua da chuva, saliva, placa microbiana dos dentes, alimentos)
com grandes detalhes. Usou lentes com aumento de at 300x. Encaminhava
os seus registros para a Sociedade Real de Londres.
Teoria da Gerao Espontnea ou Abiognese:
Foi aceita at a 2 metade do sculo XIX. Isso representou grande entrave
para o desenvolvimento e reconhecimento da Microbiologia como
cincia.
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1858 Rudolf Virchow, Louis Pasteur e John Tyndall, e outros estudiosos
europeus desenvolveram experimentos que fnalmente terminaram
com os debates sobre gerao espontnea.
Desenvolvimento da teoria de doenas causadas por microrganismos:
Experimentos realizados por Pasteur e outros estudiosos, no sculo
XIX, resultaram em muitos avanos para a Microbiologia:
1. o conceito de que a vida deveria surgir de vida pr-existente
(Biognese);
2. as tcnicas de esterilizao (Tyndalltindalizao, esterilizao
fracionada) e pasteurizao (Pasteur, 63 C/30min);
3. o conhecimento do processo biolgico da fermentao (Pasteur);
4. o desenvolvimento da teoria das doenas causadas por germes
(Pasteur e Robert Koch) e;
5. o desenvolvimento de vacinas a partir do bacilo do carbnculo
(Bacillus anthracis) morto e do vrus da raiva (Pasteur) atenuado ou
enfraquecido.
6. o desenvolvimento dos mtodos de isolamento de microrganismos
e cultivo na forma de cultura pura em meio nutritivo (Pasteur, Koch,
Julius Petri e Frau Hesse);
7. o estabelecimento de um procedimento cientfco para provar a
teoria das doenas causadas por germes, conhecido como postulados
de Koch:
o mesmo patgeno deve estar presente em todos os casos da doena;
o patgeno deve ser isolado do hospedeiro doente e crescer em
cultura pura;
o patgeno da cultura pura deve causar a doena quando inoculado
em um animal de laboratrio saudvel e susceptvel;
16
o patgeno deve ser isolado do animal inoculado e preciso
demonstrar que ele o organismo original;
os postulados de Koch apresentam algumas excees. Quais
seriam elas?
Algumas outras contribuies para a Microbiologia:
1796 Edward Jenner, mdico britnico, iniciou um experimento
com ordenhadeiras de vacas para encontrar uma maneira de proteger
as pessoas da varola, processo que fcou conhecido como vacinao;
1835 Agostino Bassi, microscopista amador, provou que uma
doena do bicho da seda era provocada por fungos;
1840 O mdico hngaro Ignaz Semmelweis alertava que mdicos
que no desinfetavam as mos, costumeiramente transmitiam
infeces de uma paciente para outra;
1860 Joseph Lister, cirurgio ingls, aplicou a teoria do germe
para procedimentos mdicos e comeou a indicar o uso de fenol
(cido carblico) em soluo para tratar ferimentos cirrgicos, o que
reduziu drasticamente as infeces e mortes no ambiente hospitalar;
1865 Pasteur, descobriu uma outra doena do bicho da seda
provocada por um protozorio e desenvolveu um mtodo de
identifcao das larvas do bicho da seda contaminadas;
1866 Ernst Haeckel, classifcou os seres vivos em animais,
vegetais e protistas (seres unicelulares);
1882-1883 Robert Koch descobriu o causador da tuberculose, a
bactria Mycobacterium tuberculosis e isolou o Vibrio cholerae de
pacientes com clera;
1892 Sergei Winogradsky isolou e estudou as bactrias do ciclo
do enxofre;
1910 Carlos Chagas, mdico brasileiro, isolou e caracterizou o
protozorio Trypanossoma cruzi, responsvel pela doena de chagas;
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1928 Alexander Fleming e colaboradores (Chain e Florey)
descobriram e produziram o antibitico penicilina, sintetizado
pelo fungo Penicillium notatum;
1969 Robert Whittaker criou o sistema de cinco reinos (plantae,
animalia, protista, fungi e monera para as bactrias), com base em
anlises da morfologia da clula e na forma de nutrio dos seres vivos;
1978 Carl Woese e colaboradores, com base na anlise do RNA
ribossomal de diferentes clulas, propuseram o estabelecimento
da classifcao dos seres vivos em trs domnios: Eucaria,
Eubacteria e Archaea (tambm denominada at recentemente de
arqueobactrias).
Existem muitos outros estudiosos que ao longo dos anos e at
hoje, desenvolvem pesquisas e trabalhos que contribuem para o
desenvolvimento contnuo da Microbiologia como cincia. Voc
deve pesquisar e ler mais sobre isso!
Teoria endossimbitica explicando a evoluo das clulas
eucariticas:
A Teoria endossimbitica foi popularizada por Lynn Margulis em seu livro
Symbiosis in Cell Evolution (BLACK, 2002; PELCZAR et al., 1996).
Segundo essa teoria, clulas bacterianas maiores perderam a sua parede
celular e engoliram clulas bacterianas menores, caracterizando uma
relao de endossimbiose.
O eucarioto ancestral desenvolveu um ncleo rudimentar quando a
membrana plasmtica se dobrou em volta do cromossomo e essa clula
provavelmente ingeriu bactrias aerbias ou bactrias fotossintticas,
que recebia nutrientes e em troca produzia energia (mitocndrias e
cloroplastos).
Os fagelos e os clios eucariotos provavelmente se originaram de
associaes simbiticas entre a membrana plasmtica dos primeiros
eucariotos e bactrias espirais, chamadas de espiroquetas.
18
AS FERRAMENTAS DA Microbiologia
Microscopia tica
Como o estudo da Microbiologia tem como alvo os organismos
extremamente reduzidos, que s podem ser visualizados com auxlio
de lentes potentes, o avano dessa cincia esteve sempre associado
ao desenvolvimento de melhores microscpicos, que permitiriam uma
observao mais detalhada desses minsculos organismos.
Os microrganismos e seus componentes estruturais so extremamente
pequenos e medidos atravs do sistema mtrico. A unidade padro do
sistema mtrico o metro (m). As unidades usadas para microrganismos
so o micrmetro (mm) e o nanmetro (nm). (Tabela 1)
Tabela 1. Equivalncia entre os nmeros e as unidades mtricas de medidas.
centmetros milmetros micrmetros nanmetros
Um metro
contm
100 1.000 1.000.000 1.000.000.000
Um
centmetro
contm
1 10 10.000 10.000.000
Um
milmetro
contem
1 1.000 1.000.000
Um
micrometro
contm
1 1.000
Um
nanmetro
contm
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Fonte: Burton e Engelkirk, 1998.
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A microscopia ptica (campo claro) se refere ao uso de qualquer tipo
de microscpio (Figura 1) que use luz para observar amostras.
Microscpio ptico
Figura 01. Microscpio ptico composto. (fgura disponvel no Manual de
Instrues do Microscpico Olympus).
1. Fonte luminosa
2. Base
3. Interruptor de controle de voltagem
4. Platina
5. Condensador
6 e 7. Parafuso macro e micromtrico
8. Pinas
9. Tubo ou canho
10. Objetivas
11. Revlver
12. Oculares
13. Brao
O microscpio ptico, comumente chamado composto, apresenta
dois sistemas de lentes para a ampliao da imagem: a lente da ocular e a
lente da objetiva.
A ampliao total do microscpio produto das ampliaes por cada
sistema de lentes individualmente e esse amplia o objeto at certo limite
(1000 a 1600X).
Tal limitao devido ao poder de resoluo do sistema ptico, que
numericamente a menor distncia com a qual dois pontos podem ser vistos
separadamente. Ademais representa a capacidade das lentes de diferenciar
detalhes fnos e estruturas.
O poder de resoluo do olho humano de aproximadamente 0,2 mm.
O poder de resoluo de um microscpio composto de aproximadamente
0,2 mm, quando usada a lente de imerso na mxima abertura numrica.
20
Poder de resoluo (PR) a medida do menor objeto que pode ser
visto ao microscpio. funo do comprimento de onda luminosa () e da
abertura numrica (AN) da objetiva:
PR= /AN
A Tabela 2 registra as principais caractersticas das objetivas de um
microscpio ptico.
Para se obter uma imagem clara e detalhada em um microscpio
ptico, as amostras devem ter um alto contraste com o seu meio (a substncia
pela qual a luz passa). Para isso diferenciado o ndice de refrao (medida
da capacidade de curvatura da luz do meio) das amostras. Uma forma de
diferenciar ou alterar esse ndice corar o material a ser visualizado.
Os raios de luz no microscpio ptico que percorrero a amostra e o
meio a serem analisados no devem ser perdidos. Para preservar a direo
desses raios na pequena objetiva de maior ampliao, colocado leo de
imerso entre a lmina de vidro e a lente objetiva (100x, de imerso). O leo
de imerso tem o mesmo ndice de refrao que o vidro e, assim, torna-se parte
da ptica do vidro do microscpio. O leo tem o mesmo efeito que o aumento
do dimetro da objetiva, melhorando a potncia de resoluo das lentes.
Tabela 2: Principais caractersticas das objetivas do microscpio ptico
Fonte: Soares et al. (1986).
Ampliao linear da objetiva
Caractersticas 10X
3
40-45X
4
90-100X
5
Distncia focal
aproximada (mm)
1
16 4 1,8
Dimetro aproximado
do campo (mm)
1,5 0,34 0,15
Abertura numrica 0,25 0,65 1,25
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Distncia da operao
aproximada (mm)
2
4,50 0,65 0,13
Poder de resoluo
(=500nm) (m)
2,0 0,7 0,4
Mxima ampliao
aproximada obtida
com a ocular 10X
100X 450X 1000X
1
Distncia focal a distncia do centro da lente da objetiva ao foco, dada em mm.
2
Distncia da operao a distncia entre a parte externa da lente da objetiva e o objeto, quando em
foco, dada em mm.
3
A objetiva de ampliao linear 10X denominada objetiva a seco de pequeno aumento.
4
A objetiva de ampliao linear 40-45X denominada objetiva a seco de grande aumento.
5
A objetiva de ampliao linear 100X denominada de imerso.
Outros microscpios pticos so construdos e ajustados para
tcnicas em campo escuro, microscpio de fase contraste e microscpio
de fuorescncia.
Outros tipos de microscopia so representados pelos microscpios
eletrnicos, que usam feixes de eltrons como fonte de iluminao em vez
de luz visvel e tambm usam magnetos no lugar de lentes para focar o feixe.
So utilizados dois tipos: microscopia eletrnico de transmisso (excelente
resoluo, aumento mdio de at 200.000X) e microscopia eletrnica de
varredura (aumento mdio de 10.000X).
CARACTERIZAO DE BACTRIAS E FUNGOS
Ao iniciar o processo de aprendizagem na Microbiologia, o estudante
levado a conhecer primeiramente dois grupos microbianos bsicos: as
bactrias (constitudas por clulas procariotas) e os fungos (constitudos por
clulas eucariotas). Posteriormente, ele orientado a conhecer tambm os
protozorios (clula eucariota), as algas microscpicas (clula eucariota) e
os vrus (parasitas intracelulares obrigatrios, considerados seres acelulares).
22
BACTRIAS
As bactrias so constitudas por clulas procariotas (Figura 2),
consideradas um tipo de clula morfologicamente simples, mas com
metabolismo (conjunto de reaes que ocorrem no interior das clulas)
to verstil e complexo como uma clula eucariota. As bactrias so
heterotrfcas e autotrfcas (cianobactrias).
Figura 2. Esquema de uma clula procariota.
Ilustrao: rica Gabriela B. Santos (Graduanda do curso superior de Tecnologia e Agroecologia
/ IFB - Campus Planaltina)
As bactrias podem ser agrupadas em dois domnios: eubactrias
(bactrias tpicas, cianobactrias e actinomicetos) e arqueas. Na
classifcao dos seres vivos em domnios, segundo Woese e colaboradores
(1977), e segundo os reinos de classifcao dos seres vivos de Whitaker, de
1969, as bactrias fazem parte do reino monera.
As bactrias podem ser encontradas fazendo parte da microbiota do
corpo humano, vivendo em diferentes ambientes, como solo, ambientes
aquticos, atmosferas, alimentos e amostras ambientais diversas.
Ribossomo
DNA (nucloide)
Citoplasma
Cpsula
Parede celular
Membrana
Plasmtica
Pili
Flagelos
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Voc deve fazer uma pesquisa nos livros de Microbiologia Bsica e
pginas confveis da Internet e identifcar as bactrias nos ambientes
citados anteriormente.
Voc tambm deve fazer uma pesquisa sobre a classifcao dos
seres vivos segundo Whitaker (reinos) e Woese (domnios).
As formas mais comuns de uma clula bacteriana so: esfrica (coco),
bastonete (bacilo), bastonete curvo (vibrio), espiral (espirilo e espiroqueta).
Entretanto, as clulas bactrianas podem assumir diferentes arranjos, como
diplo (quando se apresentam aos pares), estrepto (quando se apresentam
em forma de cadeia), ttrades (quando se apresentam em grupos de quatro)
e estaflo (quando se apresentam formando cachos).
Aps uma pesquisa, faa um desenho intitulado as formas bsicas
de uma clula bacteriana e seus principais arranjos.
Voc tambm deve fazer uma pesquisa sobre o processo de
esporulao das bactrias.
A maioria das bactrias se reproduz assexuadamente por um
processo chamado de fsso binria transversa, ou diviso binria ou
cissiparidade. um tipo de reproduo em que, a partir de uma clula
me, so originadas duas clulas flhas idnticas. Porm, uma bactria pode
receber ou trocar material gentico diverso com outras bactrias, desde
que ocorra uma compatibilidade entre elas, atravs de alguns processos
denominados,conjugao (consiste na passagem ou troca de material
gentico entre duas bactrias atravs de fmbrias ou pili sexual localizados
na superfcie da clula), transformao (a bactria absorve molculas de
DNA disperso no meio onde se encontra) e transduo (as molculas de
DNA so transferidas de uma bactria a outra usando vrus como vetores).
O crescimento bacteriano pode ser caracterizado estabelecendo uma
curva de crescimento tpica em laboratrio de Microbiologia. O crescimento
bacteriano apresenta quatro fases principais: fase lag (repouso), fase log ou
de crescimento intenso, fase estacionria e fase de declnio ou morte.
24
A fase lag tambm chamada de fase de pseudo repouso, pois no
verifcado aumento da populao bacteriana. Contudo, possvel detectar
intensa atividade metablica no interior da clula, com duplicao dos seus
componentes, preparando a clula para a diviso.
Na fase log, logartmica ou de crescimento intenso, ocorre um
aumento acelerado da populao bacteriana, com divises constantes das
clulas, atravs do consumo de nutrientes disponveis no meio e com a
produo de diversas substncias que so excretadas para fora da clula.
Na fase estacionria, logo aps a fase log, a taxa de morte da populao
bacteriana se iguala a sua taxa de crescimento, por isso, no observado
mais um aumento da populao e, sim, uma constncia de densidade.
Nessa fase, os nutrientes j se encontram em concentraes mnimas e
ocorre um acmulo de substncias que vo interferir na viabilidade celular
das bactrias. No fnal dessa fase, as bactrias comeam a apresentar o
chamado metabolismo endgeno, em que consomem suas organelas
reservas de fonte de carbono e energia.
Na fase de declnio ou morte, os nutrientes j foram totalmente
consumidos, o nvel de concentrao de substncias txicas para a
populao bacteriana elevado e a taxa de morte aceleradamente positiva.
As bactrias desempenham um papel de suma importncia para o
ambiente e a atividade humana em geral: participam da reciclagem de
nutrientes na natureza, fazem parte da microbiotado corpo humano, so
grandes produtores de substncias com aplicao biotecnolgica diversa,
como antibiticos, cidos orgnicos, vitaminas, enzimas, utilizadas na
produo de alimentos diversos, entre outros.
O grupo bacteriano vai se destacar tambm pelo potencial de provocar
doenas infecciosas diversas e doenas transmitidas por alimentos e gua (DTAs).
As doenas transmitidas por alimentos e gua podem ser classifcadas em
infeces alimentares, intoxicaes alimentares e toxiinfeces alimentares.
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As infeces alimentares so as doenas provocadas pela ingesto
de alimentos contaminados, em sua maioria, por um nmero elevado
de clulas bacterianas, que provocaro um quadro de infeco quando
atingirem o trato intestinal humano.
As intoxicaes alimentares so as doenas provocadas pela ingesto
de alimentos contaminados com toxinas produzidas previamente pelo
microrganismo patognico.
As toxiinfeces alimentares so as doenas provocadas pela ingesto
de alimentos contaminados por um nmero elevado de clulas bacterianas,
que apresentam o potencial infeccioso, com produo de toxinas no interior
do trato intestinal.
interessante ressaltar que as DTAs podem ser provocadas por
microrganismos diversos, embora seja o grupo bacteriano que mais se
destaca na veiculao de doenas atravs dos alimentos.
Alguns gneros e espcies mais conhecidos e estudados do grupo
das bactrias so: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella,
Pseudomonas aeuruginosa, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium
botulinum, C. perfringens, Bacillus subtilis, B. cereus, entre outros.
Complemente as informaes que voc recebeu com uma pesquisa nos
livros de Microbiologia Bsica e pginas especializadas na Internet,
sobre os seguintes grupos bacterianos: arquea, cianobactrias e
actinomicetos (bactrias flamentosas).
FUNGOS
Os fungos so constitudos por clulas eucariotas, com parede celular
rica em quitina em sua maioria (Figura 3) e se dividem em dois grupos principais:
fungos flamentosos (mofo, bolor) e leveduras (fungos unicelulares).
26
Os fungos flamentosos so multicelulares ou pluricelulares. Os seus
flamentos so chamados de hifas, que podem apresentar-se como cenoctica
ou hifas que no apresentam septos, separando as clulas umas das outras
e hifas septadas mononucleadas ou multinucleadas. O conjunto de hifas
denominado de miclio e representa o corpo fngico com caractersticas
morfolgicas especfcas para cada gnero: algodonoso, aveludado, com ou
sem pigmentao, crescimento intenso ou discreto entre outros.
Figura 3. Esquema de uma clula eucariota.
Ilustrao: rica Gabriela B. Santos (Graduanda do curso superior de Tecnologia e Agroecologia
/ IFB - Campus Planaltina)
Os fungos so microrganismos amplamente espalhados pelo ambiente em
geral. Todos so heterotrfcos e a grande maioria aerbio ou anaerbio facultativo
(leveduras). Os fungos crescem normalmente em ambientes onde o pH prximo
a 5,0 e toleram muito bem concentraes relativamente altas de acar ou sal.
Ademais, podem crescer muito bem em ambientes com baixo teor de umidade.
Os fungos so considerados grandes biodegradadores de matria
orgnica, como carboidratos complexos, por causa da sua capacidade de
sintetizar e expressar enzimas hidrolticas.
Membrana Plasmtica
Complexo de Golgi
Vescula
Vescula
Mitocondria
Citoplasma
Flagelo
Ribossomos livres
Reticulo endoplasmatico
Reticulo endoplasmatico
Microtbilos
Lisossomos
Ribossomo
Filamentos intermdiario
Centriolo
Nucleolo
cromatina (DNA)
Poro nuclear
cariomembrana
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Os fungos se destacam no ambiente tambm por suas associaes
benfcas: se associam s razes da maioria das plantas, em uma interao
simbitica, formando as micorrizas, que ajudam as plantas a absorverem
minerais e gua do solo, e tambm constituem os lquens, que so uma
combinao de uma alga verde (ou uma cianobactria) com um fungo, em
uma associao mutualstica.
Realize uma pesquisa consultando livros e sites especializados na
Internet, buscando mais informaes sobre os diversos tipos de
micorrizas e lquens e sua importncia para o meio ambiente.
Os fungos so utilizados pelo homem como alimentos e na produo de
alimentos e bebidas, alm de produzirem uma grande variedade de substncias
com aplicao diversas (antibiticos, cidos orgnicos, enzimas, entre outros).
A grande maioria dos gneros fngicos benfca, contudo, alguns
apresentam potencial patognico, provocando doenas, principalmente,
em plantas economicamente importantes (fungos ftopatognicos). So
registrados tambm algumas doenas em humanos como alergias, infeces
fngicas, doenas provocadas pela ingesto de micotoxinas (toxinas
produzidas por fungos em determinadas condies ambientais).
Alguns gneros fngicos (flamentosos) so bastante conhecidos e
estudados: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Claviceps, Agaricus,
entre outros.
Os fungos se reproduzem assexuadamente, atravs de mecanismos de
esporulao, brotamento ou gemulao e fragmentao, e sexuadamente,
atravs da esporulao.
As leveduras so fungos unicelulares, que apresentam clulas nas
formas ovais ou esfricas. Tambm so amplamente encontradas na natureza
e podem ser observadas como um p fno e branco cobrindo folhas e frutas.
As leveduras se dividem assexuadamente atravs do brotamento, em
que ocorre o desenvolvimento de um broto (clula flha), na superfcie da
28
clula parental (me). No fnal do processo de separao ocorre a formao
de duas clulas desiguais, fcando a clula me com cicatrizes em sua
superfcie.
As leveduras podem tambm se dividir assexuadamente por fsso,
produzindo, a partir de uma clula me, duas clulas idnticas. Tambm
podem se dividir sexuadamente atravs da formao de esporos.
Grande parte das leveduras apresenta-se como anaerbicos
facultativos, o que as tornam capazes de crescerem em diversos ambientes.
Na presena de O
2
, as leveduras realizam a respirao aerbia e, na sua
ausncia, elas podem fermentar carboidratos e produzir etanol e dixido de
carbono. Esse processo fermentativo usado na produo de cerveja, vinho
e nos diversos processos de panifcao.
A levedura mais conhecida e utilizada pela humanidade do gnero
Saccharomyces. Outros gneros conhecidos so Candida e Rhodotorula
entre outros.
Os fungos podem ser classifcados com base nas suas estruturas de
reproduo e no tipo de hifa que os constituem. Sero apresentados a seguir
apenas quatro flos principais que englobam gneros que se destacam no
ambiente e vida humana: zigomiceto, ascomiceto, basidiomiceto (classes
de fungos chamados perfeitos por terem sido registrados seus ciclos de vida
sexual e assexuado) e deuteromiceto (classe de fungos imperfeitos, por ter
sido observado apenas seu ciclo de vida assexuado).
O Filo zigomiceto, tambm chamado de fungos de conjugao, rene
fungos flamentosos e que apresentam hifas cenocticas. O gnero mais
conhecido o Rhizopus (R. nigricans, representado normalmente pelo bolor
preto do po). Os esporos assexuais so chamados de esporangisporos
e os sexuais (formados a partir da fuso de duas clulas compatveis) so
denominados zigsporos. A partir de cada esporo, em condies adequadas,
ir germinar um novo fungo.
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O Filo ascomiceto, ou fungos de saco, inclue fungos com hifas
septadas e algumas leveduras. Os esporos assexuais so chamados de
condios produzidos em cadeias a partir de um corpo de frutifcao
microscpico (conidiforo). Esses esporos so liberados facilmente no
ambiente e futuam no ar como poeira. Os esporos sexuais, chamados de
ascsporos, so produzidos em uma estrutura em forma de saco conhecido
como asco. Gneros bastante conhecidos so o Neurospora (muito estudado
pela engenharia gentica), Talaromyces e Aspergillus.
O Filo basidiomiceto bastante conhecido por incluir os fungos que
produzem os cogumelos, corpos de frutifcao macroscpicos. Apresentam
hifas septadas. Os esporos sexuais so chamados de basidisporos,
formados externamente em um pedestal conhecido como basdio (forma
de clava), normalmente em nmero de quatro esporos por basdio. Alguns
basidiomicetos podem formar esporos assexuais do tipo conidisporos,
mas, em geral, na sua fase assexuada, se reproduzem por fragmentao
do miclio. Gneros conhecidos: Amanita muscaria (produz neurotoxina),
Lentinus, Pleurotus, Agaricus (com espcies comestveis) entre outros.
Os fungos do flo deuteromiceto deste flo so chamados de
imperfeitos, pois no foi observado ainda o seu ciclo sexual de reproduo.
So considerados uma classe de espera, transitria. conhecido apenas
a fase assexuada de reproduo. Os esporos assexuais mais conhecidos
so os conidisporos (condios), sintetizados por um corpo de frutifcao
(conidiforo) formados a partir da hifa. Ficam livres, mantidos em uma
cadeia de esporos. Gnero mais conhecido: Penicillium.
Voc deve fazer uma pesquisa nos livros de Microbiologia Bsica e
pginas especializadas na Internet para complementar e aprofundar
as informaes sobre as principais classes fngicas existentes, alm
de informaes bsicas sobre os protistas semelhantes a fungos
(fungos aquticos e fungos limosos).
PARTE 2
Introduo a
Microbiologia Prtica
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O laboratrio de Microbiologia trabalha com uma variedade de
microrganismos e materiais contaminados. Alguns desses organismos so
patgenos oportunistas ou podem vir a s-lo de acordo com as circunstncias
e a dose da contaminao.
essencial a adoo de normas de preveno dentro de um programa
de boas prticas de manipulao de microrganismos nos laboratrios de
Microbiologia. preciso proteger a todas as pessoas que desenvolvem
alguma atividade no laboratrio: professores e tcnicos, pesquisadores,
estagirios e alunos, alm de evitar a contaminao dos seus experimentos
e do ambiente laboratorial.
Segurana sinnimo de boa tcnica e, desse princpio parte a
necessidade do adequado preparo e treinamento dos manipuladores
de microrganismos. A segurana biolgica se fundamenta na adoo de
procedimentos microbiolgicos corretos por parte de todos os usurios do
laboratrio de Microbiologia.
SEGURANA EM Microbiologia
Para reduzir o risco de contaminao ao se trabalhar com
microrganismos, necessrio saber: o perigo em potencial dos
microrganismos com os quais se est trabalhando; as rotas de entrada
no corpo e de infeces; e os mtodos corretos de conteno dos
microrganismos, para que esses no tenham acesso s rotas de entrada.
Os microrganismos podem ser classifcados em grupos de risco I,
II, III e IV, com base na sua capacidade de causar doenas no indivduo
manipulador e se espalhar na comunidade.
Verifque quais os microrganismos so manipulados no laboratrio
de Microbiologia que voc est tendo as aulas prticas e qual a sua
classifcao de risco.
34
As principais rotas de infeco ou portas de entrada de microrganismos,
no corpo humano, no ambiente laboratorial so: boca (ingesto) pipetao,
mos e materiais contaminados; pulmes (inalao) ar contaminado; pele:
agulhas contaminadas, pipetas Pasteur, vidros infectados quebrados; olhos:
atravs de respingos contaminados.
Os acidentes que podem ocorrer em um laboratrio de Microbiologia
englobam aqueles de riscos biolgicos (infeces respiratrias, alergias,
micoses, intoxicaes entre outros), alm de riscos qumicos, fsicos e
ergonmicos.
A preveno de infeces adquiridas em laboratrios deve considerar
uma barreira primria (equipamentos de proteo individual, boas
tcnicas de manipulao), para prevenir a disperso dos microrganismos
no laboratrio; uma barreira secundria (boas tcnicas de manipulao,
cmara de segurana biolgica), para proporcionar uma rede de segurana
ao redor do manipulador; e uma barreira terciria (boas tcnicas de
manipulao, mtodos efcientes de controle de microrganismos, descarte
controlado de resduos produzidos no laboratrio), para previnir o escape
dos microrganismos patognicos que coloquem em risco a comunidade.
NORMAS BSICAS DE BIOSSEGURANA EM
LABORATRIO
Tenha sempre disponvel os equipamentos de proteo individual (EPIs)
obrigatrios: jaleco ou guarda p de manga longa limpo e mscaras
de proteo descartveis, luvas de procedimentos descartveis, visor
de proteo.
Lave muito bem as mos e os antebraos antes de iniciar ou concluir
qualquer atividade no laboratrio. Aps a lavagem, desinfete mos e
antebraos com lcool iodado ou lcool 70%.
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Use culos de segurana nas tarefas que apresentarem riscos.
No toque em maanetas, interruptores ou telefones usando luvas.
Use sempre calas compridas e sapatos fechados.
Retire jias, anis, relgios e pulseiras. As unhas devem ser curtas e
sem esmalte. Os cabelos compridos devero estar bem presos.
No toque olhos, boca cabelo com as mos durante o trabalho. Se
isso ocorrer, adote procedimentos de higienizao adequados.
Em caso de cortes ou ferimentos, proceder imediatamente a limpeza
e desinfeco.
Caso suspeite de contaminao/intoxicao avise o professor ou
monitor com urgncia.
No coma, beba, masque chicletes ou fume no laboratrio.
Jamais guarde alimentos/ bebidas de consumo prprio no refrigerador
do laboratrio. No prepare caf, ch, pipoca ou outros alimentos na
rea do laboratrio.
Evite conversas desnecessrias, visando prevenir a contaminao do
manipulador e da amostra.
Desinfete as bancadas com produtos adequados (desinfetantes e
papeis descartveis) antes e aps o trabalho.
Jamais coloque materiais contaminados (lminas, pipetas, entre outros)
sobre as bancadas ou a cmara de fuxo laminar. Quando o descarte
durante as atividades for necessrio, providencie antecipadamente
um recipiente adequado com desinfetante.
Todo material deve ser pipetado cuidadosamente com pipetadores
automticos ou peras.
Trate todas as culturas de microrganismos como potencialmente
patognicas.
36
Identifque de maneira clara e completa os materiais particulares (por
exemplo: tipo de amostra, data, nome da equipe, turma, mtodo,
meio de cultivo, microrganismo inoculado, entre outras informaes
pertinentes).
Todo material contaminado deve obrigatoriamente ser esterilizado
antes do descarte.
Ao sair do laboratrio feche os registros de gs e as torneiras, desligue
as luzes e os equipamentos (devidamente limpos), limpe e organize
todo o material utilizado.
CONTROLE DE MICRORGANISMOS
O controle microbiano no laboratrio se d atravs de mtodos fsicos
e qumicos.
Temperaturas elevadas (calor seco ou mido) e temperaturas baixas
(refrigerao e congelamento) so os mtodos fsicos mais utilizados no
laboratrio para controle da populao microbiana. Tambm so utilizados
a radiao ultra violeta (UV) e a fltrao, quando pertinentes.
As substncias como hipoclorito de sdio (concentrao de 200 a
5000 ppm), lcool 70% e lcool iodado so as mais comumente usadas
para o controle qumico de microrganismos. O cloro considerado um
desinfetante universal, pois mata a maioria das clulas bacterianas e
age sobre alguns tipos de vrus e fungos. O iodo ativo contra clulas
bacterianas, alguns vrus e esporos, muito usado como sanitizante cutneo.
O lcool 70% age sobre as clulas vegetativas de bactrias e fungos e inativa
alguns vrus, porm no age sobre esporos.
Porque o lcool na concentrao de 70% mais efciente que em
concentraes prximas de 100%?
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Os seguintes termos so usados para descrever os processos
fsicos e qumicos empregados no controle de microrganismos:
Esterilizao: processo de destruio de todas as formas de vida
microscpica. Ausncia total ou destruio total de todos os microrganismos.
Fogo (fambar) para alas de inoculao. Calor seco, forno com
temperatura controlada, com ventilao, para temperatura
homognea. Temperatura mnima de 160C, por duas horas.
Calor mido sob presso (autoclaves): 121C, por 15 minutos, para
materiais com baixo nvel de contaminao; 20 a 30 minutos, para
materiais com alto nvel de contaminao.
Esterilizao comercial: tratamento trmico para alimentos, que
inativa os microrganismos patognicos e deterioradores que possam crescer
em condies normais de estocagem. Normalmente sobrevivem a esse
processo esporos bacterianos termorresistentes no patognicos.
gua em ebulio: clulas vegetativas podem ser destrudas em
alguns minutos, mas esporos resistiro por vrias horas. um mtodo de
desinfeco e no de esterilizao.
Pasteurizao: tratamento trmico controlado que mata certos
microrganismos, mas, no elimina todas as bactrias presentes. Leite, creme
e certas bebidas alcolicas (cerveja e vinho). Temperatura: baseada no tempo
de morte trmica caracterstica das espcies patognicas (Mycobacterium
tuberculosis60C/ 15 min). Pasteurizao lenta, 62C/ 30 min, ou rpida,
75
o
C/ 15 a 20 seg.
Desinfeco: processo que objetiva a reduo ou eliminao de
parte da carga microbiana, tendo como alvo principal os microrganismos
patognicos.
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AULA PRTICA 1 - ISOLAMENTO DE BACTRIAS TOTAIS
PRESENTES NAS DIGITAIS DAS MOS
MATERIAL
Meio de cultura: gar padro, PCA, AN em Placa de Petri; Estufa
microbiana a 35/37C;
Bico de Bunsen ou lamparina ou vela; caneta para escrita em vidro.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Realizar o procedimento de coleta das digitais dos dedos das mos,
na Placa de Petri com gar padro, prximo ao bico de Bunsen ou
lamparina com assepsia, conforme orientao/demonstrao do(a)
professor(a);
efetuar a identifcao da placa com: tipo de procedimento, data,
responsvel pela coleta e equipe de trabalho;
incubar em estufa microbiana a 3537C por at 48 horas. Aps a
incubao, armazenar sob refrigerao (5 a 7C) at a leitura dos
resultados;
aps a leitura, descartar o material contaminado aps esterilizao
(autoclave, 121C/30 min) e efetuar a higienizao recomendada.
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RESULTADOS
Caractersticas Morfolgicas Culturais
Meio de
cultura
Intensidade
do
crescimento
em placa
Forma da colnia
Tamanho
da colnia
Textura,
estrutura e
pigmentao
da colnia
Intensidade: +++: crescimento intenso; ++: crescimento moderado; +: crescimento pequeno; -: ausncia
de crescimento.
Caracterizao macroscpica de colnias bacterianas
As colnias visveis a olho nu podem ser classifcadas quanto ao:
Tamanho, que pode variar entre uma frao de milmetro ate 10 mm
de dimetro; Bordos, que podem se apresentar como lisos, ondulados,
lobulados, lacerados ou flamentosos; Elevao, que classifca as colnias
como chatas, cncavas, convexas, ondulada, elevada ou protuberante;
Pigmentao, quando apresentam cor ou no; e Forma, podendo ser
circulares, irregulares, rizides, flamentosas ou puntiformes.
QUESTES PARA RESPONDER
1. Que tipo de material possvel encontrar na superfcie de suas mos?
2. Quais os grupos microbianos que mais aparecem contaminando as mos?
3. Faa uma pesquisa sobre os gneros microbianos mais frequentes nas
mos de uma pessoa.
4. Quais as principais necessidades devem ser atendidas para um crescimento
adequado das bactrias?
40
AULA PRTICA 2 - ISOLAMENTO E QUANTIFICAO DE
MICRORGANISMOS A PARTIR DE AMOSTRA AMBIENTAL
OU DE ALIMENTOS
MATERIAL
Amostra ambiental ou de alimentos; Meio de cultura: gar padro,
PCA, ou AN em Placa de Petri (Bactrias totais) e gar PDA (Fungos totais);
Erlenmeyer com 90 mL de gua de diluio, soluo salina (0,9%) ou
gua peptonada (0,1%) estril; tubos de ensaio contendo 9 mL de gua
de diluio estril; esptula estril; pipeta graduada de 1 mL estril; estufa
microbiana a 3537C (bactrias totais) e 2530C (fungos totais); Bico de
Bunsen ou lamparina ou vela; caneta para escrita em vidro.
Diluio da Amostra
A diluio da amostra (quando necessria) tem o objetivo de promover
o isolamento das colnias para anlises qualitativas e quantitativas.
A amostra deve ser homogeneizada e pesada adequadamente (lquida ou
slida) e ento transferida assepticamente para efetuar as diluies necessrias.
Tcnica de Espalhamento (Spread Plate)
Esse o mtodo mais usado para a quantifcao dos microrganismos
aerbios.
Com a diluio recomendada (para a obteno de 25 a 300 unidades
formadoras de colnias/ placa), dever ser distribudo 0,1 mL da amostra
diluda em uma placa contendo o meio de cultura. Sobre a superfcie do
meio e com o auxlio de uma ala de Drigalski, espalhe cuidadosamente
o contedo inoculado. Espere a absoro e incube em estufa microbiana.
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Tcnica de Profundidade (Pour Plate)
A partir das diluies adequadas, pipetar 0,1 ou 1 mL diretamente em
Placas de Petri esterilizadas e inicialmente sem meio. Verter 20 a 30 mL do
meio recomendado liquefeito e resfriado aproximadamente a 45C. Feche s
a placa e movimente-a lentamente/suavemente em forma de oito, visando a
perfeita mistura da cultura com o gar. Espere solidifcar e incube as placas
invertidas a 35-37C/48horas, aps identifcao.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
Realizar a coleta da amostra ambiental ou de alimentos, atendendo s
recomendaes de assepsia;
pesar 10 gramas ou 10 mL de amostra em balana digital, em bquer
estril, em condies de assepsia;
adicionar cuidadosamente a amostra pesada no Erlenmeyer contendo 90
mL de gua de diluio e homegenizar cuidadosamente (diluio 1:10);
a partir da diluio 1:10, transferir assepticamente 1 mL para um
tubo de ensaio contendo 9 mL de gua de diluio (diluio 1:100).
Homogeneizar e repetir o procedimento para o preparo das diluies
1:1000 e 1:10.000;
assepticamente, efetuar a semeadura de 0,1 mL da diluio 1:10.000
no centro das placas contendo meio de cultura;
efetuar a identifcao da placa com: tipo de procedimento, data,
responsvel pela coleta e equipe de trabalho;
incubar, em estufa microbiana, a 3537C por at 48 horas (gar
padro), e a 30C (gar PDA), por 72 horas. Aps a incubao,
armazenar sob refrigerao (5 a 7C) at a leitura dos resultados; e
aps a leitura, descartar o material contaminado aps esterilizao
(autoclave, 121C/30 min) e efetuar a higienizao recomendada.
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RESULTADOS
Contar as placas que contenham preferencialmente de 25 a 300
colnias por placa. O ideal proceda essa tcnica em duplicata ou triplicata,
tirando a mdia das contagens.
A concentrao determinada multiplicando-se a contagem mdia
das placas pelo inverso da diluio inoculada e pela quantidade da amostra
adicionada. No caso da tcnica do espalhamento, que emprega uma
alquota menor (0,1 mL), para que o resultado seja expresso em UFC/mL, o
valor obtido dever ser multiplicado por 10.
Meio de cultura
Unidades formadoras
de colnias (UFC)/mL
Caractersticas
morfolgicas culturais
gar padro
(bactrias totais)
gar PDA
(fungos totais)
QUESTES PARA RESPONDER:
1. Por que o meio na tcnica do pour plate deve ser mantido fundido a
no mximo a 50C?
2. Cite os motivos pelos quais o nmero de colnias em placas nas tcnicas
de quantifcao deve fcar entre 25 e 300.
3. As colnias que crescem imersas no gar pour plate) so menores do
que aquelas que crescem na superfcie ? Justifque.
4. Por que a tcnica de spread plate mais indicada para aerbicos estritos?
5. Liste as principais fontes de erros dessas tcnicas.
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AULA PRTICA 3- MONITORAMENTO
MICROBIOLGICO DE AMBIENTES
1. MTODO DE SEDIMENTAO
Esse mtodo consiste em expor uma placa de Petri com 20 mL
de meio seletivo ou no seletivo ao ambiente, As clulas se depositam
por gravidade e as colnias so contadas aps incubao em estufa
microbiana de crescimento.
MATERIAL
Meio de cultura: gar padro, PCA, ou AN em Placa de Petri
(Bactrias totais) e gar PDA (fungos totais); e caneta para identifcao
em vidro.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
A amostragem deve ser feita perto de equipamentos abertos e outros
locais nos quais as correntes de ar podem levar a contaminao;
diferentes pontos devem ser amostrados;
abrir as placas (duplicata ou triplicata) contendo um gar especfco e
deixar um tempo de exposio de no mnimo 15 min; e
incubar as placas aps a exposio a 3537
o
C para gar padro, por
24 48 horas ou 2530
o
C para gar PDA, por 72 horas.
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RESULTADOS
Expressar o resultado em nmero de microrganismos viveis/ rea de
placa de Petri (rea padro: 70,88 cm
2
)/ tempo de exposio (15 min
a 2 horas).
2. MTODO DE SOLUO DE ENXAGUE
Esse mtodo adequado para verifcar a sanitizao de vidrarias e
tambm de recipientes maiores e equipamentos. Usa-se uma soluo de
enxague denominada Soluo de Ringer, a qual distribuda no recipiente
e agitada para ressuspender os microrganismos remanescentes que se
encontram nas paredes. Logo aps, essa soluo plaqueada, incubada e
feita a contagem.
A partir da soluo de Ringer possvel pesquisar vrios indicadores
microbianos, como coliformes totais, coliformes termotolerantes, bactrias
totais, fungos totais, E. coli, Salmonella sp., entre outros.
MATERIAL
Soluo de Ringer: 2,15g de Cloreto de sdio p.a; 0,075g de Cloreto
de potssio p.a; 0,12g de Cloreto de clcio anidro p.a; 0,5g de Tiossulfato
de Na pentahidratado; 1000 mL de gua destilada (q.s.p); pH fnal de 6.6.
Emprega-se na diluio 1.4 da original, em gua destilada; gar padro ou
PCA estril liquefeito (50
o
C); Placa de Petri estril; pipeta graduada estril;
Bico de Bunsen ou lamparina; e caneta para identifcao em vidro.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Adicionar 10 mL de soluo de Ringer no recipiente a ser analisado
e agitar cuidadosamente;
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retirar uma alquota de 1 mL e distribuir em placas de Petri (duplicata/
triplicata) e fazer inoculao tipo pour plate com o gar liquefeito; e
incubar, a 35-37C, por at 72 horas.
RESULTADOS
Proceder a contagem das colnias nas placas, multiplicando o
resultado por 100 (1 mL de 10 mL, diluio de 100x).
3. MTODO DO ESFREGAO DE SUPERFCIE (SWAB)
Esse mtodo recomendado para monitoramento microbiolgico de
superfcies de trabalho, pisos, paredes, cantos, equipamentos, carcaas e
cortes de animais.
Quando no for possvel o uso da cartolina como o padro de rea
(para vasilhames pequenos, esptulas, talheres, pratos), use a mesma
tcnica, mas, com o cuidado de passar o cotonete nas peas por inteiro,
sendo o resultado expresso por nmero de UFC/pea.
MATERIAL
Tubos de ensaio com 9 mL de Soluo de Ringer; cotonetes de
madeira/algodo hidrofbico estreis; quadrados de cartolina de rea
interna de 25 cm
2
esterilizados; Placa de Petri estril; gar padro ou PCA
liquefeito (50
o
C); pipeta graduada estril; Bico de Bunsen ou lamparina; e
caneta para identifcao em vidro.
46
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Colocar o padro de cartolina estril sobre a superfcie a ser
examinada;
submergir um dos cotonetes (swab) na soluo de Ringer em tubo;
aplicar o swab, com presso, na rea interna do padro, atentando
para que a superfcie do algodo entre em contato com a rea;
recolocar o swab no mesmo tubo contendo a soluo de Ringer,
quebrando a extremidade que entrou em contato com a mo do
manipulador;
repetir a operao com outro swab seco, ou seja, sem umedec-lo
previamente;
colocar este segundo swab no mesmo tubo de ensaio do swab anterior,
tambm quebrando a extremidade do cotonete;
agitar energicamente os tubos deixando-os em repouso por 3 min.
inocular, pela tcnica do pour plate, 1 ou 0.1 mL da soluo de Ringer
no gar (PCA); e
Incubar, a 35C, por 72 horas.
RESULTADOS
Efetuar a contagem das colnias nas placas e emitir o resultado como
nmero de UFC/ 25 cm
2
de rea avaliada.
QUESTES PARA RESPONDER
1. Qual a importncia da realizao de um monitoramento microbiolgico
ambiental?
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2. Qual o principal objetivo do mtodo de soluo de enxague e do mtodo
do esfregao em superfcie?
3. Os resultados obtidos devero ser comparados com padres de referncia.
Quais so esses padres?
4. Quais grupos microbianos indicadores podem ser pesquisados a partir da
soluo de Ringer utilizada como soluo diluente ou de enxague?
AULA PRTICA 4 - ISOLAMENTO E CARACTERIZAO
DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS
MATERIAL
gar Sabouraud ou PDA em Placa de Petri; cultivos prvios dos fungos
a serem avaliados; microcultivo fngico em placa; pinas metlicas; bquer
com lcool comercial; ala de inoculao
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Medio do crescimento de fungos flamentosos
Exatamente no centro de uma Placa de Petri (sem espalhar) e com
o auxlio de uma ala ou agulha de inoculao, inocule o fungo
destinado sua equipe.
Verifcar a velocidade de crescimento dos fungos aproximadamente a
cada 2 dias, com paqumetro e registrar em planilha.
48
Fungo:
Data Crescimento da colnia fngica (mm)
Caracterizao morfolgica de fungos
Examine as Placas de Petri com crescimento fngico e anote as
caractersticas observadas (por exemplo: cor da colnia fngica, aparncia
cotonosa, aveludada, crescimento intenso, moderado ou pequeno).
Caractersticas morfolgicas culturais
Meio de
cultura/
Fungo
Intensidade do
crescimento
em placa
Forma da
colnia
Tamanho da
colnia
Textura,
estrutura e
pigmentao
da colnia
Intensidade: +++: crescimento intenso; ++: crescimento moderado; +: crescimento pequeno
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Examine ao microscpio, nas objetivas de aumento de 4 e 10x, os
fungos flamentosos (preparo de lmina fresco) e identifque: hifas
areas (presena ou ausncia de septos e colorao), hifas submersas
e corpos de frutifcao (endgenos/ exgenos, forma, tamanho, cor).
Exame de leveduras a fresco
Sobre uma lmina limpa, coloque uma gota do meio lquido com
Saccharomyces cerevisiae e cubra com uma lamnula. Examine ao
microscpio e anotar as caractersticas observadas (forma, tamanho,
presena de esporos/pseudo hifas).
Meio de cultura/Fungo/Aumento Caractersticas microscpicas
Isolamento fngico
Em uma Placa de Petri contendo PDA ou gar Sabouraud, procure fxar
no centro alguns gros/oleaginosas (por exemplo, amendoim, feijo,
arroz, trigo, soja). Incube a 2530C, por 5 dias, ou temperatura
ambiente e verifque o crescimento fngico atravs de anlise macro
e microscpica.
50
Meio de cultura/
Fungo/Aumento
Caractersticas macroscpica
e microscpicas
Microcultivo (fgura 4)
Selecione uma Placa de Petri com o microcultivo de fungos
flamentosos e da levedura S. cerevisae:
a) Com o auxlio de uma pina, retire a lmina com as lamnulas e
observe as estrias ao microscpio, (aumento de 10 e 40x).
b) Observe a morfologia das clulas, flamentos e principalmente a
presena ou no de pseudomiclio (leveduras). Registre as observaes.
Figura 04. Exemplo de microcultivo de fungos. Laboratrio de Microbiologia,
DAQBI/UTFPR.
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Meio de cultura/Fungo/Aumento Caractersticas microscpicas
QUESTES PARA RESPONDER
1. Quais as principais diferenas entre o cultivo dos fungos e das bactrias?
2. Quais as principais necessidades que devem ser atendidas para um
crescimento adequado dos fungos?
3. A tcnica do microcultivo fngico adequada para realizar que tipo de
estudo? Porque?
4. A preparao fresco do crescimento fngico adequado para anlise
microscpica? Quais as vantagens e desvantagens?
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PLANILHA DE OBSERVAO
MATERIAL: ______________________________________________________
Observe as lminas e desenhe as caractersticas observadas, por exemplo,
forma, arranjo, colorao, entre outros.
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__________________ _________________ _______________
OBSERVAES:
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AULA PRTICA 5 - TCNICAS DE PREPARAO DE
LMINAS PARA COLORAO
1. Preparo do esfregao
Limpar a lmina com papel macio;
para a cultura microbiana proveniente de meios slidos, colocar
uma gota de gua destilada estril sobre a superfcie da lmina,
em seguida, com a ala de platina fambada ao rubro, coletar uma
pequena poro do material a ser analisado e esfreg-lo sobre a gota
de gua, espalhando pela rea central da superfcie da lmina;
para a cultura proveniente de meios lquidos: com auxlio da ala de
platina, coletar uma pequena poro do material a ser analisado e
esfreg-lo, espalhando pela rea central da superfcie da lmina;
deixar a lmina secar temperatura ambiente.
para um melhor resultado, utilizar culturas que tenham at 48 horas
de incubao. Para materiais muito espessos, recomenda-se dilu-los
em soluo salina estril e para aqueles muito diludos recomenda-se
concentrao atravs de centrifugao (3000rpm/ 15 min), decantando
o sobrenadante e procedendo o esfregao a partir do sedimento.
2. Fixao do material
Passar a lmina na chama do Bico de Bunsen ou lamparina (parte
azul), rapidamente trs vezes, com o lado do material a ser analisado
voltado para cima. A lmina no deve aquecer excessivamente.
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3. Colorao
A tcnica de colorao varia de acordo com o objetivo da visualizao
(colorao simples, de fagelos, esporos, cpsula, etc.). Recomenda-se que os
corantes no sejam preparados com demasiada antecedncia, sendo que antes
do uso, esses devem ser fltrados para que resduos no interfram na leitura.
COLORAO DE GRAM
Essa colorao muito empregada, visto que a maioria das bactrias
cora-se por esse mtodo. A tcnica no permite a observao de estruturas
internas, mas permite observar forma e fornece informaes a respeito do
tipo de parede celular da bactria.
MATERIAL
Soluo de cristal violeta ou violeta de genciana; lugol; lcool-
acetona; fucsina ou safranina.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparar um esfregao no centro da lmina e deixar secar ao ar;
cobrir toda a lmina com cristal violeta, aguardar 1 min e desprezar
o excesso do corante;
cobrir a lmina com lugol (soluo de iodo) aguardar 1 min e 30 s,
desprezar o excesso de corante;
com o auxlio de um pisseti, lavar a lmina com soluo de lcool-
acetona at que a gota que escorre seja incolor, respeitando, contudo,
o tempo de 10 a 20 s;
lavar a lmina com gua corrente de baixa presso (pisseti);
cobrir a lmina com Fucsina ou safranina e aguardar 30 s;
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lavar a lmina com gua corrente de baixa presso (pisseti);
deixar secar espontaneamente ao ar; e
proceder a leitura ao microscpio tico em objetiva de imerso
(100X).
RESULTADO
Clulas violetas (Gram +); clulas vermelhas (Gram -).
Enzimas lticas normalmente secretadas por culturas envelhecidas
podem causar danos membrana da clula, alterando, por exemplo,
a permeabilidade aos solventes (lcool acetona). Consequentemente,
o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da clula e a essa
acaba corando-se de vermelho (fucsina).
COLORAO DE ESPOROS (Mtodo Bartolomew Mittwers)
MATERIAL
Safranina 0,25%; verde malaquita soluo saturada a 7,6%.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparar um esfregao no centro da lmina e deixa secar ao ar;
fxar na chama por 20 minutos x;
corar por 10 min com soluo de verde malaquita;
corar 15 seg com soluo de safranina;
lavar com gua destilada, escorrer e secar ao ar; e
observar em leo de imerso, objetiva de 100X.
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RESULTADO
Os esporos coram-se em verde e o resto da clula em vermelho.
COLORAO DE BAINHA (Mtodo Jenkins)
MATERIAL
Soluo de cristal violeta (0,1% em gua destilada)
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Coletar a amostra cuidadosamente homogeneizada e colocar uma
gota em uma lmina. Misturar com uma gota da soluo de cristal
violeta;
cobrir a lamina com lamnula; e
observar em leo de imerso, objetiva de 100X.
RESULTADO
As clulas fcam coradas de violeta escuro, enquanto as bainhas fcam
coradas de rosa claro.
QUESTES PARA RESPONDER:
1. Diferencie uma colorao simples de uma colorao diferencial.
2. Quais os objetivos da colorao de Gram?
3. Quais os principais cuidados que devem ser tomados com relao ao uso
do microscpio?
4. O que deve ser feito com os resduos produzidos no processo da
colorao?
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PLANILHA DE OBSERVAO
MATERIAL: ______________________________________________________
Observe as lminas e desenhe as caractersticas observadas, por exemplo,
forma, arranjo, colorao entre outros.
_________________ _________________ _________________
_________________ _________________ _______________
________________ ________________ __________________
OBSERVAES:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
REFERNCIAS
BARBOSA, H.R; TORRES, B.B. Microbiologia bsica. So Paulo: Ed. Atheneu,
1999.
BLACK, J.G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. Rio de Janeiro:
Editora Guanabara Koogan S.A., 2002, p.829.
BURTON, G.R.W.; ENGELKIRK, P.G. Microbiologia para as cincias da
sade. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1998, p.287.
COMPENDIUM of methods for the microbiological examination of foods.
3 ed. New York: American Public Health Association, 1992.
GRIST, N.R. Manual de biossegurana para o laboratrio. So Paulo: Livraria
Santos Editora, 1995, p133.
MAZA, L.M.L.; PEZZLO,M.T.; BARON, E.J. Atlas de diagnostico em
Microbiologia. Porto Alegre: Editora ArtMed, 2001.
NEDER, R.N. Microbiologia: manual de laboratrio. So Paulo: Editora
Nobel, 1992, p.138.
PELCZAR JR, M. J. Microbiologia: conceitos bsicos e aplicaes. V. 1, 2
a

Ed. So Paulo: Makron Books, 1996.
RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia prtica: roteiro e manual
bactrias e fungos. So Paulo: Editora Atheneu, 2002, 112p.
SILVA, N. et al. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos.
So Paulo: Editora Varela, 2007, p.536.
SOARES, JB.; CASIMIRO, ARS.; AGUIAR, LMB. Microbiologia: uma
abordagem prtica. Fortaleza: Universidade Federal do Cear, 1986, 194p.
60
SOUNIS, E. Curso prtico de Microbiologia. 2 Ed., Rio de Janeiro: Livraria
Atheneu Editora, 1989, p.267.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE C. L. Microbiologia. 6. ed. Porto
Alegre: Editora Artmed, 2000.
ANEXO 1
MICROSCOPIA DE BACTRIAS
Figura 5. Colorao de Gram de diferentes espcies bacterianas
(microscopia tica, aumento 1000X). Fonte: http://commons.wikimedia.
org/wiki/Category:Gram_stains, (PD-USGOV-HHS-CDC, Domnio livre);
Laboratrio de Microbiologia, DAQBI/UTFPR/Fotos tiradas nas aulas
prticas de Microbiologia
A. Pseudomonas aeruginosa B. Escherichia coli
C. Staphylococcus aureus
D. Streptococcus mutans
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E. Bacillus anthracis
F. Bacillus subtilis
G. Bifdobacterium adolescentis H. Clostridium perfrinfens
ANEXO 2
MICROSCOPIA DE FUNGOS
Figura 6. Hifas e corpos de frutifcao de fungos flamentosos: A. hifas
septadas; B. hifas cenocticas ou no-septadas; C. cabea conidial
(Aspergillus sp); D. cabea conidial (Penicillium sp); E. hifas cenocticas
e esporngio (Rhizopus); F. hifas e corpos de frutifcao (Fusarium sp)
(microscpio tico, aumento de 40X). Laboratrio de Microbiologia,
DAQBI/UTFPR/.Fotos tiradas nas aulas prticas de Microbiologia.
A
B
C
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F
Esta obra foi composta pela fonte Famlia Optima,
corpo 11 e em papel couche fosco 115g.