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Electroforesis
Qumica Analtica III
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Electroforesis
Es el proceso de migracin de molculas
cargadas en solucin en respuesta a un campo
elctrico.
Fuerza del campo (voltaje aplicado)
La carga neta
Tamao y forma de las molculas
Porosidad del gel
Fuerza inica, viscosidad y temperatura del
medio
Velocidad de migracin depende
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Fundamentos de Separacin
Electrofortica
Al hacer pasar corriente por la celda donde se
encuentra la muestra, los diversos componentes
se mueven a velocidades que dependen de las
cargas, tamaos y formas.
El resultado es una serie de bandas o lneas
separadas debidas a los componentes de la
muestra, evidenciadas por un sistema de
revelado.
Alta sensibilidad, resolucin y versatilidad.
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Tipos de Soportes usados en
Electroforesis
Papel (celulosa)
Almidn
Poliacrilamida (SDS-PAGE y PAGE)*
Agarosa*
Acetato de Celulosa
* Mas comnmente usados
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Poliacrilamida
Qumicamente inerte
Fcil formacin del gel por polimerizacin
de acrilamida
Soporte empleado frecuentemente (3.5
30 %)

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Electroforesis
Es usada para estudiar las propiedades de
especies cargadas simples y tambin como
tcnica de separacin.
(PAGE) Gel Nativo
SDS-PAGE (En condiciones desnaturalizantes
y/o reductoras)
Geles en Gradiente
Isoelectroenfoque (punto isoelctrico)
Electroforesis bidimensional
Tipos electroforesis
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Sistemas de Tincin ms comunes
Uso de colorantes (azul de Coomassie)
Tincin de plata
Por actividad enzimtica (zimogramas)
Deteccin de compuestos marcados con
compuestos fluorescentes (aplicada para
carbohidratos y protenas).
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Sistemas de Tincin ms comunes
Deteccin de protenas marcadas con
radiactividad
Para cidos nucleicos marcadores fluorescentes
(bromuro de etidio)
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Equipo Necesario
Fuente de poder
Cmara (vertical u horizontal)
2 electrodos
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Equipo Necesario
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Gel de electroforesis
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Gel Nativo (PAGE-poliacrilamida gel
electroforesis)
Se evala la movilidad de la protena en
estado nativo (sin reducir,
desnaturalizar).
Es importante para estimar la masa de
la protena en su estado nativo.
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SDS-PAGE (En condiciones desnaturalizantes y/o
reductoras)

Podemos conocer si la protena est compuesta
por subunidades.
Podemos estimar la masa molecular relativa con
las subunidades o protenas.
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Los puentes disulfuro (-
S-S-) que resulta de la
oxidacin de dos grupos
tiol correspondientes a
dos aminocidos
cistena.
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SDS-PAGE
En SDS-PAGE las
muestras como estn
negativamente
cargadas debido al
SDS, migraran hacia
el nodo (+)
Ctodo (-)
Anodo (+)
Aplicacin de la
muestra en
pozos
Cada banda indica
que es una protena
o cadena
polipeptdica (si es
SDS-PAGE) distinta
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SDS para separacin de protenas
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Ejemplos
geles
SDS-PAGE
Tincin Coomassie
SDS-PAGE
Tincin Plata
Azul de Coomassie
0.1 g de protena
Plata
0.02 g de protena
Estndares:
Protenas
de PM
conocido
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Isoelectroenfoque
Separacin de molculas basada en las
caractersticas de la carga molecular
Punto isoelctrico pH al cual la carga
neta de la molcula es igual a cero
En este pH, su movilidad electrofortica es nula
La corrida se realiza sobre un gel que
contiene un rango de pH, sobre el cual
migrara la protena es su estado nativo en
funcin de su carga
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Isoelectroenfoque
El isoelectroenfoque permite distinguir protenas que
difieren en su pI tan poco como 0.01 unidad, lo que
significa que una sola carga neta basta para separarlas
en el gel.
marcadores
de punto
isoelctrico
pI de la
muestra
Las muestras se cargan a la mitad del gel y migran de
acuerdo a su carga hasta pH que corresponde a punto
isoelctrico, donde ya no hay movilidad y se hacen
precipitar y se tien en este punto.
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Isoelectroenfoque
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Electroforesis bidimensional
El objetivo es la separacin de mezclas de
protenas altamente complejas.
Las protenas son separadas en un gel con
gradiente de pH.
Tras esta separacin por carga las protenas son
separadas de acuerdo con su masa molecular
en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
(SDS-PAGE).
Tras la tincin del gel las protenas aparecen
formando manchas circulares.
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Ejemplos
geles
Electroforesis bidimensional
Cada punto o
manchita (spot
en ingls)
indica que es
una protena o
cadena
polipeptdica
distinta
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Electroforesis bidimensional
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Ejemplos
geles
Electroforesis bidimensional
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Electroforesis de Carbohidratos
G4
G12
1
1 Man
5
GlcNAc
2
2 Man
4
GlcNAc
2
3 Man
9
GlcNAc
2
4 triantenario trisialilado (dos
silicos 2-3 y uno 2-6)
5 triantenario trisialilado (un
silico 2-3 y dos 2-6)

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3
4
5
Ejemplos
geles
Estndares:
unidades
producto de
la hidrlisis
de almidn
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Gel de Agarosa para DNA
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Ejemplos
geles
Geles de Agarosa
Bromuro de etidio
Estndares:
Pares de
bases
conocidos
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Anlisis de pureza
Determinacin de masa molecular de protenas
Verificacin de la concentracin de protenas
Deteccin de protelisis
Identificacin de protenas inmunoprecipitadas

La facilidad de relativa para efectuar esta tcnica
tiene muchas aplicaciones ya que se ha convertido
en una herramienta analtica en muchos campos
de investigacin.
Usos
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Primera etapa de la inmunotransferencia del
inmunoblot
Punto isoelctrico.
Nmero de cadenas polipeptdicas de una
protena
Identificacin y secuenciacin de protenas
Usos
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Una protena, en condiciones de composicin de amortiguador, pH y
temperaturas prximas a las condiciones fisiolgicas, presenta un peso
molecular, mediante medidas de equilibrio de sedimentacin de 140,000
g/mol. Cuando la misma protena se estudia por electroforesis en gel
con SDS en ausencia o presencia del agente reductor b-mercaptoetanol
(BME), se observan los patrones de los carriles A y B respectivamente. El
carril C contiene los estndares de peso molecular indicado. A partir de
esos datos, describa la protena nativa, en lo relativo a los tipos de
subunidades presentes, estequiometra de las subunidades y tipos de
enlaces que existen entre las subunidades