ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UN MICROAMBIENTE

OBJETIVOS.
Mediante el empleo de una columna de Winogradsky, el estudiante lograr:
Aplicar e interpretar los conocimientos de las diferentes tcnicas utilizadas para la
caracterizacin de microorganismos.
Diferenciar los grupos microbianos presentes en un microambiente.
omparar los microorganismos !ue crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos.
"elacionar la di#ersidad microbiana presente en un microambiente con algunas de sus
caracter$sticas fisiolgicas.
%&plicar las causas !ue originan la sucesin de microorganismos obser#ada.
INTRODUCCIN.
A diferencia de los estudios realizados por 'uis (asteur y "oberto )oc* sobre culti#os puros, dos
famosos microbilogos: +ergei ,. Winogradsky -./012.3045 y Martinus Willem 6ei7erinck -./0.2
.34.5, fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en un
mismo *bitat.
%l estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede realizarse fcilmente
en una columna de Winogradsky, la cual simula un microecosistema o microambiente !ue ilustra
cmo los microorganismos ocupan microespacios altamente espec$ficos de acuerdo con sus
necesidades #itales, tales como: re!uerimientos de carbono, energ$a y o&$geno, as$ como la
interdependencia, de forma tal !ue la acti#idad metablica de un microorganismo posibilita el
crecimiento de otros y #ice#ersa. %stas columnas, !ue lle#an el nombre del microbilogo ruso !ue las
utiliz por primera #ez, son sistemas completamente autoreciclables.
'as columnas de Winogradsky se preparan con muestras de suelo colectadas en ambientes
*8medos, las cuales son enri!uecidas con compuestos orgnicos e inorgnicos y finalmente son
e&puestas a una fuente de luz natural. %n ellas se obser#a !ue despus de 4 9 semanas de
incubacin aumenta la cantidad de los distintos tipos de microorganismos, mismos !ue de acuerdo
con sus caracter$sticas fisiolgicas se establecen en las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo
!ue se conoce como sucesin. De esta forma, el resultado es una columna estratificada -zonas de
diferente color5 tanto en el suelo como en el agua, donde cada estrato se relaciona con un proceso
!u$mico2biolgico.
%n la zona inferior de lodos se desarrollan organismos fermentadores !ue producen alco*ol y cidos
grasos como subproductos de su metabolismo. %stos productos de :desec*o: constituyen el sustrato
para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato, las cuales como resultado de su metabolismo
liberan sulfuros !ue difunden a la zona superior o&igenada creando un gradiente en el !ue se
desarrollan bacterias fotosintticas !ue utilizan el azufre.
(or encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias p8rpura !ue no utilizan el azufre y !ue
obtienen su energ$a de reacciones luminosas, pero !ue emplean cidos orgnicos como fuente de
carbono para su s$ntesis celular.
;inalmente, en la zona aerobia crecen las ianobacterias y algas las cuales como producto de su
metabolismo liberan o&$geno. <ambin pueden crecer bacterias !ue o&idan compuestos del azufre y
1
del nitrgeno *asta sulfatos y nitratos respecti#amente. <odos estos grupos sintetizan su materia
orgnica a partir del =>.

ACTIVIDADES GENERALES.
.. (reparar una columna de Winogradsky.
>. <omar muestras a distintos ni#eles de la columna para describir las #ariaciones en la
composicin microbiana a diferentes tiempos.
4. "elacionar la sucesin microbiana !ue se establece en la columna con los re!uerimientos
de carbono, energ$a, o&$geno y metabolismo a lo largo del tiempo, durante 0 semanas.
9. ?ntegrar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos del muestreo.
PREPARACIN DE LA COLUMNA (1 sesin).

M!e"i#
(or grupo:
9.@ g. de cada una de las siguientes sales minerales:
a=4 -o cscara pul#erizada de un *ue#o5
a+=9
aA(=9
(or mesa:
. balanza granataria.
(or los alumnos por mesa:
4@@ a 0@@g de muestra de suelo o barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o r$o
-sedimento superficial o subsuperficial5.
. 0@@ m' de agua de estan!ue, r$o o ase!u$a.
. recipiente alto de boca anc*a, de paredes trasparentes, rectas y sin bordes.
. yema de *ue#o cocido.
4 tornillos o cla#os de *ierro.
(apel peridico finamente cortado.
4 m de cordn de nylon o *ilo cBamo.
/ portaob7etos con muesca en uno de los e&tremos.
. #arilla de #idrio de apro&. >@ cm.
. esptula.
M$!%&%
.. olectar una cantidad de suelo, lodo o barro ricos en materia orgnica. "emo#er las piedras,
ramas o part$culas grandes del material en estudio.
>. Adicionar al suelo . g de cada una de las sales, el papel finamente cortado y el *ue#o
desmenuzado. Mezclar *asta *omogenizar completamente.
4. olocar la mezcla en un recipiente adecuado *asta ocupar .C4 del #olumen total. ompactar
el suelo con la ayuda de una esptula a fin de eliminar las burbu7as de aire -;ig. .5
2
>6. (ortaob7etos con
*ilo cBamo
>. ;orma en !ue deben
colocarse los portabob7etos
dentro de la columna
9. Mezclar la muestra de agua con el medio mineral en proporcin de .:..
0. ABadir la solucin anterior a la muestra de suelo *asta llegar a una altura de
apro&imadamente de 4 a 0 cm aba7o del borde. <ener cuidado de no resuspender la muestra
compactada, para ello inclinar la botella y resbalar el agua lentamente por las paredes.
1. Agitar la solucin con una #arilla de #idrio para eliminar burbu7as de aire -;ig .5.
D. "egistrar el aspecto final de la columna -color del sedimento y del l$!uido5.
/. <omar / portaob7etos y *acerles unas muescas -;ig. >A5. +obre ellas amarrar un e&tremo del
*ilo cBamo de tal forma !ue se pueda 7alar el portaob7etos con el otro e&tremo -figura >65.
3. olocar los / portaob7etos en una posicin #ertical a diferentes ni#eles, cuatro sobre el
sustrato inclinados contra la pared del recipiente de7ando !ue el e&tremo de *ilo suelto !uede
suspendido fuera de la botella y cuatro en los primeros .@ cm de la superficie. -;ig. >5.
.@. olocar dos cla#os -uno gal#anizado y uno no gal#anizado5 al fondo, sobre el sustrato
amarrados de un *ilo.
... Marcar el ni#el de agua y cubrir la boca de la botella con el plstico auto ad*erible. Aacer
algunas perforaciones para reducir la e#aporacin. (uede ser necesario reponer agua para
mantener el ni#el original.
.>. ?ncubar a temperatura ambiente ->0 a 4@E5 cerca de una #entana para !ue reciba
iluminacin.
'IGURA 1. ;orma de montar la columna de Winogradsky.
'IGURA (. +ecuencia de pasos para colocar los portaob7etos con muesca en la columna de
Winogradsky
3
+F%'=
AGFA
>A. (ortaob7etos
con muesca
A?"%
OBSERVACI)N DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA COLUMNA (( sesi*n)
PRIMERA SEMANA DE INCUBACIN

M!e"i#
(or mesa:
. 7uego de frascos goteros con los siguientes reacti#os colorantes:
Azul de metileno -.:.@@@@5
Herde de Ianus -.:4@@@5
Herde de metilo -.:.@@@@5
"o7o neutro -.:.@@@@5.
+olucin de "ingers y de ,olandJs
Alco*ol2cido actico -/:>5
(or e!uipo:
> pipetas graduadas de 0 .@ m'.
. pinzas largas de punta roma.
. microscopio.
. frasco gotero con aceite de inmersin.
. 7uego de colorantes de Gram.
. 7uego de colorantes #itales y para tincin simple.
(or los alumnos por mesa:
. marcador indeleble
/ portaob7etos con y sin muesca
/ cubreob7etos
> mec*eros
> propipetas.
> asas
. piseta
M$!%&%
.. =bser#ar la columna y registrar, en el cuadro ., los cambios f$sicos producidos con respecto al
aspecto inicial.
>. "emo#er dos portaob7etos -uno de la superficie y otro del fondo5. Dado !ue los
microorganismos pueden colonizar ambos lados de los portaob7etos, es necesario limpiar una
de sus carasK obser#ar los microorganismos sin teBir con los ob7eti#os de .@L y 9@L.
(osteriormente fi7ar con alco*ol2cido actico -/:>5 durante 0 minutos a temperatura ambiente
y teBir con azul de metileno o safranina. =bser#ar con el ob7eti#o de inmersin, es!uematizar
o fotografiar los microorganismos obser#ados y registrar en el cuadro >. (uede ser necesario
modificar las tcnicas de fi7acin y coloracin dependiendo del tiempo transcurrido. "ecordar
!ue las bacterias son los primeros organismos en colonizar los portaob7etos, seguidos por las
algas, los protozoarios y algunos in#ertebrados.
4. "eemplazar los portaob7etos muestreados por unos nue#os.
4
9. <omar muestras de los diferentes ni#eles de la columna, con una pipeta de #idrio, iniciando en
la superficie y terminando en la zona ms profunda. 'impiar la superficie de la pipeta con un
algodn impregnado con una solucin desinfectante y colocar la muestra en un tubo de
ensaye no estril.
0. Aacer al menos > preparaciones de cada una de las muestras. <ener cuidado de en7uagar la
pipeta con agua corriente entre las distintas tomas de muestra. Al finalizar depositarla en el
pipetero.
1. "ealizar de cada muestra una preparacin *8meda y una fi7a y teBida.
a5 (reparaciones *8medas: olocar una gota de muestra en un portaob7etos y colocar un
cubreob7etos. =bser#ar el tipo y la abundancia de los diferentes microorganismos, as$
como su mo#ilidad. +e recomienda este tipo de preparacin sin teBir cuando las
muestras proceden de la zona aerbica o superior, donde se encuentran con mayor
probabilidad algas, protozoarios y cianobacterias. %n la segunda preparacin colocar la
muestra, agregar una gota de alg8n colorante #ital y colocar el cubreob7etos.
b5 (reparaciones fi7as y teBidas: <omar una gota de muestra y realizar un frotis, teBir con
Gram o con tincin simple. =bser#ar al microscopio.
D. "egistrar y es!uematizar en el cuadro > los distintos tipos de microorganismos obser#ados.
OBSERVACI)N DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA COLUMNA (+ sesin)
SEGUNDA SEMANA DE INCUBACIN , SUBSECUENTES
M!e"i#
(or mesa:
+e ocuparn los mismos materiales indicados en la segunda sesin.
(or los alumnos por mesa -esterilizar para la siguiente clase5:
. tubo de .1 L .0@ con 3 m' de solucin salina isotnica -++?5.
M$!%&%
.. A partir de la tercera sesin y subsiguientes, repetir el procedimiento indicado en los incisos .
a 4 indicados en la segunda sesin.
>. "egistrar y es!uematizar los cambios f$sicos de la columna, as$ como los distintos tipos de
microorganismos -emplear copias de los cuadros . y >5.
4. omparar los es!uemas e identificar los cambios f$sicos !ue tienen lugar en la columna a lo
largo del tiempo y describir la sucesin de los microorganismos.
9. %n la cuarta semana se efectuar el estudio de nutricin y di#ersidad fisiolgica. -.@.. y .@.>5
5
REGISTRO DE RESULTADOS
CUADRO 1. =bser#aciones f$sicas de la columna de Winogradsky durante 0 semanas de
incubacin.
Se-n .%n &e #
/%#0-n
O1se"2/i%nes (se&i-en!/in, /%#%" 0ni3%"-e % 4"esen/i
&e 1n&s, 3%"-/in &e 10"105s, %#%" /"/!e"6s!i/%7, e!/.)
.
>
4
9
0
Mpor e7emplo olor a *ue#o podrido, etc.
6
CUADRO (. =bser#aciones microscpicas de las primeras tres semanas de incubacin de la
columna de Winogradsky.
"e!uerimientos de
=&$geno
Nona de la
olumna
<ipo de
organismos
obser#ados
Morfolog$a <incin de
Gram
.
%s!uemas
>
.
+lo bacterias.
>
+e pueden poner 8nicamente los n8meros de las imgenes y por separado colocar los es!uemas o fotos de los organismos
obser#ados.
7
Nona
aerobia
Nona
anaerobia
CUADRO +. aracter$sticas microscpicas y fisiolgicas de los microorganismos presentes en la
columna de Winograsky despus de la cuarta semana de incubacin -omplementar con .@.. y .@.>5
"e!uerimientos
de =&$geno
Nona de
la
olumna
<ipo de
organismos
obser#ados
Gnero
representati#o
Morfolog$a y
<incin de
Gram
.
%s!uemas
>
aracter$sticas
fisiolgicas
4
.
+lo bacterias.
>
+e pueden poner 8nicamente los n8meros de las imgenes y por separado colocar los es!uemas o fotos de los organismos
obser#ados.
4
(or e7emplo presencia de organismos amilol$ticos, fi7adores de nitrgeno, solubilizadores o mineralizadores de fsforo, etc.
NUTRICIN MICROBIANA , RE8UERIMIENTOS DE O9:GENO
"am$rez2Gama, ".M., Mart$n, "., <suzuki2"eyes, G., %s!ui#el2ote, "., Frz8a Aernndez, M. del .,
%scudero2Garc$a, %. y Merlo2"obledo A.'.

OBJETIVOS
Determinar las caracter$sticas nutricionales en una poblacin mi&ta considerando las fuentes
de carbono energ$a y nitrgeno.
Determinar los re!uerimientos de o&$geno en una poblacin mi&ta mediante la comparacin
con cepas de referencia.
INTRODUCCIN
'a nutricin es el proceso por el cual los seres #i#os toman del medio donde *abitan, los compuestos
!u$micos !ue necesitan para lle#ar a cabo sus procesos energticos y biosintticos !ue les permiten
crecer y reproducirse.
8
Nona
aerobia
Nona
anaerobia
%n general los re!uerimientos nutricionales y de o&$geno de cada grupo microbiano estn
$ntimamente relacionados con el ambiente natural en !ue se desarrollan.
%n primer lugar necesitan una fuente de energ$a, la cual pueden obtener de una fuente luminosa
-fottrofos5 o mediante la o&idacin de compuestos !u$micos -!uimitrofos5K esta 8ltima categor$a se
di#ide en, !uimiolittrofos -o&idacin de compuestos inorgnicos5 y !uimiorgantrofos -o&idacin de
compuestos orgnicos5. As$ mismo, de acuerdo a la fuente de donde obtienen el carbono se clasifican
en auttrofos -utilizan => y carbonatos5 y *etertrofos -utilizan compuestos orgnicos5. "especto a
la fuente de nitrgeno, la obtienen a partir de aminocidos o nitrgeno inorgnico en diferentes
estados de o&idacin incluyendo el nitrgeno molecular. 'a capacidad de reducir el dinitrgeno
atmosfrico es e&clusi#a de algunos microorganismos procariotes a los !ue se les denomina fi7adores
de nitrgeno.

%l grupo bacteriano es, desde el punto de #ista estructural, el ms simple de los microorganismos
-procariotes5K no obstante, fisiolgicamente es el ms comple7o y este es el 8nico en el !ue se
encuentran todos los tipos nutricionales descritos. 'as algas se caracterizan por ser fottrofas y
auttrofas, en tanto !ue los *ongos y protozoarios por ser !uimiorgantrofos.
%n lo !ue respecta a sus re!uerimientos de o&$geno, los microorganismos son muy #ariados en
cuanto a la necesidad o tolerancia de esta molcula y se les clasifica como: aerobios estrictos
-a!ullos !ue crecen de manera obligada en presencia de tensiones normales de o&igeno o
condiciones &icas5K microaerfilicos -los !ue crecen en tensiones de => menores a las del aire o
condiciones micro&icas5K facultati#os -los !ue crecen de acuerdo a las condiciones !ue pre#alezcan
en su *bitat, &icas o an&icas5K anaerobios estrictos -a!ullos !ue no re!uieren de este elemento
para su desarrollo, y la presencia de => origina la in*ibicin o incluso su muerte5 y los aerotolerantes
-estos toleran el => y crecen en su presencia aun!ue no puedan usarlo5.
%n esta prctica el muestreo se efectuar a partir de una columna de Winogradsky la !ue constituye
una demostracin clsica de cmo los microorganismos ocupan micro espacios altamente espec$ficos
de acuerdo con sus re!uerimientos de energ$a, carbono, nitrgeno y o&$geno.
1 Sesin (In%/0#/in &e /e4s &e "e3e"en/i ; -0es!"s 4"%1#e-)
M!e"i#
Material por grupo:
olumna de Winogradsky
epas de referencia en medios de culti#o l$!uido:
Pseudomonas aeruginosa
Micrococcus luteus
Enterobacter sp
Escherichia coli
Clostridium sp.
Streptococcus sp
6aBo Mar$a a 0@O
?ncubadora a 4DE
?ncubadora a >/E
> 7arras de anaerobiosis
> pa!uetes de Gas (ac)
9
Material por e!uipo:
Micropipeta automtica para .@@ P' con puntas estriles -.@@ P'5
(ipeta graduada de .@ m' despuntada
<ubos de ensaye de.1&.0@ con tapn de rosca con .@ m' de Medio mineral con las
siguientes #ariaciones:
. sin fuente de
. con carbonatos
. con glucosa.
. con sacarosa
. con almidn
. con celulosa.
<ubos de ensaye de.1&.0@ con tapn de rosca con .@ m' de As*bey con las siguientes
#ariaciones
. sin manitol y con amonio
. sin manitol y con nitrato de potasio
. con manitol libre de nitrgeno
. con manitol y amonio
. con manitol y nitratos
. con manitol y peptona
. con manitol y case$na
<ubos de ensaye de .0&.>@ con tapn de rosca con D m' de medio fluido de tioglicolato
<ubos de >> & .D0 con Agar de 6reQer
Material !ue deben tener los alumnos:
Mec*eros
Asas
Gradillas
(ipetero
> (ipetas graduada . m' o pipetas (asteur
. (ipeta de .@.@ m' despuntada estril
. tubo de .1 &.0@ estril
. tubo de .1 & .0@ con 3.@ m' de solucin salina isotnica -++?5
. tubo de .1 & .0@ con 3.3 m' de solucin salina isotnica -++?5 estril
. <ubo de >> L .D0 con >@.@ m' de ++? estril
> ca7as de (etri estriles
M$!%&%
(reparacin de material
.. "otular todo el material.
>. ;undir los medios de Agar Anaerbico de 6reQer *asta su disolucin total y la reduccin del
indicador azul de metileno, conser#ar en baBo de agua a 0@E .
4. +ometer a ebullicin los dos tubos con caldo <ioglicolato *asta la reduccin -obser#ar el
indicador de resarzurina5.
9. olocar los tubos en una gradilla y de7ar enfriar, teniendo cuidado de no agitarlos.
10
=btencin de la muestra a partir de la columna de Winogradsky
0. =btener una muestra de la zona aerobia -superficial5, microaeroflica -media superior5,
facultati#a -media inferior5 o anaerobia -fondo5 de la columna de Winogradsky. (ara ello
introducir la pipeta despuntada -.@ m'5, comenzando con la zona superficial. Ftilizar una
pipeta para cada zona, teniendo cuidado de blo!uear la entrada del l$!uido *asta !ue alcance
la profundidad en la !ue se tomar la muestra y de la#ar con agua estril la superficie antes
de liberar la muestra en el contenedor estril, esto con ob7eto de eliminar especies de zonas
diferentes a la de inters.
1. ?nocular un tubo con 3 m' de ++? estril con . m' de la muestra y *omogeneizar la
suspensin. -#. figura .A5.
?noculacin para establecer re!uerimientos nutricionales -#. figura .65:
D. ?nocular, con ayuda de la micropipeta, .@@ P', de la suspensin en cada uno de los tubos con
los medios indicados en el cuadro ..
NOTA< %#itar tocar los medios de culti#o con la punta de la micropipeta.
/. ?ncubar de acuerdo a las indicaciones del cuadro ..
CUADRO 1 Me&i%s &e /0#!i2% ; /%n&i/i%nes &e in/01/in 4" es!1#e/e" #%s "e=0e"i-ien!%s
n0!"i/i%n#es
MEDIO MINERAL MEDIO DE AS>BE, CONDICIONES DE
INCUBACIN la#e ;uente de carbono la#e ;uente de carbono
A 2 M . ),=4 <emperatura
ambiente
4 semanas
'uz natural
6 =4
R
M > ,A9l >/E
4 semanas
Glucosa 4 2 >/E de 9/ *oras a
D d$as D +acarosa 9 ,A9l
% Almidn 0 ),=4
; M elulosa 1 (eptona
M ?ncubar durante 4 semanas
N%!< Medios . y > carentes de manitolK medios 4 a 1 con manitol
?noculacin para establecer re!uerimientos de o&$geno -#. figura .5:
Agar para anaerobios
3. olocar por duplicado.@@ P' de la muestra de la zona !ue corresponda en una ca7a de (etri
#ac$a y estril.
.@. Herter en cada una de las ca7as el medio de culti#o pre#iamente fundido y a una temperatura
de 90E , *omogeneizar y de7ar solidificar
... ?ncubar una ca7a en condiciones aerbicas y la otra en condiciones anaerbicas a >/E
durante 9/ *oras.
Tioglicolato fluido
.>. ?nocular con .@@ S' de la cepa de referencia, un tubo con 3.3 m' de ++? estril, y
*omogeneizar la suspensin.
11
.4. ?nocular cada uno de los tubos con el culti#o bacteriano control o con la muestra de la zona
!ue corresponda de la columna, para ello usar pipetas (asteur depositando la muestra *asta
el fondo del tubo.
NOTA< (ara inocular Clostridium sp. ser necesario obtener la muestra del fondo del tubo, y e#itar
agitar el culti#oK del mismo modo depositar la muestra en el fondo del tubo a inocular. %ste
procedimiento deber realizarse rpidamente.
.9. ?ncubar las muestras de la columna a >/E y las cepas de referencia a 4DE
'i?0" 1. ?noculacin para establecer re!uerimientos nutricionales y de o&$geno
2. Sesin. Requerimientos nutricionales y requerimientos de oxgeno
M!e"i#
Material por grupo
9 ;rascos goteros con solucin A -"eacti#o de Griess5
9 ;rascos goteros con solucin 6 -reacti#o de Griess5
9 ;rascos goteros con reacti#o de ,essler
Ninc en pol#o
Material por e!uipo
. microscopio
12
. 7uego de reacti#os para tincin de Gram
Material !ue deben tener los alumnos:
Mec*eros
Asas
Gradillas
(ipetero
(ortaob7etos
D pipetas de ..@ m' estriles o (asteur con bulbos de goma
M$!%&%
Requerimientos nutricionales
.. =bser#ar la turbidez desarrollada en los diferentes medios de culti#o y registrar los
resultados en los cuadros > y 9.
>. Aacer una tincin de Gram de cada uno de los tubos con desarrollo y registrar sus
resultados en el cuadro 4 y 1.
4. ?ncubar nue#amente los tubos en los !ue no *aya registrado desarrollo en las mismas
condiciones por 0 d$as ms. uando se obser#e turbiedad proceder a:
9. "e#elar la presencia de amonio en los tubos ., 4 y 0 a D y de nitritos en los tubos >, 4 y 9,
para ello
0. <omar una pe!ueBa muestra de cada tubo con una pipeta estril y transferirla a dos
portaob7etos
a5 Amonio. %n uno de los portaob7etos agregar una gota del reacti#o de ,essler. +i se
obtiene un color amarillo2naran7a la prueba re#elar la presencia de amonio en el
medio.
b5 ,itritos. %n el segundo portaob7eto agregar una gota del reacti#o A de Griess y una
gota del reacti#o 6. 'a presencia de nitritos se e#idencia con el desarrollo de un color
ro7o. %n caso de no obtener color, agregar una pizca de pol#o de zinc. 'a aparicin de
un color ro7o demostrar la o&idacin se lle# a cabo *asta nitratos. %n el caso de !ue
contin8e incoloro despus de la adicin del zinc, la prueba se registrar como negati#a.
1. "egistrar los resultados en el cuadro 9.
Requerimientos de oxgeno
.. De manera grupal comparar el crecimiento de las muestras de la columna inoculadas en el
medio Agar anaerbico de 6reQer e incubadas en condiciones aerobias y anaerobias y
registrar los resultados en el cuadro D.
>. "e#isar el crecimiento en cada uno de los tubos a las 9/ *oras de incubacin y registrar el
desarrollo en cada uno de ellos en el cuadro /.
+ Sesin. Re=0e"i-ien!%s n0!"i/i%n#es
Material por grupo
4 Frascos goteros con solucin A (Reactivo de Griess)
4 Frascos goteros con solucin B (reactivo de Griess)
4 Frascos goteros con reactivo de Nessler
13
Zinc en polvo
Material por equipo
. microscopio
. 7uego de reacti#os para tincin de Gram
Material !ue deben tener los alumnos:
Mec*eros
Asas
Gradillas
(ipetero
(ortaob7etos
D pipetas de ..@ m' estriles o (asteur con bulbos de goma
Re=0e"i-ien!%s n0!"i/i%n#es
.. =bser#ar el desarrollo en los tubos incubados durante 4 semanas -#er cuadro .: A, 6, . y >5 y
registrar sus resultados en los cuadros > y 9.
>. "e#elar la presencia de amonio y nitritos en los tubos con turbiedadK para ello:
4. <omar una pe!ueBa muestra de cada tubo con una pipeta estril y transferirla a dos
portaob7etos
a. Amonio. %n uno de los portaob7etos agregar una gota del reacti#o de ,essler. +i se
obtiene un color amarillo2naran7a la prueba re#elar la presencia de amonio en el medio.
b. ,itritos. %n el segundo portaob7eto agregar una gota del reacti#o A de Griess y una gota
del reacti#o 6. 'a presencia de nitritos se e#idencia con el desarrollo de un color ro7o. %n
caso de no obtener color, agregar una pizca de pol#o de zinc. 'a aparicin de un color
ro7o demostrar la o&idacin se lle# a cabo *asta nitratos. %n el caso de !ue contin8e
incoloro despus de la adicin del zinc, la prueba se registrar como negati#a.
9. "egistrar los resultados en el cuadro 9
Res0#!&%s &e ne/esi&&es &e 30en!e &e /"1%n% ; ene"?6
.. "egistrar en el cuadro 4 el desarrollo obser#ado en los diferentes medios de culti#o de
acuerdo al tiempo de incubacin indicado.
>. %s!uematizar las obser#aciones microscpicas.
CUADRO (. C"e/i-ien!% -i/"%1in% en -e&i%s &e /0#!i2% /%n &i3e"en!es 30en!es &e /"1%n%.
Nona de la columnaTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
M%D?= M?,%"A'
<iempo de incubacin -d$as5 lasificacin con base
en:
> D >. ;uente de
carbono
;uente de
energ$a
DesarrolloMM
A +in carbono ,D ,D
6 arbonatos ,D ,D
Glucosa
14
D +acarosa
% Almidn
; elulosa ,D ,D
,D R ,o determinado
MMUUU R abundante, UU R medio, U R escaso, 2 R sin desarrollo.
CUADRO +. Ti4% &e 1/!e"is &i3e"en!es !ie-4%s &e in/01/in
M%D?= M?,%"A'
<iempo de incubacin -d$as5
> D >.
Morfolog$a y Gram
A +in carbono ,D ,D
6 arbonatos ,D ,D
Glucosa ,D
D +acarosa ,D
% Almidn ,D
; elulosa ,D ,D
Res0#!&%s &e 30en!es &e ni!"?en% ; s0s !"ns3%"-/i%nes
.. "egistrar en el cuadro 9 el desarrollo obser#ado a los diferentes tiempos de incubacin.
>. ?dentificar los cambios en el ciclo del nitrgeno. Determinar los grupos fisiolgicos presentes
en la muestra y registrarlos en el cuadro 0.
4. %s!uematizar las obser#aciones !ue resultaron de las tinciones. "egistrar las caracter$sticas
morfolgicas y de Gram en el cuadro 1.
CUADRO @ C"e/i-ien!% -i/"%1in% en -e&i%s &e /0#!i2% /%n &i3e"en!es 30en!es &e ni!"?en%.
Nona de la columnaTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
M%D?= D%
A+A6%V+
<iempo de incubacin -d$as5
> D >.
Desarrollo Amoni
o
,itritos Desarrollo Amoni
o
,itritos Desarrollo Amoni
o
,itritos
. ,=4
R
sCm ,D ,D ,D ,D ,D ,D ,D
> ,A9
U
sCm ,D ,D ,D ,D ,D ,D ,D
4 +in ,
cCm
,D ,D ,D
9 ,A9
U
cCm
,D ,D ,D ,D ,D
0 ,=4
R
cCm
,D ,D ,D ,D ,D
1 (eptona
cCm
,D ,D ,D ,D ,D ,D ,D
15
,D R ,o determinado
Desarrollo: UUU R abundante, UU R medio, U R escaso, 2 R sin desarrollo.
Amonio U o W
,itritos U o 2
CUADRO A G"04%s 3isi%#?i/%s /%n 1se en #s !"ns3%"-/i%nes &e ni!"?en%.
Nona de la columnaTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
M%D?= D%
A+A6%V+
(resencia <ransformaciones Grupo fisiolgico
,A9
U
,=>
2
,=4
2
. ,=4
2
sCm ,D ,D
> ,A9
U
sCm
,D
4 +in ,
cCm
9 ,A9
U
cCm
,D
0 ,=4
2
cCm
,D ,D
1 (eptona
cCm
,D ,D
CUADRO B. Ti4% &e 1/!e"is &es""%##&s en e# -e&i% &e AsC1e;s &i3e"en!es !ie-4%s &e
in/01/in
M%D?= M?,%"A'
<iempo de incubacin -d$as5
> D >.
Morfolog$a y Gram
. ,=4
2
sCm ,D ,D
> ,A9
U
sCm ,D ,D
4 +in , cCm ,D
9 ,A9
U
cCm ,D
0 ,=4
2
cCm ,D
1 (eptona cCm ,D ,D
Res0#!&%s &e "e=0e"i-ien!%s &e %D6?en%
.. omparar el crecimiento de las muestras procedentes de las columnas inoculadas en el agar
anaerbico de 6reQer incubados en condiciones aerobias y anaerobias y registrar en el
cuadro D.
>. "e#isar el crecimiento en cada uno de los tubos de caldo fluido de tioglicolato a las 9/ *oras
de incubacin y registrar los resultados en el cuadro /.
4. %s!uematizar las obser#aciones !ue resultaron de las tinciones.
16
C0&"% E. Des""%##% -i/"%1in% en A?" &e B"eFe"
.%n &e # /%#0-n Ae"%1i%sis Ane"%1i%sis
Nona alta
Nona intermedia alta
Nona intermedia ba7a
Nona profunda
Desarrollo: UUU R abundante, UU R medio, U R escaso, 2 R sin desarrollo.
C0&"% G. Des""%##% -i/"%1in% &e #s -0es!"s 4"%/e&en!es &e # /%#0-n &e Hin%?"&sI;
; /e4s &e "e3e"en/i in%/0#&s en !i%?#i/%#!% 3#0i&%
Nona de la columnaTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Zona
de la columna o
microorganismo control
Presencia
del desarrollo a lo largo
del tubo
Clasifcacin
Nona alta
Nona intermedia alta
Nona intermedia ba7a
Nona profunda
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter sp
Microccus luteus
Streptococcus sp
Clostridium sp
Determinacin de Amonio.
%l amonio reacciona en condiciones alcalinas con yoduro merc8rico dipotsico -"eacti#o de
,essler para formar un precipitado naran7a.
Ag? )?
) Ag ?
) Ag ?
)=A ,A
Ag
= ,A ? ) ? A =
> U
> 9
> 9
U U
4
>
-
>
5
U
D
U
>
>
-anaran7ado5
-.5
->5
17
Determinacin de nitritos y nitratos
"educcin de nitratos
,=
,=
,= ,
=
,
4
2
>
2
> >
%l nitrito reacciona con dos reacti#os: cido sulfan$lico y dimetil2X2naftilamina. 'a reaccin de color se
debe a la formacin de un compuesto diazonio, Y2sulfobenceno2azo2X2naftilamina
D%<%"M?,A?Z, D% ,?<"?<=+
,A
+=
A,=
,
+= A A
,
A
=
,A
+= A
, ,
,A
A
=
>
4
U >
4
U
>
U
>
4 >
U >
[cido sulfan$lico
-incoloro5
[cido
nitroso
[cido sulfan$lico diazotizado
-sal de diazonio5

2naftilamina
-incolora5
Acoplamiento
p2sulfobenceno2azo22naftilamina
-colorante ro7o azo *idrosoluble5
18
uando la prueba resulta negati#a para nitritos se utiliza la prueba de zinc para reducir !u$micamente
a los nitratos presentes a nitritos y formar con los reacti#os de Griess el compuesto colorido.
Dis4%si/in &e &ese/C%s
.. Herter los desec*os de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
>. Herter los desec*os del reacti#o de ,essler y Griess en los frascos dispuestos para este fin.
4. Despus de usar los portaob7etos sumergirlos en una solucin desinfectante durante .@
minutos, la#ar con detergente, en7uagar y colocarlos en un frasco con alco*ol al 30\
9. %sterilizar el material de #idrio en el !ue prepar sus suspensiones y realiz sus lecturas y
posteriormente la#ar.
0. +ellar con maskin2tape las ca7as de (etri de plstico !ue contengan culti#os y colocarlas en el
contenedor ubicado en el laboratorio . A.
Dis/0sin &e "es0#!&%s
.. %&plicar la funcin de los siguientes nutrientes: carbono, nitrgeno y o&$geno.
>. on base en la fuente de carbono !ue tipo de microorganismos identific en las muestras de la
columna y cul fue el medio de culti#o !ue le permiti identificarlos.
4. on base en la fuente de energ$a !ue tipo de microorganismos identific en las muestras de la
columna y cul fue el medio de culti#o !ue le permiti identificarlos.
9. ?ndicar las transformaciones -con reacciones5 de nitrgeno !ue se lle#an a cabo en los siguientes
medios de culti#o:
a5 +in nitrgeno
b5 on cloruro de amonio
c5 on nitrato de potasio
d5 on prote$nas
0. ?ndicar los grupos fisiolgicos !ue lle#an a cabo las transformaciones anteriores.
1. ]A !u se refiere la di#ersidad nutricional^
D. ]_u es un ambiente de crecimiento rico y cmo lo e&plotan los microorganismos^
/. %&plicar por !u el o&$geno 7uega un papel comple7o en el metabolismo microbiano.
3. %&plicar las distintas relaciones !ue tiene el o&$geno con los siguientes tipos de microorganismos:
aerobios estrictos, microaerof$licos, facultati#os, anaerobios aerotolerantes y anaerobios obligados.
Li!e"!0" "e/%-en&&
Atlas, ".M. .33@. Microbiolog$a. ;undamentos y Aplicaciones. %+A, +.A. de .H., M&ico. //D pp.
Atlas, ".M. y 6art*a, ". >@@>. %colog$a microbiana y Microbiolog$a ambiental. (earson %ducacin,
+. A. %spaBa.
Madigan, M.<., Martinko, I.M., Dunlap, (.H. y larck D.(. >@@3. 6rock. 6iolog$a de los
Microorganismos. (earson %ducacin, +. A. %spaBa.
DIVERSIDAD 'ISIOLGICA.
OBJETIVOS.
Al finalizar este e7ercicio el estudiante ser capaz de:
19
Determinar las caracter$sticas fisiolgicas de algunos microorganismos presentes en la
columna de Winogradsky.
Diferenciar los re!uerimientos de o&$geno de microorganismos procedentes de una poblacin
mi&ta.
"elacionar las caracter$sticas fisiolgicas obser#adas con la zona de muestreo de la columna
INTRODUCCIN.
'as bacterias y ar!ueas son microorganismos !ue presentan una di#ersidad metablica asombrosa,
la cual es mantenida por la dependencia !ue e&iste entre los microorganismos y su ambienteK es
decir, las acti#idades de unos microorganismos fa#orecen el crecimiento de otros, pero tambin
ocurre !ue los productos metablicos de unos in*iben el desarrollo de otros.
%n la primera situacin, se encuentra el cometabolismo de los microorganismos pertenecientes a los
ciclos biogeo!u$micos, en los cuales la mineralizacin o solubilizacin de un elemento, as$ como la
o&idacin o reduccin del mismo dependen adems de las condiciones ambientales.
'a solubilizacin se define como la transformacin de un compuesto de una forma insoluble
generalmente inorgnica a otra soluble en agua y por lo tanto disponible para los organismos y la
mineralizacin se refiere a la transformacin de un compuesto en su forma orgnico a una
inorgnica.
omo se mencion anteriormente, estas transformaciones se lle#an a cabo mediante reacciones de
&ido reduccin de elementos como el nitrgeno, azufre, etc., es por ello !ue algunas de ellas se
realizan en condiciones aerobias o anaerobias.
Dependiendo de su ma!uinaria enzimtica, los microorganismos pueden emplear un elemento en
alguna de las formas en !ue se encuentran en la naturaleza.
(or e7emplo, apro&imadamente un /@\ de las molculas de la atmsfera de la tierra estn *ec*as
de dos tomos de nitrgeno !ue estn unidos entre s$, -,>5, sin embargo en esta forma slo es
accesible a un con7unto muy restringido de formas de #ida, como las cianobacterias y las
azotobactericeas. 'os organismos fotoauttrofos -plantas o algas5 re!uieren por lo general nitrato
-,=4
W
5 como forma de ingresar su nitrgenoK los *etertrofos -p. e7. los animales5 necesitan el
nitrgeno ya reducido, en forma de radicales amino, !ue es como principalmente se presenta en la
materia #i#a.
%n el caso del fsforo, la mayor$a de este elemento se encuentra en las rocas y en el suelo. Adems
muc*os de los fosfatos de la corteza terrestre son insolubles en el agua lo !ue *ace !ue su
disponibilidad no sea la ms adecuada para los seres #i#os. De esta forma, durante el ciclo del
fosforo se produce la mineralizacin del fsforo, la solubilizacin de las formas insolubles as$ como la
asimilacin de los fosfatos inorgnicos.
'as condiciones !ue fa#orecen la mineralizacin del fsforo son: un sustrato carbonado degradable y
la presencia de nitrgeno. %n lo !ue se refiere a la solubilizacin, el fsforo se encuentra en continuo
mo#imiento desde su forma soluble a depsito de fsforo. %ste proceso es realizado 8nicamente por
bacterias auttrofas !ue son las mismas !ue inter#ienen en el paso de ion amonio a cido n$trico y el
paso de azufre reducido a cido sulf8rico. ;inalmente, la asimilacin se refiere a la transformacin
del fsforo inorgnico a fsforo orgnico a tra#s de diferentes seres #i#os -en el agua las algas
lle#an a cabo se absorcin, en el suelo las bacterias se encargan de su fi7acin5
20
%n lo !ue respecta al azufre, este elemento es abundante a lo largo de la corteza terrestre. +e
encuentra disponible como sulfato soluble o en compuestos orgnicos. %n la biosfera se produce la
reduccin del azufre a A>+ por obra de microorganismos. 'a reaccin de o&idacin de la forma
reducida a sulfato es usada por bacterias anaerbicas para el metabolismo.
%l azufre forma parte de incontables compuestos orgnicosK algunos de ellos llegan a formar parte de
prote$nas. 'as plantas y otros productores primarios lo obtienen principalmente en su forma de ion
sulfato -+=9
2>
5. %stos organismos lo incorporan a las molculas de prote$na, y de esta forma pasa a
los organismos del ni#el trfico superior. Al morir los organismos, el azufre deri#ado de sus prote$nas
entra en el ciclo del azufre y llega a transformarse para !ue las plantas puedan utilizarlos de nue#o
como ion sulfato.
%n el caso de los metabolitos !ue in*iben el crecimiento de otros, esta interaccin recibe el nombre
de antagonismo o antibiosis.
Antibiosis se define como la produccin por parte de un microorganismo de sustancias t&icas para
otros microorganismos, las cuales act8an en ba7as concentraciones -menores a .@ ppm.5. %sta
interaccin *a sido ampliamente estudiada y su antecedente ms importante data del descubrimiento
fortuito de la penicilina. Actualmente la mayor parte de los antibiticos utilizados son producidos por
bacterias u *ongos del suelo.
OBSERVACIN ; ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD 'ISIOLGICA DE MICROORGANISMOS
PRESENTES EN LA COLUMNA (A sesin).
MATERIAL
ulti#os puros de las siguientes bacterias:
Bacillus sp
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Streptomces sp
(or mesa -#er uadro 15:
> tubos de ensaye de .1 & .0@ #ac$os estriles
> pipetas de .@ m' estriles
9 pipetas (asteur estriles
(or los alumnos por mesa:
> mec*eros
> asas
. marcador indeleble
. tubo de ensaye de .1 & .0@ #ac$o estril
. pipeta graduada de .@ m' estril
. pipeta (asteur estril
. #arilla de #idrio en `'a estril
CUADRO B. Material y acti#idades a realizar para la caracterizacin fisiolgica de bacterias
presentes en la columna de Winogradsky.
Material por mesa Acti#idad por e!uipo
> placas de %M6
> placas de Agar sal manitol
> tubos con 6A? fundido
Microorganismos degradadores de:
2 lactosa
2 manitol
(roduccin de sustancias antimicrobianas
21
> placas de 'ec*e descremada
> placas de Agar2almidn
> placas de "amos allao con lecitina
> placas de ramos callao con fsforo precipitado
(resencia de microorganismos:
2 (roteol$ticos
2 Amilol$ticos
2 Mineralizadores de (
2 +olubilizadores de (
> placas con Agar2'ipman
> tubos con medio para amonificantes
> tubos con medio para desnitrificantes
(resencia de microorganismos:
2 ;i7adores de ,
2 Amonificantes
2 Desnitrificantes
> tubos con medio para o&idantes de +O
> tubos con medio para reductores de +=9
R
(resencia de microorganismos:
2 =&idantes de +O
2 "eductores de +=9
R
MJTODO
Di#ersidad morfolgica en la columna
.. <omar una al$cuota del l$!uido superficial de la columna, con una pipeta estril y
transferirla a un tubo #ac$o estril -muestra .5
>. <omar una al$cuota del sedimento de la columna, con otra pipeta estril y transferirla al
>O tubo #ac$o estril -muestra >5.
4. %fectuar la obser#acin de preparaciones en fresco procedentes de las muestras . y >.
4. "egistrar las obser#aciones en el cuadro >.
(resencia de microorganismos degradadores de lactosa y manitol.
a5 on una pipeta (asteur tomar una gota de la muestra . y colocarla en el centro de cada una
de las placas de %M6 y M+A.
b5 %&tender con #arilla de #idrio en `'a estril.
c5 "epetir el procedimiento con la muestra >. ;lamear la #arilla antes de ser usada nue#amente.
d5 De7ar !ue se absorba el inculo en las placas y despus in#ertirlas.
e5 ?ncubar a >/E y re#isar a las >9 y 9/ *oras.
(roduccin de sustancias antimicrobianas.
a5 olocar @..m' de la muestra . en una ca7a de (etri y @..m' de la muestra > en la segunda
ca7a.
b5 Herter el agar 6A? fundido en cada ca7a y de7ar solidificar.
c5 <razar . estr$a recta en la superficie del medio con cada uno de los siguientes
microorganismos: Bacillus subtilis, Streptomces sp., Micrococcus luteus, Escherichia coli
-;ig. 95
d5 "epetir el procedimiento con la otra placa!
e5 De7ar !ue se absorban los culti#os en las placas y despus in#ertirlas.
f5 ?ncubar a >/E y re#isar a las >9 y 9/ *oras.
22
'IGURA @. (roduccin de sustancias antimicrobianas. Distribucin de las estr$as de siembra.
(resencia de microorganismos proteol$ticos, amilol$ticos, mineralizadores y solubilizadores de (.
a5 <omar una gota de la muestra ., con una pipeta (asteur y colocarla en el centro de cada una
de las placas de Agar lec*e descremada, Agar almidn, "amos allao con lecitina y con
fsforo precipitado.
b5 %&tender con #arilla de #idrio en `'a estril.
c5 "epetir el procedimiento con la muestra >. ;lamear la #arilla antes de ser usada nue#amente.
d5 De7ar !ue se absorba el inculo en las placas y despus in#ertirlas.
e5 ?ncubar a >/E y re#isar a las >9 y 9/ *rs -proteol$ticos y amilil$ticos5 y a los 4 y 0 d$as
-mineralizadores y solubilizadores de (5.
(resencia de microorganismos fi7adores de nitrgeno, amonificantes, desnitrificantes, reductores y
o&idadores del azufre.
a5 <omar una gota de la muestra ., con una pipeta (asteur y colocarla en el centro de la placa de
Agar 'ipman.
b5 %&tender con #arilla de #idrio en `'a estril.
c5 De7ar !ue se absorba el inculo y despus in#ertirla.
d5 olocar una gota de la muestra . en cada uno de los tubos !ue contienen el medio para
amonificantes, desnitrificantes, o&idantes del azufre y reductores de sulfatos.
e5 %n los tubos con medio para o&idantes, agregar en condiciones aspticas 0@ mg de flor de
azufre.
f5 %n los tubos con medio para reductores, agregar aspticamente limadura de *ierro.
g5 "epetir el procedimiento con la muestra >.
*5 ?ncubar a >/E y re#isar a los 4 y D d$as -fi7adores de , y desnitrificantes5 y de 4 a 9
semanas -o&idantes y reductores del azufre5.
OBSERVACIN ; ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD 'ISIOLGICA DE MICROORGANISMOS
PRESENTES EN LA COLUMNA
B sesin.
O15e!i2%<
?ntegrar los resultados de di#ersidad morfolgica, interacciones microbianas y acti#idad metablica
de algunos microorganismos presentes en la columna de Winogradsky
23
MATERIAL
(or e!uipo:
. microscopio
. frasco gotero con aceite de inmersin
. 7uego de colorantes de Gram.
(or los alumnos por mesa:
. marcador indeleble
9 portaob7etos
9 cubreob7etos
> mec*eros
> asas
. piseta
MJTODO

Degradacin de lactosa y manitol.

a5 =bser#ar el desarrollo en las placas con %M6 y M+A. omparar la abundancia y di#ersidad de
colonias.
b5 "ealizar una preparacin fi7a y teBida con Gram de al menos tres tipos de colonias de cada
medio.
c5 "egistrar los resultados en el cuadro D.
Determinacin de acti#idad proteol$tica, amilol$tica, mineralizadora y solubilizadora de (.
a5 =bser#ar el *alo de solubilizacin del sustrato en las placas con Agar lec*e descremada,
"amos allao con fsforo precipitado y con lecitina. omparar la abundancia y di#ersidad de
colonias.
b5 "ealizar una preparacin fi7a y teBida con Gram de al menos tres tipos de colonias de cada
medio.
c5 Agregar lugol a las placas con Agar almidn. =bser#ar la coloracin !ue se presenta a lo largo
de las estr$as.
d5 "egistrar los resultados en el cuadro D.
(resencia de microorganismos fi7adores de nitrgeno, amonificantes, desnitrificantes, reductores y
o&idadores del azufre.
a5 %&traer y obser#ar los cla#os o tornillos de fierro introducidos inicialmente en la columna.
b5 =bser#ar el desarrollo microbiano en las placas de Agar 'ipman:
i. omparar la abundancia y di#ersidad de colonias.
ii. "ealizar una preparacin fi7a y teBida con Gram de tres tipos de colonias.
c5 "ealizar una preparacin fi7a y teBida con Gram de cada uno de los tubos con medio para
amonificantes, desnitrificantes, o&idantes y reductores del azufre.
d5 Agregar > gotas del reacti#o de ,essler a los tubos con medio para amonificantes
e5 %n los tubos con el medio para desnitrificantes:
i. =bser#ar si *ay formacin de gas en campanas de Dur*am.
ii. Agregar > gotas de la solucin A y > gotas de la solucin 6 del reacti#o de
Griess
24
iii. =bser#ar la presencia o ausencia de coloracin rosada indicadora de la
presencia de nitritos en el medio de culti#o.
f5 on un papel indicador determinar el pA en los tubos !ue contienen el medio para o&idantes
de azufre o bien agregar unas gotas de 6al> al 0.@ \ y obser#ar la formacin de un
precipitado blanco.
g5 =bser#ar la formacin de un precipitado negro en los tubos !ue contienen el medio para
reductores de sulfatos.
*5 "egistrar los resultados en el cuadro D.
(roduccin de sustancias antimicrobianas.
a5 =bser#ar la formacin de *alos de in*ibicin alrededor los microorganismos de prueba.
b5 "egistrar los resultados en el cuadro /.
Dis4%si/in &e &ese/C%s
.. Herter los desec*os de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
>. +umergir los portaob7etos usados en una solucin sanitizante durante .@ minutos, la#ar con
detergente, en7uagarlos y colocarlos en un frasco con alco*ol al 30 \.
4. %sterilizar el material de #idrio -ca7as y tubos5 en los !ue realiz sus lecturas y posteriormente
la#ar.
9. +ellar con maskin tape las ca7as de (etri de plstico !ue contengan culti#os y colocar en el
contenedor ubicado en el laboratorio A.
5. Desec*ar la columna de Winogradsky. "eunir en una cubeta el lodo y agua y posteriormente
colocar en una 7ardinera.
REGISTRO DE RESULTADOS
CUADRO E. Di#ersidad metablica obser#ada en bacterias presentes en la columna de
Winogradsky.
Ti4% &e -i/"%%"?nis-%s L6=0i&% s04e"3i/i# Se&i-en!%
6acterias GU
6acterias G W
Anaerobios
(roteol$ticos
Amilol$ticos
Mineralizadores de (
+olubilizadores de (
25
Ti4% &e -i/"%%"?nis-%s L6=0i&% s04e"3i/i# Se&i-en!%
;i7adores de , de #ida libre
Amonificantes
Desnitrificantes
=&idantes del +
"eductores de +=9
R
UUU R Desarrollo abundante
UU R Desarrollo medio
U R Desarrollo escaso
2 R +in desarrollo
CUADRO G. Antagonismo obser#ado en bacterias presentes en la columna de Winogradsky.
Escherichia coli Pseudomonas sp! Micrococcus luteus Staphlococcus
aureus
'$!uido superficial
+edimento
?ndicar presencia o ausencia.
DISCUSIN E INTEGRACIN DE RESULTADOS.
omparar los resultados de los microorganismos obser#ados a diferentes tiempos y ni#eles de la
columna. Discutir con respecto a:
]+e obser#a el mismo tipo de microorganismos^ ]%n !u zonas y a !u tiempo de
incubacin se obser#a la mayor cantidad y di#ersidad de protozoos, algas, bacterias
grampositi#as y gramnegati#as^
]_u tipos de nutricin se identificaron^
]+e obser# la produccin de sustancias antimicrobianas -antagonismo5 entre los
microorganismos de prueba y los pro#enientes de la columna^
]_u caracter$sticas fisiolgicas se obser#aron en las diferentes zonas de la columna^
]_u re!uerimientos de o&$geno presentaron los microorganismos desarrollados^
26
on la informacin anterior, trazar una l$nea de tiempo en la !ue se relacionen las caracter$sticas
fisiolgicas detectadas con los tipos de nutricin y los re!uerimientos de o&$geno determinados con
la zona de la columna de la cual procede la muestra, el color desarrollado y el tiempo de incubacin.
ANE9O 1. GU:A PARA LA INTERPRETACIN DE LA DIVERSIDAD , SUCESIN MICROBIANA
EN UNA COLUMNA DE HINOGRADSK,
Despus de cuatro a seis semanas de la preparacin de la columna, se establecen tres tipos de
ambientes: el anaerobio, el microaerof$lico y el aerobio, en donde se desarrollan comunidades
bacterianas espec$ficas -;ig. 05, organizadas en tres diferentes zonas a lo largo de la columna:
.%n ne"1i/
+e localiza en el fondo de la columna en donde crecen dos tipos de organismos: los !ue fermentan la
materia orgnica y los !ue realizan la respiracin anaerobia, ambos descomponen la materia
orgnica y dan lugar a la formacin de cidos orgnicos, alco*oles y A>.
'a fermentacin es un proceso en el !ue los compuestos orgnicos son degradados de forma
incompleta -por e7emplo, las le#aduras fermentan los az8cares a alco*ol5. 'a respiracin anaerbica
es un proceso en el !ue los sustratos orgnicos son completamente degradados a =2, usando una
sustancia distinta del o&$geno como aceptor terminal de electrones -por e7emplo, nitratos o iones
sulfato5.
%l ni#el ms ba7o de esta zona se caracteriza por formar un ambiente con alta concentracin de A2S,
aparecen #arios grupos diferentes de bacterias: por e7emplo, dependiendo del tipo de barro utilizado,
encontramos bacterias del gnero Amoebacter, bacterias p8rpura del azufre portadoras de #es$culas
de gas, las cuales aparecen formando una banda de color rosado.
%n esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y utilizando
la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento como fuente
primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del gnero Clostridium. <odas las especies de
este gnero son anaerobias estrictas por!ue, aun!ue sus esporas pueden sobre#i#ir en condiciones
aerobias, las clulas #egetati#as mueren si estn e&puestas al o&$geno. (or eso no empiezan a
crecer *asta !ue ste desaparece del sedimento. %stas bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a
continuacin, fermenta la glucosa para obtener la energ$a !ue necesitan, produciendo una serie de
compuestos orgnicos simples -etanol, cido actico, cido succ$nico, etc.5 como productos finales de
esa fermentacin.
Fn poco por encima, las bacterias reductoras del azufre -representadas por "esulfo#ibrio$ se
#isualizan como una profunda capa negra. bstas pueden utilizar los subproductos de la fermentacin
para su respiracin anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente o&idadas de azufre como
el tiosulfato, generando grandes cantidades de A>+ en el proceso. %ste A>+ reaccionar con
cual!uier *ierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro ferroso, !ue da color negro. %s por
esto !ue los sedimentos acuticos son frecuentemente negros.
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,o todo el A>+ es utilizado, ciertas cantidades se difunden *acia arriba a lo largo de la columna de
agua y son utilizados por otros organismos !ue crecen en las zonas superiores.
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%ste crecimiento se #isualiza ba7o la forma de dos bandas estrec*as, brillantemente coloreadas,
inmediatamente por encima del sedimento: en una primera fran7a, las bacterias #erdes del azufre
-como Chlorobium5 procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una fran7a #erdosa. %n otras zonas
cercanas, bacterias como %allionella procesan el Aierro formando una capa negra !ue se forma
7ustamente por deba7o de la anterior. Fn poco ms arriba, algo ms ale7adas por tanto de las altas
concentraciones de sulf*$drico se desarrolla una zona de bacterias p8rpuras del azufre, como
Chromatium, caracterizada por su color ro7o2p8rpura. %stas bacterias del azufre, #erdes y p8rpuras,
obtienen energ$a de las reacciones luminosas y producen sus materiales celulares a partir de =>. %n
gran medida, de manera muy similar a como lo *acen las plantas aun!ue, sin embargo, *ay una
diferencia esencial: no producen o&$geno durante la fotos$ntesis por!ue no utilizan A>= como
elemento reductor sino A>+.
Fn poco por encima de esta zona nos encontramos una banda de bacterias p8rpuras no del azufre,
microorganismos anaerobios fotoorgantrofos !ue slo pueden realizar la fotos$ntesis en presencia
de una fuente de carbono orgnico, por e7emplo Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, !ue ad!uiere
un color ro7o2anaran7ado. +u mayor o menor abundancia depender de la cantidad de sulf*$drico !ue
se *aya producido y de la cantidad !ue, no *aya sido utilizada por otros organismos, difunda *acia
arriba, ya !ue su presencia in*ibe a estas bacterias.
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'a parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de
diferentes tipos. +on organismos aerobios !ue se encuentran generalmente en los *bitats acuticos
ricos en materia orgnica -estan!ues poco profundos, arroyos contaminados, etc.5. +uelen ser
flagelados o ciliados -protozoarios5, lo !ue les permite mo#erse y establecerse en nue#as reas.
(uede desarrollarse tambin microorganismos fototrficos diferentes procedentes directamente del
agua o del barro utilizado originalmente en el monta7e de la columna. 'a superficie del barro puede
presentar en esta zona un ligero color castaBo. %sta es la parte de la columna ms rica en o&$geno y
ms pobre en azufre.
+in embargo, tambin a!u$ llegarn por difusin, procedentes del barro de zonas inferiores, ciertas
cantidades de A2S !ue ser o&idado a sulfato por bacterias !ue o&idan azufre -como Beggiatoa y
Thiobacillus5. %stas bacterias obtienen energ$a o&idando el A2S a azufre elemental y sintetizan su
propia materia orgnica a partir de =2. (or esto se les llama !uimioauttrofas.
%n las zonas superiores pueden crecer tambin cianobacterias fotosintticas, lo !ue se #isualizar$a
cmo un tapete de csped de color #erde. %stas bacterias se caracterizan por ser las 8nicas !ue
realizan una fotos$ntesis similar a la de las plantas. De *ec*o, *ay poderosas e#idencias de !ue los
cloroplastos de las plantas proceden de cianobacterias ancestrales !ue se establecieron como
simbiontes dentro de clulas de alg8n eucariota primiti#o. De forma paralela *ay tambin e#idencias
igualmente fuertes de !ue las mitocondrias de los eucariotas actuales se deri#aron de bacterias
p8rpuras ancestrales por un similar sistema de endosimbiosis.

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'i?0" A. Gu$a para la obser#acin e interpretacin de la columna de Winogradsky.
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