A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido
pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem. A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados em laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizao de amostras de bactrias. A tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a infeces so prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura estejam disponveis. possvel a anlise de vrios esfregaos por lmina, o que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentao. Gram-Positiva: membrana citoplasmtica: fosfolipdeos protenas parede celular: peptidoglicano - polmero poroso e insolvel, em grande quantidade nestas bactrias (50% ou mais do peso seco da clula), tornando a parede bem espessa cido teicico - polmero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente pode ajudar no transporte de ons + para dentro e fora da clula; e no armazenamento de fsforo. Se encontram ligados ao peptidoglicano ou membrana citoplasmtica polissacardeos - ligados ao peptidoglicano
Gram-Negativa: membrana citoplasmtica: fosfolipdeos protenas parede celular - localizada no espao periplasmtico, ou seja, entre as membranas citoplasmtica e externa. peptidoglicano - representa 10% do peso seco da clula lipoprotenas membrana externa - presente apenas nestas bactrias, serve para distingui-las. lipopolissacardeos - tpicos destas bactrias, ocorrem somente na membembrana externa; formados de lpideos, cerne de polissacardeo e antgenos O. Podem atuar como um veneno (LPS ou endotoxina) trmeros de porina Aula Prtica de Microbiologia Colorao de Gram A colorao de Gram usada para classificar as bactrias em relao forma, tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial. A colorao de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prtica bacteriolgica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciao dos microrganismos. O mtodo de Gram se baseia no fato de que quando certas bactrias so coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela soluo de iodoiodetada (lugol),forma-se um composto de colorao escura entre o iodo e o corante, que fortemente retido por um grupo de bactrias e no pode ser removido pelo descoramento subseqente com o lcool gram positiva. Outras bactrias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo lcool. Ento, as bactrias gram negativas aparecero coradas em vermelho, ao passo que as gram positivas aparecero coradas em roxo .O mecanismo da colorao de Gram est baseado na diferena de permeabilidade da parede celular. As bactrias gram negativas apresentam uma elevada concentrao de lipdeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactrias gram positivas. Sugere-se que quando h o tratamento com lcool, os lipdeos das bactrias gram negativas so retirados da parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactrias percam o primeiro corante (cristal violeta). As bactrias gram positivas, por possurem uma menor concentrao de lipdeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo lcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante. TCNICA DA COLORAO DE GRAM 1. Fazer um esfregao do material desejado em uma lmina; 2.Fixar o material , com o fogo, na lmina; 3.Cobrir o esfregao com cristal violeta (1 corante) por 1 minuto; 4.Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto; 5.Lavar em gua corrente de baixa presso; 6.Descorar com lcool-cetona por 1 5 segundos; 7.Lavar em gua corrente de baixa presso; 8.Cobrir o esfregao com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2 corante) por 30 segundos; 9.Lavar em gua corrente de baixa presso; 10.Deixar secar espontaneamente; 11.Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
A tcnica de colorao de Gram uma tcnica de colorao diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactrias por microscopia ptica. Foi descoberta pelo fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve com a colorao realizada uma melhor visualizao das bactrias em amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactrias coravam com este mtodo o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importncia ao seu mtodo de colorao. Atualmente, esta tcnica fundamental para a taxonomia e identificao das bactrias, sendo utilizada como tcnica de rotina em laboratrios de bacteriologia.
A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas seguinte sequncia:
Corante primrio violeta de cristal: cora o citoplasma de prpura, independentemente do tipo de clula. Mordente soluo de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Agente descolorante lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico. Contrastante safranina ou fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho.
O que se verifica, quando se observam as diferentes bactrias sujeitas a esta colorao ao microscpio, que estas tm um comportamento diferente face colorao de Gram, o que permite classific-las em:
Bactrias Gram- positivo (apresentam cor prpura)
Bactrias Gram- negativo (apresentam cor vermelha)
Estudos de microscopia electrnica e anlises bioqumicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana a estrutura responsvel pelo diferente comportamento das bactrias colorao de Gram.
As bactrias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homognea, geralmente no estratificada e predominantemente constituda por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel que se forma por ao do mordente, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (prpura).
As bactrias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituda por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contm peptidoglicano e que mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolvel, que se forma por ao do mordente, removido (camada de peptidoglicano mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as clulas ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.
Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptidoglicano, a responsvel pelo diferente comportamento das bactrias face colorao de Gram.
O peptidoglicano um heteropolmero rgido e insolvel na gua, constitudo por cadeias lineares de dois acares aminados NAG (cido n-acetilglucosamina) e NAM (cido n- acetilmurmico) ligados entre si por ligaes glicosdicas. As cadeias lineares ligam-se entre si atravs de cadeias de quatro aminocidos
A tcnica de gran ou a colorao de gran uma colorao de preparaes histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composio qumica e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, so classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (vermelho). Tal mtodo se deve ao mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853- 1938). Geralmente as bactrias de "gram negativo" so mais patognicas, possuindo ainda lipopolissacardeos na sua membrana exterior, que agravam a infeco. Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa. Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos. As caractersticas estruturais da parede bacteriana esto na base da tcnica de Gram que funciona da seguinte forma.
O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactria assim como o mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante- iodo, insolvel em gua, que vai corar o protoplasma e a parede celular.
A lavagem com alcool 99,5 GL dissolve o complexo corante-iodo, e se a parede celular for permevel a este, arrasta-o para fora da clula. As bactrias capazes de preservar a colorao roxa do 1 corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bactrias que, aps a diferenciao com lcool-acetona, so incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluda que se fixa apenas nas bactrias Gram-negativas. Resumindo, as bactrias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta tcnica de colorao permite ento a distino entre bactrias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruda ou danificada (ex. envelhecimento celular ou ao de lisozimas).
Mtodos de Respirao Quanto respirao, as bactrias podem ser aerbias ou anaerbias. Chamam-se aerbias as que fazem uso do oxignio. As anaerbias vivem na ausncia desse gs, e so encontradas principalmente no sedimento (fundo) de ambientes aquticos. ou tambm na ferrugem (por exemplo a bactria que vive l, morre ao tocar no oxignio por isso elas vivem em constante momento com a ferrugem, que libera oxignio) A respirao aerbica um conjunto de reaes bioqumicas em que o oxignio um aceptor final de eltrons e ao longo do qual a energia de molculas orgnicas , em parte, transferida para molculas de ATP. Organelas responsveis: mitocndrias em paralelo com o sistema golgiense. Os tecidos vivos libertam dixido de carbono gasoso que resulta da reao de descarboxilao de metabolitos por ao de enzimas especificas - as descarboxilases. Simultaneamente, ocorrem reaes de oxidao por desidrogenao. As desidrogenases catalisam a desidrogenao do substrato que fica assim oxidado. A presena desse hidrognio pode ser detectada experimentalmente, utilizando uma substncia que facilmente se combine com ele, como o azul-de-metileno. O azul-de-metileno pode encontrar-se sob duas formas: oxidado (cor azul) e reduzido (incolor). Durante a respirao os compostos orgnicos, nomeadamente a glicose, so oxidados, sendo o hidrognio recebido por um aceptor, que neste processo experimental ir ser o azul-de-metileno. Nas condies naturais da clula viva, o oxignio desempenha a funo do azul-de-metileno na experincia, ou seja, o aceptor do hidrognio, formando com ele gua. Essas clulas podem ser encontradas nas costas de um rinoceronte velho. Estes fenmenos so realizados ao longo de cadeias de reaes complexas, controladas por enzimas, havendo simultaneamente um aproveitamento progressivo de energia que vai sendo transferida. Respirao anaerbia ou anaerobiose o processo metablico celular condicionado em ambientes caracterizados pela ausncia de gs oxignio (O2). Muitas ... Respirao celular o processo de converso das ligaes qumicas de molculas ricas em energia que podero ser usadas nos processos vitais. Ela pode ser de dois tipos,respirao anaerbia (sem utilizao de oxignio) e respirao aerbia (com utilizao de oxignio). Eis a sua equao: C6H12O6 + 6O2 ---> ao das enzimas ---> 6CO2 + 6H20 + energia A respirao celular o processo de obteno de energia mais utilizado pelos seres vivos. Na respirao, ocorre a liberao de dixido de carbono, energia e gua e o consumo de oxignio e glicose, ou outra substncia orgnica, tal como lipdios. A organela responsvel por essa respirao a mitocndria. Do ponto de vista da fisiologia, o processo pelo qual um organismo vivo troca oxignio e dixido de carbono com o seu meio ambiente chamado de ventilao, respirao ocorre apenas na clula, operao executada pela mitocondria. Do ponto de vista da bioqumica, respirao celular o processo de converso das ligaes qumicas de molculas ricas em energia que possa ser usada nos processos vitais. A respirao celular processa-se nas seguintes etapas: Gliclise Ciclo de Krebs Cadeia respiratria Fosforilao oxidativa O processo bsico da respirao celular a quebra da glicose ou Gliclise, que se pode expressar pela seguinte equao qumica: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energia Nutrientes (energia qumica) + O2 CO2 + H2O + Energia(alguma que se perde sob a forma de calor e outra parte armazena-se sob a forma de ATP) Este artigo centra-se nos fenmenos da respirao celular, que se processa segundo duas sequncias bsicas: Gliclise(ocorrida no citosol) e Oxidao do piruvato(ocorrida na matriz mitocondrial) atravs de um de dois processos: Respirao aerbia ou Respirao anaerbia 1 Oxidao do piruvato 1.1 Respirao aerbia 1.2 Respirao anaerbia 2 Ver tambm Oxidao do piruvato De acordo com o tipo de metabolismo, existem duas sequncias possveis para a oxidao do piruvato proveniente da gliclise: 1. Neste primeiro processo, a oxidao do pruvato ocorre em uma respirao aerbia, produzindo em seguida Acetilcoenzima A, iniciando assim o Ciclo de Krebs, como demonstrado abaixo: Piruvato --> Acetil-Coa Nesta etapa ocorre a entrada de NAD e CoA-SH. O piruvato gerado na gliclise sofre desidrogenao e descarboxilao catalisado pelo complexo piruvato- desidrogenase, durante essas reaes adicionada a coenzima A, desta forma a partir de cada piruvato produz-se um acetil-CoA, iniciando logo em seguida o Ciclo de Krebs Durante a gliclise pode ocorrer a falta de O2 gerando outras reaes: 2.Nesta etapa a oxidao do piruvato ocorre em uma reao anaerbia Oxidao Incompleta da Glicose: Glicose --> Piruvato --> cido lctico uo[necessrio esclarecer] no podem ser oxidados. Assim fica faltando NAD e FAD para as reaes de desidrogenao. Com isso, o ciclo de Krebs no pode ocorrer ficando totalmente bloqueado, na falta de O2. Se houvesse uma forma de repor NAD e FAD sem o envolvimento da cadeia respiratria o ciclo poderia continuar ocorrendo. Na oxidao da glicose na ausncia de O2, o NADH produzido no ir para a cadeia respiratria; da mesma forma, o piruvato no dara origem ao acetil-CoA. Assim fica acumulado NADH e piruvato. Para que a gliclise mantenha-se, o NADH acumulado transfere seus eltrons e P+ para o piruvato, originando cido lctico e renegerando o NAD. Isto representa uma via alternativa de oxidao do NADH. Na oxidao incompleta o rendimento de ATP cai para apenas dois. Respirao aerbica A respirao aerbia requer oxignio. Na gliclise, formado o piruvato (tambm chamado de cido pirvico) bem como 2 ATP. Cada piruvato que entra na mitocndria e oxidado a um composto com 2 carbonos (acetato) que depois combinado com a Coenzima-A, com a produo de NADH e libertao de CO2. De seguida, inicia-se o Ciclo de Krebs. Neste processo, o grupo acetil combinado com compostos com 4 carbonos formando o citrato (6C). Por cada ciclo que ocorre liberta-se 2CO2, NADH e FADH2. No ciclo de Krebs obtm-se 2 ATPs. Numa ltima fase - cadeia transportadora de eltrons (ou fosforilao oxidativa) os eltrons removidos da glicose so transportados ao longo de uma cadeia transportadora,criando um gradiente protnico que permite a fosforilao do ADP. O aceptor final de eltrons o O2, que, depois de se combinar com os eltrons e o hidrognio, forma gua. Nesta fase da respirao aerbia a clula ganha 26 molculas de ATP. Isso faz um total ganho de 32 ATP durante a respirao celular em que intervm o oxignio. Respirao anaerbia A respirao anaerbia envolve um receptor de eltrons diferente do oxignio e existem vrios tipos de bactrias capazes de usar uma grande variedade de compostos como receptores de eltrons na respirao: compostos nitrogenados, tais como nitratos e nitritos, compostos de enxofre, tais como sulfatos, sulfitos, dixido de enxofre e mesmo enxofre elementar, dixido de carbono, compostos de ferro, de mangans, de cobalto e at de urnio. No entanto, para todos estes , a respirao anaerbia s ocorre em ambientes onde o oxignio escasso, como nos sedimentos marinhos e lacustres ou prximo de nascentes hidrotermais submarinas. Uma das sequncias alternativas respirao anaerbia a fermentao, um processo em que o piruvato apenas parcialmente oxidado, no se segue o ciclo de Krebs e no h produo de ATP numa cadeia de transporte de elctrons. No entanto, a fermentao til paraa clula porque regenera o dinucletido de nicotinamida e adenina (NAD), que consumido durante a gliclise. Os diferentes tipos da fermentao produzem vrios compostos diferentes, como o etanol (o lcool das bebidas alcolicas, produzido por vrios tipos de leveduras e bactrias) ou o cido lctico do iogurte. Outras molculas, como NO2, SO2 so os aceptores finais na cadeia de transporte de eltrons.
Qdo um organismo apresenta respirao facultativa significa que ele pode fazer tanto respirao aerbia (c/ participao de O2), qto anaerbia. Caso contrrio (s possa fazer um dos dois tipos) diz-se que ele anaerbio restrito, ou aerbio restrito. Um exemplo de organismo anaerbio facultativo a levedura, um fungo cuja fermentao produz vinho, cerveja, pes, bolos, etc... Ele faz fermentao alcolica na ausncia de O2 e respirao aerbia na presena de O2. Um exemplo de organismo anaerbio restrito, a bactria causadora do ttano (clostridium tetani), que sobrevive em presena de O2. Um exemplo de organismo anaerbico restrito, a bactria causadora do ttano (clostritium tetani), que sobrevive em presena de 02. Membrana externa: Responsvel pela preveno da perda de protenas periplasmticas e evitar o acesso de enzimas hidrolticas e de certos antibiticos ao peptidioglicano. Significado de periplasma . O que periplasma: Espao fluido entre a membrana plasmtica e a membrana externa de bactrias gram-negativas. O compartimento periplasmtico oespao que rodeia o citoplasma em algumas clulas procariotas , tais como bactrias em bactrias gram-negativas .Aparece entre a membrana plasmtica , no interior, e a membrana exterior do exterior gram- negativa. Desempenha um papel importante no metabolismo da energia, com base no fornecimento de processos activos diferenas na composio qumica, de concentrao e carga osmtica entre este compartimento e o citoplasma. O espao inter de mitocndrias e espao periplastidial de plastdeos , organelas que evoluram a partir de endossimbiose , so homlogos do espao periplasmtico. Membrana citoplsmtica serve para proteger a clula e permite a troca de substncias do interior para o exterior da celula e vice versa. E o ncleo a parte que controla o metabolismo da clula, e contem sua identidade ou seja o material gentico!
Protenas sobiomolculas de grande dimenso, ou macromolculas, constitudas por uma ou mais cadeias de resduos de aminocidos. As protenas desempenham um vasto conjunto de funes no organismo, entre as quais a catlise de reaes metablicas, a replicao de ADN, a resposta a estmulos e o transporte de molculas de um local para outro. As protenas diferem entre si fundamentalmente na sua sequncia de aminocidos, a qual determinada pela sua sequncia gentica, e que geralmente provoca O enovelamento da protena numa estrutura tridimensional especfica que determina a sua atividade. lipdeos oulpides so biomolculas compostas por carbono (C), hidrognio (H) e oxignio (O), fisicamente caracterizadas por serem insolveis em gua, e solveis em solventes orgnicos,1 como olcool, benzina,ter, clorofrmio e acetona. A famlia de compostos designados por lipdios muito vasta. Cada grama de lipdio armazena 9 quilocalorias de energia, enquanto cada grama de glicdio ou protena armazena somente 4 quilocalorias.1 Neste captulo estudaremos 3 porinas. Porinas so protenas de grande peso molecular encontradas tipicamente em membranas externas de bactrias. Estas membranas, compostas de lipdeos e peptideoglicanos, so bastante impermeveis. Para permitir a entrada de nutrientes hidroflicos, as membranas apresentam as porinas. Polissacardeos so molculas grandes, formadas de centenas ou milhares de motiossacardios. Exemplos de polissacardeos so amido, glicognio, celulose, quitina, entre outros. Os fosfolpideos so steres do glicerofosfato - um derivado fosfrico do glicerol. O fosfato um dister fosfrico, e o grupo polar do fosfolipdio. A um dos ... carboidratos e protenas de silagens de milho, sorgo e girassol, com a finalidade .... e glutelinas), B3 a protena associada parede celular e de degradao ...
As paredes celulares das bactrias Gram-positivas so espessas, formadas por cerca de vinte camadas de peptidoglicano (20 a 40 nm de espessura) que responde por 50% ou mais do peso seco da clula (Figura 1). Apesar disso, essas paredes permitem a difuso de muitas molculas.
Embebidas na matriz de peptidoglicano dessas bactrias encontram-se pequenas quantidades de cidos teicicos. cido teicico um termo funcional para uma ampla variedade de diferentes polmeros contendo acares, fosfato e glicerol. Existem duas classes de cidos teicicos: o cido lipoteicico, embebido no peptidoglicano e ligado membrana plasmtica e o cido teicico associado somente ao peptidoglicano.
Os cidos teicicos conferem carga negativa superfcie exterior da clula podendo ajudar no transporte de ons positivos para dentro e fora da clula. Essas substncias em conjunto com protenas presentes na superfcie da parede celular so responsveis pela determinao antignica das bactrias Gram-positivas por diferirem entre distintas cido lipoteicico de bactrias de cido ltico e seu uso para modular respostas imunes mediadas por bactrias gram-negativas, potenciais bactrias gram-positivas patognicas "cido lipoteicico de bactrias de cido ltico e seu uso para modular respostas imunes mediadas por bactrias gram-negativas, potenciais bactrias gram positivas patognicas". A inveno refere-se a... (ver O peptidoglicano, por vezes denominadomurena, umheteropolissacardeo ligado a pptidos presente na parede celular de procariontes1 . formado por dois tipos de acares (o cido N-acetilmurmico e a N- acetilglucosamina) e algunsaminocidos. O peptidoglicano a estrutura que confere rigidez parede celular de bactrias, determina a forma da bactria e protege da lise osmtica, quando em meio hipotnico.