Université Abou Bekr Belkaid Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

Détermination des paramètres cinétiques Km et Vm et détermination de l’activité catalytique et de

l’activité spécifique de l’extrait d’enzyme peroxydase.

1/ introduction :

C’est en 1830 que fut mise en évidence pour la première fois l’action d’une enzyme et elle fut isolée deux ans plus tard sous le
nom de diastase car elle séparait les dextrines et le maltose de l’amidon (du grec diastasis, séparation).en 1835, Berzelius eut
l’intuition que ce type de réaction, due à ce qu’il appelait une « force catalytique » était beaucoup plus répandu qu’on ne le
croyait alors. Le terme d’enzyme fut forgé par W.Kùhne en 1878 à partir des termes grecs, zumé (levain) et en (dedans), pour
remplacer ceux de ferment et de diastase jugés trop restrictifs. Les travaux de Willstaetter, de Sumner et de Northrop
conduisirent aux premières cristallisations d’enzymes après que leur nature protéique eut été démontrée.

2/peroxydase du Raifort (Radis) :

(Donneur d’hydrogéne-péroxyde oxydo-réductase).

C’est probablement l’enzyme que présente le meilleur rapport entre la facilité de préparation et de conservation et la variété
des applications pédagogiques possibles.

2-1 Préparation et purification :

On peut préparer la peroxydase soit à partir d’un morceau de racine de Raifort (Radis Noir) soit à partir d’un radis.
 Couper 2 Radis en petits morceaux après les avoir épluchés. Placer les morceaux dans un mixer (mortier) avec 50ml
d’eau distillée et broyer. Filtrer puis centrifuger. On obtient un extrait brut extrêmement efficace qui peut être dilué
(1/5) avant utilisation.
 Il est possible de réaliser une extraction plus soignée en vue d’une purification éventuelle. Dans ce cas, placer le pot
du mixer (mortier) au congélateur ainsi que l’eau distillée, un entonnoir, un erlenmeyer, un flacon d’acétone et les
morceaux de Radis épluchés. Préparer de la glace pilée dans un cristallisoir.
 Après 15mn au congélateur, sortir les Radis et les couper en petits morceaux avec de l’eau distillée glacée (100ml
pour 2 racines de Radis).filtrer, si possible sur filtre Bûchner, et recueillir le filtrat dans l’erlenmeyer sorti du
congélateur et disposé dans la glace pilée. Centrifuger.
 Verser de l’acétone sorti du congélateur dans le filtrat, volume à volume et laisser à température ambiante pendant
quelques heures : il se forme un précipité.
 Filtrer pour éliminer l’acétone et conserver le résidu sur le filtre. Déployer le filtre portant le précipité dans un
cristallisoir et bien le laver avec de l’eau distillée : la solution obtenue est la peroxydase partiellement purifiée.

2-2 Activité de la peroxydase :

Les peroxydase (il existe un grand nombre d’isoenzymes) sont des oxydo-réductases qui catalysent la décomposition du
peroxyde d’hydrogène en eau selon la réaction :

H2O2 + RH2 2H2O +R

L’enzyme est spécifique du peroxyde comme accepteur d’hydrogène mais tolère de très nombreux substrats RH2 comme
donneur d’hydrogène. Ces substrats sont des dérivés phénolique comme le méthoxyphénol ("gaiacol"), la dianisidine, la
diaminobenzidine( attention cancérigène) le 4-hydroxydiphényl et la 1,2-phénylène diamine (les deux donneur les plus actifs)
etc. Ils changent de couleur lorsqu’ils sont oxydés par l’enzyme. Cette propriété rend possible l’étude de l’activité enzymatique
par photocolorimétrie.

------------- Réduction-----------

H2O2 + RH2 + 2H2O + R

Peroxyde gaiacol gaiacoquinone
(Incolore) (Brun rouge)
----- Oxydation--------

2-3Méthodes de détermination d’une vitesse de réaction :

Deux techniques différentes peuvent être utilisées :
*une technique par points (ou méthode discrète) la réaction est arrêtée à différents temps en inactivant l’enzyme.
*une technique en continu (cas du TP), quand le produit formé ou le substrat disparu présente des caractéristiques
d’absorption particulières ; la vitesse initiale est alors déterminé à partir de la pente de la partie linéaire de la courbe obtenue.

2-4Condition de mesure d’une vitesse :

Pour pouvoir mesurer la vitesse initiale avec une bonne approximation il faut se trouver dans la zone où la vitesse est
constante pendant un temps suffisamment long (2à3min), ce que l’on peut aisément vérifier en enregistrant en continu
l’apparition du produit formé (gaiacoquinone).

3/manipulation :

3-1détermination des vitesses initiales de l’extrait enzymatique.

a- condition de la réaction :

Préparer une gamme de 7 tubes contenant les différentes concentrations en peroxyde les autres solutions
étant constantes.

 Vt =7ml (volume total)

 Température ambiante
 PH =6.2 (tampon phosphate 1/15M)
 Substrat sulfogaiacolate de potassium à 2g/l.
 Suspension d’enzyme grossièrement purifié dilué au 1/5eau distillée) : Venz= 1ml.
 Substrat peroxyde (eau oxygénée du pharmacien) dilué :
H2O2 à 10 volumes diluées au 1/5, 1/150, 1/80, 1/100, 1/125, 1/200, 1/250
Sachant que la solution de peroxyde au 1/250 représente une concentration de 3.5 mmol/l.

4/mise en œuvre pratique :

Le peroxyde à 10 volumes est utilisé comme solution stock à partir de laquelle seront faites les différentes dilutions permettant
d’obtenir des concentrations moindres.
Placer dans les tubes à essais 2ml de peroxyde, 2ml de tampon phosphate PH 6.2 et 2ml de sulfogaiacolate de potassium pour
le réglage du zéro d’absorption. Au temps t°, la réaction est déclenchée immédiatement après l’injection de 1ml de l’extrait
enzymatique. La même opération est répétée pour les diverses concentrations en peroxyde. Noter les absorbances au temps,
20,40, 60, 90, 120,150 et 180 secondes.

5/expression des résultats :

 Tracer les courbes DO=f (t), pour chaque concentration en peroxyde. Calculer les vitesses initiales correspondantes.
 Reporter sur un même graphe l’ensemble des valeurs des différentes vitesses initiales. Déterminer les paramètres
cinétiques Km et Vmax de l’extrait enzymatique (en µmol/min/l)
 Calculer en utilisant le calcul par régression linéaire, les paramètres Km et Vm. (Logiciel Regressi, disponible au
niveau de la salle Internet, du département.).
 Déterminer l’activité catalytique de l’extrait d’enzyme en UI/l.
 Déterminer l’activité spécifique de l’extrait enzymatique en UI/mg de matière végétale et en UI/ml.
 Calculer le coefficient d’absorption molaire.
Façon de calculer ; tracer la courbe A=f (conc.peroxyde en µmol).
ε =pente Vf/l (Vf : volume final), (l: trajet optique)
 Discuter les résultats et conclure.